王倩倩，孫連慶

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,陜西 西安710061

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病患者出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙體征或癥狀的一類并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為感覺、運動功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1-4］。但目前有關(guān)糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，尚缺乏有效的治療手段。丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）是丹參的有效水溶性成分，具有抗氧化、清除自由基、抗凋亡、抗炎等作用［5-10］。本研究通過離體實驗觀察Sal B 對HG 培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞增殖活性、凋亡及炎性因子表達(dá)的影響，探討Sal B 是否通過抑制細(xì)胞凋亡及炎性損傷對糖尿病周圍神經(jīng)病變起到防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞大鼠雪旺細(xì)胞系細(xì)胞（rat schwann cell line，RSC96）是一種永生化的大鼠雪旺細(xì)胞，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC，由陜西藩勝生物科技有限公司上海辦代為采買。

1.2 藥品及試劑D-葡萄糖、Sal B、噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma，美國）；低糖培養(yǎng)基、HG 培養(yǎng)基（Hyclone，美國），Annexin V-FITC（七海生物，中國）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，中國）；兔抗大鼠Bax，Bcl-2，P65，抗體（CST，美國）；白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）（Immunoway，中國）。

1.3 實驗儀器CO2培養(yǎng)箱（上海普美達(dá)儀器有限公司，中國）；倒置相差顯微鏡（olympus，日本）；臺式高速離心機(jī)（蘇州華宇凈化設(shè)備有限公司，中國）；酶標(biāo)儀（BioTek，美國）；流式細(xì)胞儀（BD Biosciences公司，美國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 復(fù)蘇RSC96 細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（10%）、雙抗，2～3天換液1次。待細(xì)胞長至瓶底80%～90%，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化，3～5 天傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4.2 MTT 比色法檢測OD 值 按照2000/孔的密度將RSC96細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度HG培養(yǎng)基（5.6、25、50、75、100、125 mmol/L）及Sal B 1 μmol/L 作用72 h，每孔避光加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔避光加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，于酶聯(lián)免疫檢測儀選擇490 nm波長測定各孔光吸收值（OD值）。

1.4.3 流式檢測ROS 按照5×104/孔的密度接種于6 孔板，將實驗分為低糖組（5.6 mmol/L），HG組（125 mmol/L），HG+Sal B 組（HG 125mmol/L+SalB 1 μmol/L），作用70 h，加入DCFH-DA 10 μmol/L，作用2 h，胰酶消化并收集細(xì)胞于流式機(jī)按照激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm 檢測活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。

1.4.4 Western blot 檢測凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 加入不同條件作用72 h，各組細(xì)胞標(biāo)本加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，將含有40 μg 蛋白上清液電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并將含5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，一抗Bax（BCL2-Associated X，Bax），B 細(xì)胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），核因子κB P65（nuclear transcription factor kappaBP65，NF-κB-P65），IL-1β過夜孵育，TBST 洗膜3 次，二抗孵育1 h，采用ECL試劑盒檢測，采用Image-pro圖像分析定量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，非正態(tài)分析數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗方法，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 OD值各組OD值隨著糖濃度的增加而降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組OD值比較（±s）

表1 各組OD值比較（±s）

注：*表示與正常對照組比較，P＜0.05

組別對照組次數(shù)HG組OD值0.6656±0.0407 0.6472±0.0247 0.6054±0.0230 0.6582±0.0433 0.5782±0.0385*0.5196±0.0363*3 3 3 3 3 3 GS劑量（mmol/L）5.6 25 50 75 100 125

2.2 細(xì)胞增殖活力的抑制隨著丹酚酸濃度的升高，丹酚酸B促進(jìn)細(xì)胞增殖作用越明顯。見表2。

2.3 ROS 含量HG 組與對照組比較，ROS 含量明顯增加；HG+Sal B 中劑量組（HG 125 mmol/L+SalB 1 μmol/L）與HG組比較，ROS含量明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

2.4 細(xì)胞凋亡及炎性相關(guān)蛋白的表達(dá)與對照組比較，HG組Bax、P65、IL-1β表達(dá)水平表達(dá)上升，Bcl-2 表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）；與HG 組比較，HG+Sal B 中劑量組Bax、P65、IL-1β 表達(dá)水平下降，Bcl-2表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）。見圖2。

表2 各組對細(xì)胞增殖活力的影響（±s）

表2 各組對細(xì)胞增殖活力的影響（±s）

注：*表示與HG組比較，P＜0.05

分組對照組HG組HG+SalB高劑量組HG+SalB中劑量組HG+SalB低劑量組細(xì)胞增殖活力0.6670±0.0590 0.5876±0.4930 1.9870±0.0480*1.3982±0.0425*0.9832±0.0520*次數(shù)3 3 3 3 3劑量GS 5.6 mmol/L GS 125 mmol/L GS 125 mmol/L+SalB 10 μmol/L GS 125 mmol/L+SalB 1 μmol/L GS 125 mmol/L+SalB 0.1 μmol/L

圖1 各組ROS含量

圖2 各組凋亡及炎性相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

氧化應(yīng)激是糖尿病周圍神經(jīng)病變的重要發(fā)病機(jī)制，而HG 刺激是誘發(fā)細(xì)胞活性氧過量產(chǎn)生的重要原因。當(dāng)周圍神經(jīng)組織暴露在HG 環(huán)境中時，葡萄糖順濃度梯度轉(zhuǎn)運到神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞內(nèi)長期、慢性高血糖狀態(tài)將導(dǎo)致氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡。線粒體是ROS 的重要靶器官，而神經(jīng)組織中線粒體含量豐富，因此，由氧化應(yīng)激損傷造成的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡最終可能導(dǎo)致DPN 的發(fā)生［10-11］。HG 可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS 的累積。ROS 在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。ROS 可誘導(dǎo)線粒體通透孔開放，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，并釋放細(xì)胞色素C，繼而激活NF-kB 等炎性信號通路，誘發(fā)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18 的合成、釋放，最終引起細(xì)胞損傷。

Sal B是丹參的主要藥用成分之一，由三分子的丹參素和一分子的咖啡酸縮合而成。研究發(fā)現(xiàn)，Sal B可通過抗氧化活性緩解高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠癥狀［12］；同時，Sal B可阻斷神經(jīng)元內(nèi)氧化應(yīng)激和線粒體障礙，對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用［13］。因此，我們推測Sal B可能通過抑制ROS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及炎性損傷保護(hù)周圍神經(jīng)。鑒于此，我們采用MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的提高，RSC96 細(xì)胞增殖活性降低。繼而檢測了不同濃度Sal B 對HG 培養(yǎng)的RSC96 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著Sal B濃度的增加，RSC96 細(xì)胞增殖活性增加。采用流式法檢測ROS 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可上調(diào)ROS，Sal B 可下調(diào)ROS；采用免疫印跡法檢測凋亡、炎性因子相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HG 可增加凋亡、炎性因子相關(guān)蛋白的表達(dá)，Sal B 可減少凋亡及炎性因子相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

綜上所述，Sal B 可通過抑制ROS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及炎性因子的表達(dá)保護(hù)周圍神經(jīng)。但目前有關(guān)Sal B 作用于動物模型及人體的實驗尚待進(jìn)一步研究。在今后的工作中可進(jìn)一步研究印證Sal B對糖尿病周圍神經(jīng)病變保護(hù)作用。