鄧方圓，韓夢(mèng)雨，鄧婷婷，金 明

0引言

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組以視桿和視錐感光細(xì)胞退化及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞變性為特征的遺傳性視網(wǎng)膜疾病[1]。RP首發(fā)癥狀多為夜盲，隨后是進(jìn)行性視野喪失及視力下降等。眼底退行性表現(xiàn)通常包括視網(wǎng)膜骨細(xì)胞樣色素沉著、視網(wǎng)膜血管變細(xì)及視盤蠟黃三聯(lián)征。非綜合征型視網(wǎng)膜色素變性15%～25%為常染色體顯性遺傳RP(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)，5%～20%為常染色體隱性遺傳RP(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)，5%～15%為X連鎖遺傳RP(X-linked retinitis pigmentosa，XLRP)[2]。

RP發(fā)病、病情嚴(yán)重程度及進(jìn)展與基因和遺傳方式有關(guān)，受環(huán)境影響。基因治療使用病毒或非病毒載體轉(zhuǎn)移治療性基因，對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，在基因水平上糾正遺傳缺陷。視網(wǎng)膜為基因治療提供了以下條件：(1)眼內(nèi)結(jié)構(gòu)高度分區(qū)，允許基因傳遞載體集中傳遞，約100μL體積內(nèi)能夠傳遞高達(dá)每個(gè)載體1.0×1010到2.0×1010個(gè)拷貝數(shù)[3]；(2)血-眼屏障避免基因載體眼外擴(kuò)散，只轉(zhuǎn)染眼部特定靶細(xì)胞，且不易引發(fā)全身副作用；(3)視網(wǎng)膜細(xì)胞群體穩(wěn)定，非整合載體導(dǎo)入基因可持續(xù)表達(dá)。故而RP基因治療具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)及切實(shí)可行性。

1 RP基因治療載體

基因治療將外源性基因通過基因載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，并得以穩(wěn)定復(fù)制及表達(dá)。RP基因治療載體主要分為病毒載體與非病毒載體。腺病毒(adenovirus，AD)和腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是RP基因治療研究常用病毒載體[4]。AD轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性高且運(yùn)載量大。但AD某些血清型流行度高，部分患者攜帶中和性抗體，人體較高免疫原性限制AD基因治療應(yīng)用。AAV具有廣泛轉(zhuǎn)染性、較低免疫原性、較高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及細(xì)胞特異性，可有效靶向RPE和視桿、視錐感光細(xì)胞，是目前RP基因治療最常用遞送系統(tǒng)。利用基因工程技術(shù)修改AAV衣殼，使AAV更適合RP基因治療輸送。Carvalho等[5]在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物視網(wǎng)膜下注射Anc80L65-AAV變體，表現(xiàn)出高水平RPE和光感受器細(xì)胞靶向。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，已分離出幾種AAV衣殼，AAV2/1，AAV2/4和AAV2/6血清型有效轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞[6]。盡管具有較高轉(zhuǎn)染效率，但病毒載體免疫原性、致瘤性、致突變性不容忽視。非病毒載體可用較大基因片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞，且免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)較低，但缺乏使基因長(zhǎng)期表達(dá)能力。Gallego等[7]基于微環(huán)DNA技術(shù)，有效提高陽離子脂質(zhì)體在體外RPE細(xì)胞及大鼠視網(wǎng)膜基因轉(zhuǎn)染效率。具體可根據(jù)各載體特點(diǎn)，針對(duì)致病基因亞型及患者情況酌情選用。

RP基因載體注射途徑主要分為視網(wǎng)膜下注射和玻璃體腔內(nèi)注射。多數(shù)RP基因治療研究采用視網(wǎng)膜下注射載體，通過短暫視網(wǎng)膜脫離注入視網(wǎng)膜下空間以轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。玻璃體腔內(nèi)注射將基因載體注入玻璃體腔，避免視網(wǎng)膜脫離造成視網(wǎng)膜損傷。Davis等[8]證實(shí)玻璃體腔內(nèi)注射對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)或視神經(jīng)疾病有效。Reid等[9]注射重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體rAAV2/2[7m8]及rAAV2/2[QuadYF+TV]突變嵌合載體rAAV2/2[MAX]于小鼠玻璃體腔內(nèi)，光感受器轉(zhuǎn)染效率明顯高于單突變血清型。Khabou等[10]改造出玻璃體內(nèi)注射耐受性良好AAV2載體，但對(duì)非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物光感受器滲透主要或僅在中心凹。

目前RP基因治療研究多基于動(dòng)物模型，少數(shù)ARRP(PDE6B、MERTK、RLBP1等)和XLRP(RPGR等)基因型臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。ADRP雖尚無相關(guān)臨床試驗(yàn)報(bào)道，但ADRP最常見基因型RHO基因治療相關(guān)研究較為熱點(diǎn)?，F(xiàn)總結(jié)RP常見基因型基因治療相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)RP基因治療療效及安全性研究進(jìn)展予以綜述。

2視網(wǎng)膜色素變性基因治療

2.1 RHO 視紫紅質(zhì)基因(rhodopsin gene，RHO)編碼參與視覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的光敏蛋白，為ADRP最常見突變基因，約占ADRP的40%[11]。RHO突變型RP患者多于20歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀，平均每年視敏度(visual acuity，VA)下降1.6%、視野(visual field，VF)喪失2.6%，于50～70歲失明。RHO特征性眼底改變多局限于1～2個(gè)象限，且伴發(fā)黃斑囊樣水腫(cystoid macular edema，CME)，少數(shù)患者見廣泛眼底改變。RHO基因P23H突變?yōu)槭讉€(gè)確認(rèn)RP相關(guān)基因突變，Mitra等[12]將短干擾RNA(short interfering RNA，shRNA)和野生型RHO與納米顆粒一起輸送到敲入型RhoP23H/P23H小鼠模型中，小鼠視覺功能出現(xiàn)部分改善。然而相關(guān)研究結(jié)果對(duì)比并非十分明顯，或因RHO為活躍基因，在mRNA水平上干擾調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平具有挑戰(zhàn)，故而基因組編輯技術(shù)成為ADRP基因治療研究熱點(diǎn)。Bakondi等[13]于RhoS334突變小鼠視網(wǎng)膜下注射常間回文重復(fù)序列叢集及其相關(guān)蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)組件，小鼠視敏度增加53%，光感受器得以挽救。Latella等[14]將CRISPR/Cas9和針對(duì)RHO基因外顯子1的3’和5’區(qū)域向?qū)NA(guide RNA，gRNA)注射表達(dá)RHOP23H小鼠模型視網(wǎng)膜下，成功降低突變基因表達(dá)水平。Tsai等[15]于小鼠視網(wǎng)膜下注射AAV2/8載體系統(tǒng)傳遞CRISPR/Cas9系統(tǒng)和外源RHO基因，3mo后聯(lián)合消融置換基因治療小鼠外核層(outer nuclera layer，ONL)厚度比單純基因置換治療小鼠ONL厚度增加約17%～36%，且視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)a波和b波振幅更大。Cideciyan等[16]于RHOT4R/+犬視網(wǎng)膜下注射AAV-shRNA820-RHO820，13、17、27、37wk治療區(qū)域ERG振幅a波、b波均較未治療區(qū)域更大，形成顯著對(duì)照。CRISPR/Cas9基因編輯可糾正常見RHO突變體(如P23H)，然而RHO基因有150多個(gè)突變體，針對(duì)所有突變形式的基因敲除與替換相結(jié)合或?yàn)橛行Н煼?。RHO相關(guān)RP基因治療于動(dòng)物模型療效顯著，但ADRP暫無基因治療臨床試驗(yàn)報(bào)道，于RP患者有效性與安全性待確認(rèn)。

2.2 PDE6B 視桿細(xì)胞環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)β亞基由PDE6B基因編碼，可水解cGMP形成5’-GMP，是視桿細(xì)胞光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活關(guān)鍵酶。視桿細(xì)胞為主要受累細(xì)胞，PDE6B基因突變使感光細(xì)胞內(nèi)cGMP增多，cGMP門控陽離子通道持續(xù)開放，陽離子高濃度毒性致使感光細(xì)胞壞死。PDE6B突變導(dǎo)致2%～5%的ARRP[2]，PDE6B突變型RP患者較早出現(xiàn)夜盲[17]，多于10歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀，主要病情變化為周邊視野喪失，于高齡(80歲左右)出現(xiàn)CME、后囊下白內(nèi)障(posterior subcapsular cataracts，PSC)及眼底色素沉著。CRISPR/Cas9技術(shù)利用單向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)指導(dǎo)Cas9于靶基因座處形成DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSB)，斷裂可非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源定向修復(fù)(homology-directed repair，HDR)。已被廣泛應(yīng)用的NHEJ技術(shù)基因編輯錯(cuò)誤率相對(duì)高；HDR效率相對(duì)低且依賴細(xì)胞分裂，但為生殖細(xì)胞和增殖細(xì)胞基因編輯高保真途徑。Cai等[18]在Cas9介導(dǎo)基因組編輯中添加靶向sgRNA的細(xì)菌重組酶A(recombinase A，RecA)蛋白，靶向PDE6B基因座外顯子7，將終止密碼子UAA更改為UAC，發(fā)現(xiàn)Cas9/RecA組小鼠存活視桿細(xì)胞數(shù)超過Cas9組5倍，Cas9/RecA組小鼠視錐細(xì)胞數(shù)增加超過Cas9組4倍，成功糾正點(diǎn)突變，挽救感光細(xì)胞變性，改善小鼠視覺功能，且體內(nèi)外使用Cas9/RecA系統(tǒng)提高HDR效率均有效。但Pichard等[19]發(fā)現(xiàn)PDE6B-RP犬模型視網(wǎng)膜下基因治療只有視網(wǎng)膜發(fā)育早期可實(shí)現(xiàn)。PDE6B基因治療概念驗(yàn)證及安全性研究已在鼠及犬類動(dòng)物模型完成。目前一項(xiàng)PDE6B基因治療Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，尚未發(fā)表研究成果，而已發(fā)表相關(guān)基因治療結(jié)果對(duì)視桿細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)評(píng)估不足[20]。

2.3 MERTK MER原癌基因酪氨酸激酶(MER proto-oncogene，tyrosine kinase，MERTK)與RPE頂膜感光細(xì)胞外段吞噬關(guān)鍵受體相關(guān)。MERTK基因突變使RPE細(xì)胞吞噬能力降低，中斷視覺循環(huán)，使光感受器退化，導(dǎo)致約3%遺傳性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良(inherited retinal dystrophy，IRD)[21]。MERTK突變型RP患者于20歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀及視野缺損，10～20歲VA降至20/200及以下，40歲左右失明。眼底病變可見眼球震顫、牛樣眼黃斑病變及黃斑萎縮，未見視盤蒼白相關(guān)報(bào)道。Ghazi等[22]已經(jīng)成功在皇家外科醫(yī)師學(xué)院(Royal College of Surgeons，RCS)視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良模型大鼠視網(wǎng)膜下注射AD和AAV載體補(bǔ)充MERTK，延長(zhǎng)大鼠光感受器細(xì)胞壽命周數(shù)。Lavail等[23]在RCS大鼠視網(wǎng)膜下注射RPE特異性AAV2載體(AAV2-VMD2-hMERTK)，大鼠ERG反應(yīng)振幅隨之增加，并于視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞發(fā)現(xiàn)吞噬小體。Ghazi等[22]通過猴的臨床前研究證實(shí)了試驗(yàn)安全性，并啟動(dòng)一項(xiàng)Ⅰ期非盲劑量遞增試驗(yàn)，向6例MERTK相關(guān)RP晚期患者視網(wǎng)膜下注射rAAV2-VMD2-hMERTK，術(shù)后3例患者視力一過性的改善，無相關(guān)副作用及并發(fā)癥，但2例患者視力改善2a后消失。MERTK基因治療概念驗(yàn)證及安全性研究已在鼠及非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型完成，但Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果不甚理想，未來研究或需更關(guān)注基因治療疾病及入組患者選擇，并完善結(jié)局評(píng)價(jià)。即使已在動(dòng)物模型充分驗(yàn)證，人體臨床試驗(yàn)細(xì)節(jié)仍存在差異。

2.4 RLBP1 視黃醛結(jié)合蛋白1(retinaldehyde binding protein 1，RLBP1)基因于RPE和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Müller cell)表達(dá)11-順式視黃醛結(jié)合蛋白，為視覺周期重要部分。RLBP1突變導(dǎo)致常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性，患病率地域差異大，部分偏遠(yuǎn)地區(qū)相對(duì)高。RLBP1突變導(dǎo)致感光細(xì)胞退化和RPE萎縮，Lima等[24]檢測(cè)到無癥狀攜帶者也存在視覺周期缺陷。RLBP1突變型RP患者視野漸進(jìn)性喪失，最終<5°中心視野殘留，眼底可見白點(diǎn)狀視網(wǎng)膜變性(retinitis punctata albescens，RPA)，少見或不見骨細(xì)胞樣色素沉著。Choi等[25]于小鼠視網(wǎng)膜下注射AAV載體同時(shí)轉(zhuǎn)染RPE和Müller細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小鼠視桿細(xì)胞暗適應(yīng)速度改善。Maclachlan等[26]于小鼠模型證明在短啟動(dòng)子CPK850控制下AAV8載體攜帶RLBP1基因治療有效性，但于小鼠、大鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的臨床前安全性研究顯示眼內(nèi)炎癥和劑量依賴性視網(wǎng)膜變薄有所發(fā)生。RLBP1基因治療概念驗(yàn)證及安全性研究已在鼠及非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型完成，進(jìn)行中臨床試驗(yàn)尚未發(fā)表改善視桿和視錐細(xì)胞視覺周期缺陷并穩(wěn)定視網(wǎng)膜變性相關(guān)報(bào)道。

2.5 RPGR RPGR為視網(wǎng)膜色素變性三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶調(diào)節(jié)基因(GTPase regulator，RPGR)，為最常見引起XLRP基因，約占XLRP的70%～90%。RPGR突變型RP患者較早出現(xiàn)中心視野缺損，年均視野喪失4.7%～9%，多于45歲左右失明。眼底改變見黃斑萎縮，光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)顯示橢圓體帶年均縮窄175μm，ONL年均變薄250μm，早期即存在黃斑中心凹感光細(xì)胞外段厚度變薄，或?yàn)橐暳档妥畲笤騕27]。XLRP臨床基因增強(qiáng)治療試驗(yàn)主要集中在RPGR，尤其是占RPGR疾病70%以上的ORF15突變[20]。RPGR基因治療于動(dòng)物模型顯示一定療效，但RPGR固有序列不穩(wěn)定性導(dǎo)致病毒載體克隆過程或發(fā)生不可預(yù)測(cè)重組錯(cuò)誤。Fischer等[28]對(duì)RPGR基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其具有良好穩(wěn)定性和體外表達(dá)水平，來自密碼子優(yōu)化序列的RPGR蛋白中谷氨?；Ｊ脚c野生型沒有區(qū)別，即密碼子優(yōu)化不會(huì)顯著改變翻譯后修飾。經(jīng)AAV8載體遞送密碼子優(yōu)化RPGR改善Rpgr-/y和C57BL/6JRd9/Boc兩種小鼠模型表型，并在C57BL6/J野生型小鼠中表現(xiàn)出良好安全性。Song等[29]于野生型和突變小鼠進(jìn)行了安全性研究，并解決了ORF15不穩(wěn)定性問題。Hu等[30]將攜帶sgRNA和供體模板的AAV載體注射于6mo大Rpgr-/yCas9+/WT雄性小鼠視網(wǎng)膜下，注射后6mo和12mo于治療視網(wǎng)膜區(qū)域觀察到光感受器保留，與未治療視網(wǎng)膜區(qū)域形成顯著對(duì)照。Cehajic-Kapetanovic等[31]進(jìn)行首個(gè)人類RPGR-XLRP基因治療劑量遞增試驗(yàn)，將密碼子優(yōu)化的人RPGR(AAV8-coRPGR)注射于18例患者視網(wǎng)膜下，6mo隨訪結(jié)果顯示，全部18例患者治療眼微視野平均增加0.5dB且OCT示ONL厚度增加，與未治療眼形成顯著對(duì)照，未發(fā)現(xiàn)明顯劑量相關(guān)毒副作用或嚴(yán)重不良事件。RPGR基因治療概念驗(yàn)證及安全性研究已在鼠及犬類動(dòng)物模型完成，且首個(gè)臨床試驗(yàn)初步結(jié)果證實(shí)RPGR-XLRP基因治療有效性。另外兩項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，但尚未發(fā)表研究相關(guān)結(jié)果。

3小結(jié)

遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展使更多RP相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，也為基因治療提供可能。RP基因治療有效性于動(dòng)物模型試驗(yàn)證實(shí)，幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在開展且初步結(jié)果顯示有較好療效，為臨床帶來希望。然而在廣泛實(shí)施前，必須克服重要挑戰(zhàn)。比如基因載體改良、基因轉(zhuǎn)移靶向性控制、基因表達(dá)產(chǎn)物調(diào)控等，以及治療載體一次性給藥是否能提供長(zhǎng)期、持久臨床益處等劑量相關(guān)問題尚不清楚。此外，基因治療高度個(gè)性化治療形式的昂貴經(jīng)濟(jì)成本也是推廣重要阻礙。故而在正式應(yīng)用于臨床前，RP基因治療仍有前路需要探索。