傅芬蕊，張 婭，潘玉紅，曹穎平，鄭培烝

大腸埃希菌是引起人類各種感染如泌尿道、呼吸道、創(chuàng)面?zhèn)诘母腥疽约熬Y常見的病原體之一。近年來，由于抗菌藥物使用不規(guī)范，大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥性明顯增強(qiáng)，出現(xiàn)耐碳青霉烯類藥物的大腸埃希菌。根據(jù)全國耐藥性監(jiān)測網(wǎng)2018年的數(shù)據(jù)，大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物全國平均耐藥率為1.5%。碳青霉烯類藥物是目前臨床上控制革蘭陰性菌感染最有效的抗生素之一，對大腸埃希菌具有強(qiáng)大抗菌活性，一旦出現(xiàn)耐藥，將使得感染后的治療變得十分困難。

大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物最常見的耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶[1]。碳青霉烯酶是指所有能水解碳青霉烯類的β-內(nèi)酰胺酶，依據(jù)Ambler分子分類將碳青霉烯酶分為A類碳青霉烯酶、B類金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-β-lactamase，MBL)和D類苯唑西林酶(Oxacillinase，OXA)。自2009年在印度分離的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶1(New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1)以來，產(chǎn)NDM型酶的大腸埃希菌在世界范圍內(nèi)被廣泛報道，而亞洲大陸被認(rèn)為是主要的流行區(qū)域，特別是中國和印度[2]，目前已發(fā)現(xiàn)20多種型別的NDM。本文收集來自住院患者的耐碳青霉烯類藥物大腸埃希菌8 株，對其耐藥機(jī)制和分子分型進(jìn)行研究，結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1菌株來源 從住院患者臨床標(biāo)本中分離的8株對亞胺培南耐藥的大腸埃希菌。

1.2儀器與試劑 VITEK-2 compact全自動微生物分析儀、革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡(GN)、藥敏卡片(AST-GN16)、亞胺培南Etest試紙條(法國生物梅里埃公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)、Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)、dNTP(2.5 mmol/L)、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及TOP10感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)、pCR2.1載體(25 ng/μL)(美國Invitrogen生命技術(shù)公司)、M-H瓊脂(英國Oxoid公司)、引物的合成及PCR產(chǎn)物測序(上海博尚生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1菌株鑒定與藥敏 使用VITEK-2 compact全自動微生物分析儀進(jìn)行菌株鑒定和藥敏。采用亞胺培南 Etest 試紙條對亞胺培南耐藥性進(jìn)行驗證。藥敏結(jié)果根據(jù)2019年CLSI的抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株。

1.3.2碳青霉烯酶基因檢測及測序 煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，采用PCR法擴(kuò)增常見的A類碳青霉烯酶基因(KPC、GES、SME、IMI/NMC)、B類金屬酶基因(NDM-like、IMP-like、VIM-like、SIM-1、GIM-1和SPM)、D類苯唑西林酶基因(OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-58-like和OXA-143-like)和廣譜β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因(SHV、TEM、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-8群、CTX-M-9群和CTX-M-25群)。PCR的擴(kuò)增體系均為25 μL：上下游引物各0.5 μL(10 μmmol/L)，1 μL模版DNA，2.5 μL 10×Taq Buffer，2 μL dNTP， 0.5 μL Taq聚合酶(2.5 U/μL)，用滅菌水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30 次；72 ℃ 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果觀察。電泳陽性產(chǎn)物送測序公司純化并雙向測序，所得測序結(jié)果使用BLAST與GenBank中的序列進(jìn)行比對。NDM-like基因陽性的標(biāo)本再用NDM-full引物擴(kuò)增NDM型基因全長，經(jīng)測序確定具體的NDM基因型別。引物名稱、引物序列及預(yù)計產(chǎn)物長度見表1。

表1 擴(kuò)增耐藥基因相關(guān)引物信息Tab.1 Primer information for resistance gene amplification

CTX-M-2群上游:ATGATGACTCAGAGCATTCG865[12]下游:TGGGTTACGATTTTCGCCGCCTX-M-8群上游:ATGATAGAGACATCGCGTTAAG860[13]下游:CGGTGACGATTTTCGCGGCAGCTX-M-9群上游:ATGGTGACAAAGAGAGTGCA863[12]下游:CCCTTCGGCGATGATTCTCCTX-M-25群上游:CACACGAATTGAATGTTCAG923[14]下游:TCACTCCACATGGTGAGT

1.3.3NDM-1、NDM-6與NDM-9酶水解亞胺培南能力的比較 實驗分為8組，見表2。分別擴(kuò)增含與不含啟動子序列的NDM-1、NDM-6及NDM-9型基因全長(攜帶NDM-1型基因的菌株來源于本實驗室保存的菌株)，引物分別為Pre-NDM-full與NDM-full，引物序列見表1，反應(yīng)體系及條件同上。按DNA純化回收試劑盒方法對上述基因全長進(jìn)行純化，根據(jù)pCR 2.1載體試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化。根據(jù)抗性篩選與藍(lán)白篩選挑選轉(zhuǎn)化成功的重組TOP10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行PCR檢測耐藥基因，測序證實轉(zhuǎn)化是否成功和NDM型別是否正確，瓊脂稀釋法測亞胺培南MIC值。

表2 NDM-1、NDM-6及NDM-9水解亞胺培南能力試驗分組情況Tab.2 Grouped evaluation of the imipenem-hydrolysis ability of NDM-1, NDM-6 and NDM-9

1.3.4多位點序列分型(MLST) 對攜帶有NDM基因的8 株大腸埃希菌進(jìn)行分型，PCR擴(kuò)增7 個管家基因，即adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA，所用引物序列及預(yù)計產(chǎn)物長度參考網(wǎng)站(https://enterobase.readthedocs.io/en/latest/mlst/mlst-legacy-info-ecoli.html)。PCR的擴(kuò)增體系及擴(kuò)增參數(shù)同上。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果提交到pubMLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線序列比對獲得序列型。

2 結(jié) 果

2.1菌株鑒定與表型篩查結(jié)果 本次收集的8 株大腸埃希菌，經(jīng)鑒定均為對亞胺培南不敏感的大腸埃希菌。經(jīng)亞胺培南 Etest 試紙法驗證所有菌株均對亞胺培南不敏感。見表3。

2.2碳青霉烯酶基因篩查與測序結(jié)果 8株對亞胺培南不敏感大腸埃希菌所測A類和D類碳青霉烯酶基因均為陰性，B類碳青霉烯酶基因中除NDM-like基因為陽性外，其余均為陰性；廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因中7株TEM基因陽性，4株CTX-M-1基因陽性，1株CTX-M-9基因陽性，具體見表3。擴(kuò)增8株NDM基因全長，電泳結(jié)果與預(yù)計條帶大小(813 bp)相近，如圖1所示。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，序列經(jīng)比對分析，6株為攜帶NDM-6基因，2株為攜帶NDM-9基因，見表3。

2.3NDM-1、NDM-6和NDM-9水解亞胺培南能力結(jié)果 以TOP10感受態(tài)細(xì)胞和含有空載體的重組菌作為陰性對照，僅含有NDM-1-full基因、NDM-6-full基因和NDM-9-full基因的重組菌，因不含啟動子，NDM型基因無法表達(dá)，故表現(xiàn)為對亞胺培南敏感，與陰性對照組結(jié)果相同，MIC值均為0.25 μg/mL。而含有Pre-NDM-1-full基因、Pre-NDM-6-full基因及Pre-NDM-9-full型基因的重組菌對亞胺培南均耐藥，對亞胺培南的MIC值分別為32 μg/mL、128 μg/mL和64 μg/mL。

表3 8株產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌臨床相關(guān)信息、耐藥基因檢測及分子分型結(jié)果Tab.3 Related clinical information, resistance gene detection and molecular typing of eight strains of Escherichia coli producing New Delhi metal β-lactamase

1-8分別為8株待檢菌株；M為DNA marker；陰性為陰性對照圖1 NDM基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of the NDM gene

2.4MLST結(jié)果 對該8 株耐藥大腸埃希菌進(jìn)行分子分型， ST101型有5株、ST226、ST648和ST1284型各1株。 見表3。

3 討 論

自2009年首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)NDM-1酶的菌株以來，產(chǎn)NDM型酶的菌株迅速向其他國家播散，在世界各地均有發(fā)現(xiàn)并報道。我國及世界上流行的分離菌中檢出率較高的NDM型酶基因主要為NDM-1和NDM-5[15]。本次實驗在8株大腸埃希菌中均檢測出NDM基因，其中6株攜帶NDM-6基因，2株攜帶NDM-9基因。而NDM-6基因在2012年第一次從新西蘭病人攜帶的大腸桿菌中鑒定出來以來[16]，國內(nèi)外關(guān)于NDM-6基因報道均較少見。NDM-9基因是我國學(xué)者2014年在肺炎克雷伯菌中首次報道發(fā)現(xiàn)[17]，目前已在韓國、我國大陸及臺灣地區(qū)等地均發(fā)現(xiàn)了攜帶NDM-9基因的大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等細(xì)菌[18]。

為了進(jìn)一步分析菌株耐藥基因的攜帶情況，還篩查8 株耐藥菌的廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌中存在多種耐藥基因共存現(xiàn)象，幾乎所有的耐藥菌株均攜帶有TEM基因，4 株耐藥菌同時攜帶有NDM-6、TEM和CTX-M-1基因，1 株同時攜帶NDM-6、TEM和CTX-M-9基因，目前國內(nèi)外均未見此類報道。

本文結(jié)果顯示NDM-1、NDM-6和NDM-9水解亞胺培南能力從強(qiáng)到弱依次為NDM-6、NDM-9和NDM-1，文獻(xiàn)中未見同時比較以上3種型別NDM水解亞胺培南能力的報道。對于NDM型基因，目前已發(fā)現(xiàn)了20 多個型別，而它們之間大多只有幾個堿基的不同。NDM-6基因、NDM-9基因與NDM-1基因的區(qū)別是分別在基因698 位置(C→T)和454位置(G→A)上存在有一個堿基的改變，從而導(dǎo)致氨基酸分別由丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸、谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?。氨基酸的改變會影響NDM蛋白的二級結(jié)構(gòu)，可能改變NDM蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而改變NDM與底物即碳青霉烯類藥物的結(jié)合特性，表現(xiàn)出不同的水解能力。不同類型的NDM水解碳青霉烯類藥物的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本次研究還采用MLST法對8 株耐藥大腸埃希菌進(jìn)行分型，結(jié)果為：5株攜帶NDM-6基因大腸埃希菌為ST101型，1株攜帶NDM-6基因大腸埃希菌為ST648型，有2株攜帶NDM-9基因大腸埃希菌分別為ST226型和ST1284型。在2012年首次報道產(chǎn)NDM-6基因的大腸埃希菌，其分型結(jié)果也為ST101型，而在國外報道，產(chǎn)NDM型基因的大腸埃希菌中，也有發(fā)現(xiàn)其MLST分型結(jié)果為ST101型[19]，提示大腸埃希菌ST101型與NDM型碳青霉烯酶基因關(guān)系密切。ST648型大腸埃希菌常在產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)[20]，在英國、日本分別首次報道產(chǎn)NDM-5和NDM-7基因的大腸埃希菌，其分型結(jié)果均為ST648型[21]，國內(nèi)學(xué)者也有在ST648型大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)NDM-5基因，但并未檢測出攜帶有NDM-6基因，國際上也并未發(fā)現(xiàn)攜帶有NDM-6基因的ST648型。產(chǎn)NDM基因的ST1284型大腸埃希菌在國內(nèi)外鮮有報道發(fā)現(xiàn)，第一次在ST1284型大腸埃希菌中檢出NDM-5基因是在2015年，而后雖有再次檢出NDM-5基因，但到目前為止未檢出攜帶有包括NDM-9基因在內(nèi)其它NDM型基因。國內(nèi)外均未在ST226型大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)NDM型基因。

本次分離的8 株耐藥大腸埃希菌有5株MLST分型結(jié)果一致，均為ST101型，且均檢出NDM-6基因。其中4株來自神經(jīng)內(nèi)科患者，1株來自康復(fù)科患者。通過查閱臨床相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，這位康復(fù)科患者是在神經(jīng)內(nèi)科治療一段時間后轉(zhuǎn)入康復(fù)科的，且與2號患者曾在同一個病房治療。2號患者長期臥床治療，在其住院期間，3號、4號和5號患者也在神經(jīng)內(nèi)科治療，而且3號和4號患者前后入住同一張病床。以上患者多為免疫力低下、有留置導(dǎo)尿管史和長期臥床的老年人。綜合以上因素提示這些病人極有可能是在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生了交叉感染。對此，臨床上應(yīng)盡量縮短留置導(dǎo)尿管的時間、合理使用抗菌藥物、規(guī)范醫(yī)護(hù)人員的操作和加強(qiáng)對各種醫(yī)療器械的消毒措施，同時應(yīng)重視并加強(qiáng)院感監(jiān)控力度，避免耐藥菌株的傳播和醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生。

利益沖突：無