盧思敏，袁 帥，吳移謀

1993年內(nèi)蓋夫西門(mén)坎菌(Simkanianegevensis, Sn)作為細(xì)胞培養(yǎng)污染物首次被發(fā)現(xiàn)。與衣原體一致，Sn亦為專(zhuān)性胞內(nèi)寄生菌，具有獨(dú)特的二相性發(fā)育周期。大量研究表明Sn與嬰兒細(xì)支氣管炎[1]、成人社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)[2]和慢性阻塞性肺疾病急性加重(Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)[3]等呼吸道疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，于1999年被正式命名。西門(mén)坎菌科主要包括西門(mén)坎菌屬(Simkania)、弗里契菌屬(CandidatusFritschea)和海龍?jiān)w屬(CandidatusSyngnamydia)3個(gè)屬[4]。西門(mén)坎菌屬目前僅有Sn一個(gè)菌種，模式株ATCC VR1471亦稱(chēng)為ZT株。本文對(duì)Sn的生物學(xué)特征、致病性和致病機(jī)制以及實(shí)驗(yàn)室診斷的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 生物學(xué)特征

1.1形態(tài)與結(jié)構(gòu) Sn在宿主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，具有獨(dú)特的二相性發(fā)育周期，可觀(guān)察到兩種主要形態(tài)結(jié)構(gòu)：一種形態(tài)小而致密，直徑為0.2～0.3 μm，存在于胞外環(huán)境中，具有感染能力，類(lèi)似于衣原體的原體(Elementary body, EB)；另一種形態(tài)大而疏松，直徑為0.3～0.7 μm，位于胞內(nèi)，以二分裂方式繁殖，類(lèi)似于衣原體的網(wǎng)狀體(Reticulate body, RB)。與其它衣原體不同的是，Sn的EB顆粒除有擬核區(qū)域外，還有電子透明區(qū)域的存在；其RB形態(tài)多樣，且可能具有類(lèi)似于EB的感染能力[5]。

與其它衣原體菌株相比，Sn在含病原菌的囊泡結(jié)構(gòu)上也存在很大差異。西門(mén)坎菌囊泡(Simkania-containing vacuole, SnCV)是一種單個(gè)網(wǎng)狀液泡系統(tǒng)，與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體、吞噬溶酶體等細(xì)胞器相互作用影響自身的生長(zhǎng)與發(fā)育[6-7]。有趣的是，在感染早期SnCV表面可檢測(cè)到自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的存在，但隨著感染持續(xù)，SnCV表面的LC3逐漸消失，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步闡述[6]。此外，Herweg等對(duì)SnCV的蛋白組成進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)SnCV在Sn營(yíng)養(yǎng)獲取過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。

1.2培養(yǎng)特性 Sn對(duì)多種細(xì)胞敏感，可在各種細(xì)胞系中繁殖，如BGM、HeLa、Vero、McCoy、HL和人成纖維細(xì)胞等。提高培養(yǎng)基中胎牛血清濃度、在培養(yǎng)基中加入放線(xiàn)菌酮以及使用二乙氨基-葡聚糖(DEAE-dextran)或聚乙烯二醇等化學(xué)制劑預(yù)處理宿主細(xì)胞等常規(guī)用來(lái)提高衣原體感染率的處理均不利于Sn的增殖。將接種有Sn的Vero細(xì)胞在35 ℃、1 500 g條件下離心60 min后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基是目前研究者推薦的相對(duì)有效的培養(yǎng)方法。此外，在分離培養(yǎng)臨床樣本中的Sn時(shí)應(yīng)注意在培養(yǎng)基中添加100 μg/mL的鏈霉素和萬(wàn)古霉素[9]。Sn在Vero細(xì)胞中生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)周期大約12～15 d，顯著長(zhǎng)于其它衣原體典型菌株的周期。生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示，Sn在感染細(xì)胞后的2～4 d呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。與衣原體不同，Sn似乎并不以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的方式釋放子代，可以檢測(cè)到Sn感染性子代數(shù)量不斷增加，卻未觀(guān)察到子代感染鄰近細(xì)胞的現(xiàn)象，其相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究[5, 10]。

1.3生化特征 衣原體是一類(lèi)嚴(yán)格真核細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，需依賴(lài)宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)合成自身高分子蛋白質(zhì)、核酸及低分子葉酸、賴(lài)氨酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而繁殖。然而，Sn在生化特征上與衣原體并不完全一致。

Sn含有葡萄糖激酶，能夠直接通過(guò)糖酵解途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，從而減少對(duì)宿主細(xì)胞磷酸化葡萄糖的依賴(lài)。除進(jìn)行完整的糖酵解途徑外，其菌體內(nèi)還含有三羧酸循環(huán)烏頭酸水合酶(Aconitine hydratase，AcnB)、異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase, Icd)和檸檬酸合酶(Citrate Synthase, GItA)，可通過(guò)糖酵解途徑后丙酮酸產(chǎn)生的乙酰輔酶A或富馬酸中天冬酰胺的轉(zhuǎn)化開(kāi)始檸檬酸循環(huán)，獨(dú)立產(chǎn)生NADH和ATP。與其它衣原體相似，Sn無(wú)法從頭合成核苷酸，必須依賴(lài)核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從宿主攝取核苷酸。目前，已經(jīng)在Sn中鑒定出4種核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型：SnSTT1(一種ADP/ATP反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、SnSTT2(一種鳥(niǎo)嘌呤/ATP/H+共運(yùn)輸體)、SnSTT3(一種三磷酸核苷酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)和SnSTT4(功能未知)。此外，Sn具有較為完整的氨基酸、葉酸合成途徑。色氨酸是衣原體發(fā)育的重要調(diào)控因子，宿主固有免疫應(yīng)答可通過(guò)干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)誘導(dǎo)色氨酸降解從而抑制衣原體生長(zhǎng)，使其進(jìn)入一種“暫停發(fā)育”狀態(tài)。除能合成酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸外，Sn還擁有完整的色氨酸操縱子(tryptophan operon, trp)。因此，Sn對(duì)IFN-γ的敏感性可能遠(yuǎn)低于衣原體[4, 11]。

1.4基因組結(jié)構(gòu)與功能 作為西門(mén)坎菌屬的代表菌株，Sn首先被完成測(cè)序(NC_015713)，其基因組結(jié)構(gòu)與其它衣原體存在一定的差異性(表1)。Sn基因組全長(zhǎng)2 496 337 bp，G+C含量為38 mol%,預(yù)測(cè)其91%的基因組為編碼序列，其中含有2 519個(gè)蛋白編碼基因、35個(gè)tRNA基因和1個(gè)rRNA操縱子，此操縱子含有3個(gè)rRNAs (5S，16S，23S)，另有一個(gè)大小為132 038 bp的質(zhì)粒。其16S rRNA編碼基因(GenBank登錄號(hào)為U68460)與衣原體同源性為83%，與立克次體同源性為73%[12]。

迄今為止，細(xì)菌中除貝納柯克斯體(Coxiellaburnetii)外，僅在Sn中檢測(cè)到了Ⅰ型內(nèi)含子的存在。該菌Ⅰ型內(nèi)含子與藻類(lèi)及變形蟲(chóng)的葉綠體、線(xiàn)粒體的23S rRNA內(nèi)含子密切相關(guān)。SnⅠ型內(nèi)含子并不是由23S rRNA剪接而來(lái)，有可能是通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移的方式獲得。目前，該菌Ⅰ型內(nèi)含子的具體功能還不明確，但有證據(jù)表明其可能通過(guò)抑制核糖體的功能影響菌體發(fā)育。Ⅰ型內(nèi)含子的存在可能與阿米巴蟲(chóng)和植物質(zhì)體存在共同進(jìn)化史[4]。

表1 幾種衣原體基因組的主要特征Tab.1 Main characteristics of several Chlamydiae genomes

1.5抗原結(jié)構(gòu) Sn與衣原體在形態(tài)上相似，但在抗原結(jié)構(gòu)上不同。Sn有大量特異性蛋白質(zhì)，但絕大多數(shù)(69%～82%)是未鑒定功能的未知蛋白質(zhì)[13]。

衣原體主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與穿孔蛋白(porin)一致，具有穿孔蛋白特性。外膜蛋白A(outer membrane protein A, OmcA)、外膜蛋白B(outer membrane protein B, OmcB)同MOMP一起構(gòu)成外膜復(fù)合物。除參與衣原體入侵外，外膜蛋白還是誘發(fā)宿主免疫應(yīng)答的主要抗原[14]。

經(jīng)蛋白組學(xué)分析，Sn外膜主要由65種外膜蛋白組成，其中，有37種外膜蛋白類(lèi)似衣原體MOMP，稱(chēng)為MOMP樣蛋白；有30種外膜蛋白含有β-折疊結(jié)構(gòu)，可能發(fā)揮類(lèi)似穿孔蛋白樣作用。Sn中尚未檢測(cè)到OmcA、OmcB及其同系物的存在[15]。此外，Sn還存在3種多形態(tài)膜蛋白B(polymorphic membrane proteins B, PmpB)的同系物，與衣原體Pmp一樣，同系物中存在前導(dǎo)序列、C-末端自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白域及典型的GG[A/L/V/I][I/L/V/Y]…FXXN序列，可能具有分子轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或其它相關(guān)功能[16]。

2 致病性與致病機(jī)制

2.1致病性 西門(mén)坎菌是一種廣泛分布于全世界的新發(fā)衣原體。弗里契菌屬中已鑒定的兩個(gè)弗里契衣原體種均寄生在昆蟲(chóng)體內(nèi)，是煙粉虱和介殼蟲(chóng)的專(zhuān)性共生菌；海龍?jiān)w屬則都能對(duì)魚(yú)類(lèi)致病，引起魚(yú)類(lèi)上皮組織囊腫[17-18]。Sn則是一種阿米巴共生體，能廣泛寄生于節(jié)肢動(dòng)物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和阿米巴蟲(chóng)等各種生物[13,19]。Sn及其變異株都能感染人體，但確切的傳播途徑尚未闡明。Croxatto和Donati等研究者相繼從節(jié)肢動(dòng)物蜱中擴(kuò)增出了Sn DNA和在胃腸道疾病患者中檢測(cè)到了針對(duì)Sn的特異性IgA抗體，這表明人類(lèi)可能通過(guò)接觸攜帶病原菌的阿米巴蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物或飲用被其污染的水而被感染[4]。患者感染Sn后出現(xiàn)高熱、干咳、白細(xì)胞計(jì)數(shù)左移和胃腸道不適等類(lèi)似CAP的臨床表現(xiàn)且對(duì)紅霉素治療有反應(yīng)[2]。一項(xiàng)關(guān)于索羅亞醫(yī)療中心嬰兒細(xì)支氣管炎的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，參與研究的239名細(xì)支氣管炎患兒中，有25%的個(gè)體檢測(cè)到了Sn，并在15%的個(gè)體中檢測(cè)到了特異性IgA的存在，這說(shuō)明Sn可能在嬰兒細(xì)支氣管炎中發(fā)揮致病作用[1]。此外，有血清學(xué)結(jié)果分析顯示，Sn還可能與AECOPD存在聯(lián)系。

體外研究證實(shí)Sn能感染各種組織來(lái)源的人類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)物，如呼吸道上皮細(xì)胞、生殖道細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并顯著黏附于呼吸道上皮細(xì)胞和生殖道細(xì)胞[20]。在培養(yǎng)細(xì)胞中Sn可引起以下3種感染：①急性感染，感染過(guò)程中感染性子代數(shù)量不斷增加并伴隨明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)和炎癥因子分泌。②持續(xù)性感染，其發(fā)生可能與Sn抑制細(xì)胞凋亡和缺乏誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的能力密切相關(guān)。感染過(guò)程伴隨著炎癥因子分泌，但尚未引起明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)。持續(xù)性感染細(xì)胞與巨噬細(xì)胞型細(xì)胞共培養(yǎng)后可轉(zhuǎn)化為急性感染。③潛伏性感染，該種感染可能由鐵降解誘導(dǎo)產(chǎn)生，在感染過(guò)程中沒(méi)有引起感染性子代數(shù)量增加和明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，但能檢測(cè)到Sn DNA的存在和炎癥因子分泌。在連續(xù)性胰蛋白酶處理后，潛伏性感染可轉(zhuǎn)化為急性感染[4, 20]。

2.2致病機(jī)制 Sn質(zhì)粒(PSn)是目前已知衣原體質(zhì)粒中最大的質(zhì)粒，與編碼138種預(yù)測(cè)蛋白的F型接合質(zhì)粒高度相似[13]。Kari等[21]和Porcella等[22]分別在2011年和2015年利用該菌質(zhì)粒缺陷株進(jìn)行體內(nèi)和體外感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，缺陷株引起的感染和炎癥反應(yīng)程度較弱，PSn有可能像衣原體質(zhì)粒一樣，在Sn致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。衣原體的巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)蛋白(macrophage infectivity potentiator， MIP)是一種相對(duì)分子量為27 kDa的脂蛋白，具有肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶(PPIase)活性，與嗜肺軍團(tuán)菌表面的MIP具有較高的同源性。其中，沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis, Ct)MIP可通過(guò)TLR2/TLR1/TLR6及CD14途徑刺激感染細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等促炎細(xì)胞因子，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，加重組織損傷[23]。已經(jīng)證實(shí)，PSn能夠編碼產(chǎn)生MIP同系物，其可能通過(guò)多種途徑影響Sn與宿主細(xì)胞的相互作用過(guò)程從而促進(jìn)病原體致病，但具體機(jī)制尚不明確[13]。巨噬細(xì)胞是固有免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞，在衣原體感染人體后可通過(guò)吞噬-溶酶體途徑滅活并消化病原體[24]，但部分致病衣原體可通過(guò)多種機(jī)制逃避巨噬細(xì)胞殺傷并存活于巨噬細(xì)胞內(nèi)，如Ct可通過(guò)擠壓體的形成促進(jìn)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活并增強(qiáng)自身感染性[25]。體外研究表明，Sn能夠在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中存活，且能以U937細(xì)胞作為媒介感染其它組織來(lái)源的貼壁細(xì)胞，雖然相關(guān)機(jī)制還不清楚，但這些初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與Sn在體內(nèi)的感染情況相關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步研究[26]。

除PSn外，Ⅲ型分泌系統(tǒng)也可能在Sn致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)是廣泛存在于動(dòng)、植物致病菌中的一種蛋白質(zhì)傳輸系統(tǒng)，通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白或?qū)⒍玖Φ鞍鬃⑷胨拗骷?xì)胞發(fā)揮致病作用。衣原體的不同發(fā)育時(shí)期，T3SS可通過(guò)發(fā)揮不同作用以營(yíng)造適合衣原體寄生的微環(huán)境。如Ct TarP蛋白(Ct456)可通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白募集反應(yīng)促進(jìn)EB入侵宿主細(xì)胞[27]。He等[28]通過(guò)研究表明，除影響鸚鵡熱衣原體生長(zhǎng)發(fā)育外，T3SS還可通過(guò)活化JNK/ERK途徑誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌IL-8、IL-6、TNF-α和IL-1β等促炎因子。基因組分析顯示，Sn含有與衣原體科成員均相同的T3SS編碼基因，其編碼的T3SS可能在Sn抑制宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

此外,Sn抑制TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力、編碼產(chǎn)生的MOMP樣蛋白及分泌的金屬肽酶等也可能在其致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10, 29]。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

目前，針對(duì)Sn感染的檢測(cè)方法有3種，分別是病原體的分離與培養(yǎng)、血清學(xué)診斷和基因診斷。但尚未有標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)Sn感染進(jìn)行診斷。

3.1分離與培養(yǎng) Sn不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，只能寄生在活細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞分離培養(yǎng)是其主要的分離培養(yǎng)方法。細(xì)胞培養(yǎng)除用作Sn分離外，還可研究其繁殖過(guò)程及其對(duì)細(xì)胞的敏感性和傳染性。但細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程極易被痰、鼻咽拭子等標(biāo)本中的其它細(xì)菌污染，其敏感性顯著低于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)[30]。現(xiàn)主要采用Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)臨床標(biāo)本中的Sn。分離培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Sn與衣原體一樣，對(duì)克林霉素、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和利福平類(lèi)抗生素敏感，但對(duì)部分細(xì)胞壁抑制劑具有抵抗性，如青霉素、萬(wàn)古霉素[31]。除細(xì)胞分離培養(yǎng)外，阿米巴蟲(chóng)分離Sn也是一種有效分離方法。值得注意的是，雖然絕大多數(shù)阿米巴蟲(chóng)都能維持新發(fā)衣原體的生長(zhǎng)，但并非所有的阿米巴蟲(chóng)都敏感于Sn?，F(xiàn)主要采用棘阿米巴蟲(chóng)分離樣本中的Sn。目前有研究者指出使用一種以上的棘阿米巴蟲(chóng)或幾種阿米巴蟲(chóng)可提高臨床樣本中衣原體的分離率[30]。

3.2血清學(xué)診斷 血清學(xué)檢測(cè)是臨床應(yīng)用最為廣泛的一種檢測(cè)方法，主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)(Immunoperoxidase assay, IPA)和微量免疫熒光試驗(yàn)(Microimmunofluorescence assay, MIF)。其中，ELISA是目前檢測(cè)Sn感染最常見(jiàn)的血清學(xué)試驗(yàn)，對(duì)Sn既往感染、近期感染以及急性感染的鑒定均具有一定意義。Friedman等[32]以梯度純化的Sn顆粒作為抗原對(duì)血清學(xué)標(biāo)本進(jìn)行ELISA分析后表明：ELISA對(duì)篩選Sn既往感染比較有效，但并不適用于檢測(cè)幼童血清中的IgA。與ELISA將梯度純化的Sn顆粒作為抗原進(jìn)行抗體檢測(cè)不同，IPA在檢測(cè)過(guò)程中將感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞的混合物作為抗原，在光學(xué)顯微鏡下通過(guò)比較檢測(cè)標(biāo)本與陰陽(yáng)對(duì)照得出結(jié)果。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，IPA適用于檢測(cè)任何年齡階段的血清標(biāo)本[1]。MIF是衣原體感染血清學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但似乎并不具備檢測(cè)Sn特異性抗體的能力。為了對(duì)比實(shí)驗(yàn)室間關(guān)于Sn感染的檢測(cè)結(jié)果，通常將IgG≥1∶64判定為既往感染，IgM≥1∶32或急性期與恢復(fù)期之間IgG效價(jià)增高4倍以上判定為急性感染[30, 33]。

3.3基因診斷 隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，其在衣原體學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。Kahane[1]在1998年首次采用針對(duì)該菌16SrDNA序列的引物ZpF和ZpR擴(kuò)增出了一個(gè)大小為398 bp的DNA片段。隨后，Vouga等[7]通過(guò)該菌特異性16SrRNA基因運(yùn)用定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)該菌DNA的定量檢測(cè)，并利用引物16SF和16SR及探針擴(kuò)增出一個(gè)長(zhǎng)為125 bp的片段。除16SrDNA序列外，目前用于構(gòu)建Sn PCR引物的DNA有23S rRNA基因序列及該菌熱休克蛋白60(Heat shock protein 60，Hsp60)基因序列等[30, 34]，具體引物序列見(jiàn)表2。

表2 內(nèi)蓋夫西門(mén)坎菌常見(jiàn)PCR引物Tab.2 Common PCR Primers of Simkania negevensis

4 展 望

Sn作為一種新型衣原體，其發(fā)現(xiàn)豐富了衣原體的生態(tài)多樣性，開(kāi)辟了新的研究領(lǐng)域。隨著全基因組測(cè)序的完成，人們對(duì)Sn的一般生物學(xué)特征有了初步認(rèn)識(shí)。但由于標(biāo)準(zhǔn)化研究方法的缺乏，人們對(duì)Sn的致病作用知之甚少。進(jìn)一步開(kāi)發(fā)針對(duì)Sn研究的標(biāo)準(zhǔn)化方法、開(kāi)展與已知衣原體的對(duì)比研究工作將會(huì)深化我們對(duì)Sn的了解、豐富我們對(duì)衣原體的認(rèn)知，為全面開(kāi)展衣原體臨床診斷和防治工作夯實(shí)基礎(chǔ)。

利益沖突：無(wú)