孫悅，包永睿，2，3，王帥，2，3，李天嬌，2，3，孟憲生，2，3*（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 6600）

目前，微流控芯片技術(shù)在藥物研發(fā)領(lǐng)域中發(fā)展迅速，憑借其高通量、低消耗等優(yōu)勢成為21 世紀(jì)分析科學(xué)及生命科學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。肝癌因其發(fā)病隱匿、致死率高，成為目前對人類健康和生命威脅極大的惡性腫瘤之一[2]。雖然手術(shù)治療、放療、化療等都有一定效果，但肝癌患者5年的生存率仍不足20%，且復(fù)發(fā)率極高，因此尋找有效的抗肝癌藥物迫在眉睫。作為傳統(tǒng)滿藥第一方——復(fù)方木雞顆粒是由云芝提取物、核桃楸皮、山豆根、菟絲子4味中藥組成。云芝性甘、平，入心、脾、肝、腎經(jīng)，具有健脾利濕、清熱解毒的功效，常用于濕熱黃疸、脅痛、納差、倦怠乏力等[3]，現(xiàn)代研究[4]表明其具有較好的增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等藥理作用，為該方君藥；輔以具有清熱解毒作用的山豆根、核桃楸皮，以及具有補(bǔ)肝益腎作用的菟絲子共同發(fā)揮抗肝炎、肝硬化、肝癌等藥理作用。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研[5-6]及前期課題組[7]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木雞顆粒具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，但其各組分藥效作用尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)將微流控芯片技術(shù)與中藥復(fù)方相結(jié)合，針對中藥復(fù)方藥效篩選復(fù)雜又繁瑣的問題，構(gòu)建一種多功能的高通量藥物篩選芯片，并考察芯片的適用性；同時(shí)利用該芯片開展復(fù)方木雞顆粒及其各組分誘導(dǎo)肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡作用研究。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人肝癌HepG2 細(xì)胞購于齊氏（上海）生物科技有限公司。

1.2 試藥

復(fù)方木雞顆粒（規(guī)格：10 g/袋，批號：18080224），核桃楸皮、菟絲子、山豆根、云芝藥材由丹東藥業(yè)提供，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室許亮教授鑒定，分別為胡桃科植物核桃楸Juglans mandshuricaMaxim.的干燥樹皮、菟絲子亞科植物菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子、豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖、多孔菌科真菌彩絨革蓋菌Coriolus versicolor（L.ex Fr.）Quel 的干燥子實(shí)體。

紫杉醇注射液（山西普德藥業(yè)股份有限公司）；負(fù)性環(huán)氧樹脂光刻膠SU-8 及顯影液（美國Micro-Chem 公司）；Sylgard 184 型聚二甲基硅氧烷PDMS 及固化劑（美國Dow-Corning 公司）；達(dá)爾伯克改良伊格爾氏培養(yǎng)基DMEM、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（美國GIBCO 公司）；細(xì)胞凋亡/壞死檢測試劑盒[含Hoechst 33342 染液和碘化丙啶（PI），碧云天生物技術(shù)研究所]；細(xì)胞死活檢測試劑盒（鈣黃素Calcein-AM/PI，北京索萊寶科技有限公司）；青、鏈霉素混合溶液（美國Hyclone 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 儀器

LSP04-1A 型精密注射泵（保定蘭格公司）；NIKON ECLIPSE TI 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；TG-2U 型光刻機(jī)（北京中科同志科技有限公司）；HPDC-32G-2 型等離子清洗機(jī)（Harrick Plasma 公司）；SC-1B 型勻膠機(jī)、BP-2B 型烘膠臺(tái)（北京創(chuàng)世威納科技有限公司）；W2001R 型CO2培養(yǎng)箱（美國SIM 公司）。

2 方法

2.1 復(fù)方木雞顆粒各組分的制備

2.1.1 核桃楸皮黃酮 取適量核桃楸皮藥材粉末，以15 倍生藥量的60%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合并2 次濾液，水浴加熱濃縮至0.1 g·mL－1生藥濃度，以等體積的AB-8 濕樹脂進(jìn)行純化，2 倍柱體積三級水除雜，再用12 倍柱體積60%乙醇洗脫，洗脫液重復(fù)上述純化方法進(jìn)行二次純化，二次洗脫液水浴加熱濃縮至近干，減壓干燥，即得[8]。

2.1.2 菟絲子黃酮 取適量菟絲子藥材粉末，以15 倍生藥量的95%乙醇加熱回流提取3 次，每次1.5 h，合并3 次濾液，水浴加熱濃縮至0.1 g·mL－1生藥濃度，將濃縮液pH 調(diào)至5，以1.1倍體積的HPD-400 濕樹脂進(jìn)行純化，2 倍柱體積三級水除雜，再用4 倍柱體積60%乙醇洗脫，洗脫液水浴加熱濃縮至近干，減壓干燥，即得[9-10]。

2.1.3 山豆根生物堿 取適量山豆根藥材粉末，以10 倍生藥量的65%乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h，合并2 次濾液，水浴加熱濃縮至0.8 g·mL－1生藥濃度，將濃縮液pH 調(diào)至5，以0.8 倍體積的HPD-300濕樹脂進(jìn)行純化，2倍柱體積三級水除雜，再用8 倍柱體積65%乙醇進(jìn)行洗脫，二次洗脫液水浴加熱濃縮至近干，減壓干燥，即得[11]。

2.1.4 菟絲子多糖 取適量菟絲子藥材粉末，以20 倍生藥量的三級水加熱回流提取2 次，每次1 h，合并2 次濾液，水浴加熱濃縮至0.5 g·mL－1生藥濃度，加入過量80%乙醇混勻，靜置醇沉24 h，濾過后水溶除雜，加熱稍濃縮后涂于高溫清潔滅菌處理過的搪瓷托盤內(nèi)壁，置入真空干燥裝置內(nèi)常溫干燥。

2.1.5 山豆根多糖 取適量山豆根藥材粉末，以10 倍生藥量三級水加熱回流提取3 次，每次1 h，合并3 次濾液，水浴加熱濃縮至1.0 g·mL－1生藥濃度，加入過量75%乙醇混勻，靜置醇沉12 h，同“2.1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行除雜和干燥[12]。

2.1.6 云芝多糖 取適量云芝藥材粉末，以30倍生藥量三級水加熱回流提取3 次，每次2 h，合并3 次濾液，水浴加熱濃縮至1.0 g·mL－1生藥濃度，加入過量70%乙醇混勻，靜置醇沉24 h，同“2.1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行除雜和干燥。

上述提取純化方法是在本課題組前期大量文獻(xiàn)調(diào)研以及實(shí)驗(yàn)得出的制備方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化而得，按照上述方法制備6 個(gè)組分，獲得相應(yīng)組分的干膏，密封后置于干燥器中保存。

2.2 溶液的配制

2.2.1 紫杉醇的配制 吸取適量紫杉醇注射液，用DMEM 培養(yǎng)基配制成30 μL·mL－1的溶液，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 細(xì)胞含藥培養(yǎng)液的配制 稱取適量復(fù)方木雞顆粒及上述6 個(gè)組分純化物，分別配制成質(zhì)量濃度為6 mg·mL－1和1 mg·mL－1的細(xì)胞含藥培養(yǎng)液，過0.22 μm 微孔濾膜，所得藥液作為儲(chǔ)備液。

2.3 芯片的設(shè)計(jì)與制作

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建一種多功能的高通量藥物篩選芯片，分為上下兩部分，依次為PDMS 流體通道層和玻璃基片層，如圖1所示。主要通道為流體通道，包括流體通道區(qū)和細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，長5.5 cm，寬2.5 cm，其厚度約3 mm，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l 為12個(gè)細(xì)胞及藥物入口，o 為廢液出口；本實(shí)驗(yàn)將a、b、c、d、e、f、g、h 作為給藥的8 個(gè)入口，i、j、k、l 用作細(xì)胞培養(yǎng)及活力檢測實(shí)驗(yàn)的入口，o 為共用廢液口；細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)由6×6 列培養(yǎng)通道組成，每條通道設(shè)有4 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)腔為橢圓形，尺寸為1.0 mm×1.2 mm。

圖1 微流控芯片示意圖Fig 1 Schematic diagram of microfluidic chip

芯片采用實(shí)驗(yàn)室微流控技術(shù)，通過軟光刻、模塑法以及氧等離子體鍵合三大技術(shù)手段制得[13-14]。該芯片可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)、藥物及組分配伍、藥物對細(xì)胞刺激、結(jié)果生成與檢測等多種功能。實(shí)物圖如圖2所示。

圖2 微流控芯片實(shí)物圖Fig 2 Physical diagram of microfluidic chip

2.4 芯片預(yù)處理

將芯片的流體通道層先用75%乙醇清洗3遍，再通入純水清洗3 遍，烘干，置于超凈工作臺(tái)紫外照射30 min 后即可使用。

2.5 芯片中細(xì)胞培養(yǎng)及活力檢測

取HepG2 細(xì)胞，使用DMEM 培養(yǎng)液（10%胎牛血清、1%的青鏈霉素混合溶液）于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37℃、5% CO2、飽和濕度）常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)·cm－2，接種于芯片中，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液以0.2 μL·min－1的流速經(jīng)微量注射泵注入芯片中進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。同時(shí)，將HepG2 細(xì)胞在微流控芯片中分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，用細(xì)胞檢測死活試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行染色，檢測HepG2細(xì)胞的活力，計(jì)算芯片中細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率（%）＝活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.6 芯片中復(fù)方木雞顆粒及其各組分對HepG2細(xì)胞的促凋亡壞死作用

待芯片中細(xì)胞密度在80%左右時(shí)，用精密注射泵以0.2 μL·min－1的速度進(jìn)行給藥刺激，當(dāng)不同組分藥液分別作用HepG2 細(xì)胞24、48 和72 h 后，停止給藥，用微量注射器吸取一定量的PBS，緩慢注入細(xì)胞培養(yǎng)通道內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行清洗后，從培養(yǎng)液入口處以0.2 μL·min－1的流速通入Hoechst 33342 和PI 染液進(jìn)行雙染，使用熒光倒置顯微鏡拍照，并運(yùn)用IPP（Image-Pro Plus 6.0）圖像分析軟件對圖像進(jìn)行處理分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡壞死率，檢測不同組分的藥效差異，細(xì)胞凋亡壞死率（%）＝（凋亡細(xì)胞數(shù)＋壞死細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均用（±s）表示，組間比較采用單因素方差。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芯片中HepG2 細(xì)胞生長狀態(tài)及細(xì)胞活力

按照“2.5”項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2 細(xì)胞在芯片細(xì)胞培養(yǎng)腔中培養(yǎng)4 h 后基本貼壁，24、48、72 h 后通過熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞完全伸展，胞質(zhì)透明，形態(tài)正常，如圖3所示。細(xì)胞在芯片中的生長狀態(tài)良好，細(xì)胞存活率均在96%以上，如圖4所示。

圖3 顯微鏡下不同時(shí)間點(diǎn)空白組細(xì)胞生長狀態(tài)（10×）Fig 3 Cell growth states of blank group at different time points（10×）

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)空白組細(xì)胞死活檢測試劑盒雙染熒光圖片F(xiàn)ig 4 Live/Dead double-stained fluorescence images of cells in blank group at different time points

3.2 復(fù)方木雞顆粒及其各組分對HepG2 細(xì)胞的促凋亡壞死作用

復(fù)方木雞顆粒及其各組分同時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行24、48 和72 h 的刺激，用Hoechst 33342/PI 對細(xì)胞進(jìn)行雙染。結(jié)果見表1及圖5。

表1 復(fù)方木雞顆粒及其各組分對HepG2 細(xì)胞凋亡壞死率的影響(±s，n ＝4，%)Tab 1 Effect of Fufang Muji granules and their active components on apoptosis and necrosis rate of HepG2 cells (±s，n ＝4，%)

表1 復(fù)方木雞顆粒及其各組分對HepG2 細(xì)胞凋亡壞死率的影響(±s，n ＝4，%)Tab 1 Effect of Fufang Muji granules and their active components on apoptosis and necrosis rate of HepG2 cells (±s，n ＝4，%)

注：與空白組比較，*P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05.

組別 時(shí)間24 h 48 h 72 h空白組 1.15±0.26 1.13±0.23 1.36±0.34紫杉醇 43.36±0.55* 58.07±0.35* 74.25±0.23*復(fù)方木雞顆粒 33.04±0.78* 56.58±0.65* 70.25±0.88*核桃楸皮黃酮 52.84±1.17* 74.13±0.57* 89.82±0.87*菟絲子黃酮 38.45±0.47* 55.03±1.60* 68.21±1.07*山豆根生物堿 29.02±1.23* 42.54±0.57* 58.24±0.37*菟絲子多糖 1.52±0.25 2.26±0.19 3.24±0.36山豆根多糖 1.26±0.42 2.93±0.22 3.53±0.35云芝多糖 1.99±0.39 2.50±0.53 2.86±0.19

圖5 6 個(gè)組分作用于HepG2 細(xì)胞48 h 后的Hoechst 33342/PI 雙染熒光圖Fig 5 Hoechst 33342/PI Kit double-stained fluorescence of HepG2 cells treated with 6 active components for 48 h

結(jié)果表明，刺激48 h 時(shí)，復(fù)方木雞顆粒組分中，對細(xì)胞的凋亡壞死率較高的為核桃楸皮黃酮、菟絲子黃酮和山豆根生物堿，其中核桃楸皮黃酮的藥效優(yōu)于菟絲子黃酮；山豆根生物堿的藥效次之于兩種黃酮類成分，這3 種組分對細(xì)胞的凋亡壞死率與空白組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而方中的另外3 組多糖類成分的藥效則相對較差，其對細(xì)胞凋亡壞死率均小于3%。

4 討論

隨著顯微熒光影像、圖像分析處理等技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，微流控芯片技術(shù)在抗腫瘤類藥物篩選領(lǐng)域?qū)碛芯薮蟮陌l(fā)展前景[15]。微流控芯片技術(shù)的優(yōu)勢在于可克服傳統(tǒng)96 孔板技術(shù)操作繁瑣、重復(fù)性差以及人為誤差較大等實(shí)際問題，實(shí)現(xiàn)了在微尺度反應(yīng)室內(nèi)的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，更加貼近細(xì)胞的微生理環(huán)境。此外，用蠕動(dòng)泵以流速0.2 μL·min－1進(jìn)行動(dòng)態(tài)灌注，作用48 h 后的藥液消耗量還不足0.6 mL，大大減少了藥液的消耗[16]。芯片流體通道共用一個(gè)廢液口，這樣大大降低了操作難度，且每列細(xì)胞培養(yǎng)腔都設(shè)計(jì)了彎曲的流阻結(jié)構(gòu)，這樣的設(shè)計(jì)可保證液體不倒流，實(shí)現(xiàn)不同濃度或不同組分藥液的同時(shí)給藥刺激，既能減小實(shí)驗(yàn)誤差，也能節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間[17]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的芯片可實(shí)現(xiàn)12 種藥物的同時(shí)在線篩選，即藥物的高通量篩選，若想篩選更多組分藥效，也可通過增加更多的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)結(jié)構(gòu)單元來實(shí)現(xiàn)，該類芯片尤其適用于中藥復(fù)方的藥效篩選。簡而言之，微流控芯片用于高通量的藥物篩選具有一定的應(yīng)用優(yōu)勢及開發(fā)價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)基于一種多功能的高通量藥物篩選芯片，采用Hoechst 33342/PI 雙染法探討復(fù)方木雞顆粒及其各組分給藥24、48 和72 h 后對HepG2細(xì)胞的凋亡影響。而選用該染色方法的依據(jù)是該法在熒光顯微鏡下觀察效果較Annelid V-FITC/PI好，且易操作、結(jié)果穩(wěn)定可靠、重復(fù)性較好。由研究結(jié)果得知，除多糖類之外的3 個(gè)組分均具有較好的誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡的藥理活性，核桃楸皮黃酮和菟絲子黃酮的藥效與紫杉醇無顯著性差異，說明其促腫瘤細(xì)胞凋亡的能力較強(qiáng)，山豆根生物堿也具有較好的凋亡壞死率。通過本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及文獻(xiàn)調(diào)研[18-20]，多糖類組分并不是通過直接性殺傷或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自我凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用，其本身不具有抗腫瘤活性，是通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞增殖活性以及調(diào)節(jié)或促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，作為協(xié)同或增效作用成分存在于配方中。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)基于微流控芯片技術(shù)，將復(fù)方木雞顆粒整體拆分成不同組分，探討各組分的抗肝腫瘤藥效作用，揭示了復(fù)方木雞顆粒可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來達(dá)到治療腫瘤的作用。本研究不僅為多組分中藥復(fù)方藥效篩選提供一種方便快捷的實(shí)驗(yàn)方法，也為抗腫瘤中藥新藥研發(fā)提供了一定的參考價(jià)值。