鄭海洋，張譯同，曹東慧，王 麗

(1.東北師范大學遺傳與細胞學研究所，教育部分子表觀遺傳學重點實驗室，吉林 長春 130024；2.吉林大學第一醫(yī)院臨床研究部，吉林 長春 130021)

白色念珠菌(Candidaalbicans)是一種常見的條件致病真菌.在正常情況下，白色念珠菌以酵母態(tài)存在于人體表面和黏膜上，不會引起感染癥狀.但是，當人體的免疫力低下時，白色念珠菌會迅速繁殖并轉(zhuǎn)換為菌絲態(tài)，侵襲人體的口腔、皮膚和陰道，引起感染[1-2].由白色念珠菌引起的血液感染，即使進行了治療，死亡率仍然高達70%[3-4].臨床上常用的抗真菌藥如氟康唑和兩性霉素B等具有廣譜抗真菌作用，但長期使用會導致病原菌耐藥性的增加.因此，開發(fā)新的抗真菌藥成為公共衛(wèi)生安全的迫切愿望[5-6].

中國地大物博，有許多藥用植物與芳香植物，加之我國擁有悠久的中草藥應用歷史，因此藥用植物成為開發(fā)新的抗真菌藥物的寶庫.自然界中大部分植物都具有獨特的氣味，這些氣味由植物中多種小分子揮發(fā)性物質(zhì)(萜類、苯環(huán)/苯丙素類和脂肪族衍生物)混合而成[7-8].這些揮發(fā)性物質(zhì)不僅在植物的生長和繁殖中發(fā)揮重要作用[9]，還被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌活性[10-11].

香雪蘭(Freesiahybrida)是鳶尾科的多年生球莖花，它具有濃郁的香氣，包含多種揮發(fā)性物質(zhì)，尤其是大量的萜類化合物.本課題組前期從香雪蘭RedRiver?花朵中提取了精油，隨后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測量了精油中的成分和各成分含量.課題組之前的研究表明，香雪蘭精油對多種微生物都有抑制作用[12]，但是對白色念珠菌的抗真菌作用及其可能的作用機制尚不清楚.為此，本文檢測了精油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，研究了精油對白色念珠菌增殖的影響，并通過膜完整性、氧化還原平衡和線粒體功能進一步探討了其作用機理，以為抗真菌感染藥物的開發(fā)提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

香雪蘭RedRiver?購自遼寧省朝陽市凌源市.取花朵提取精油.

白色念珠菌ATCC10231取自東北師范大學生命科學學院微生物學實驗室，用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)培養(yǎng).芳樟醇購自Sigma公司(美國)，其余試劑購自上海生工生物工程股份有限公司.

1.2 濾紙片瓊脂擴散法測量精油及其成分的抗真菌能力

挑取白色念珠菌單克隆，接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，置于30℃搖床140 r/min培養(yǎng)16 h左右.將菌懸液與含瓊脂的培養(yǎng)基混合均勻后平鋪在制備好的固體培養(yǎng)基表面，取直徑6 mm的無菌濾紙片分別在二甲基亞砜(DMSO)、兩性霉素B、精油及精油組分中完全浸潤，放置在含菌平板上，培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈大小.其中，DMSO為陰性對照，兩性霉素B為陽性對照.

1.3 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

調(diào)整菌濃度至1×106個/mL左右，分裝至15 mL離心管中.使用DMSO做中間溶劑，稀釋精油并加入菌懸液中，使精油終濃度(質(zhì)量分數(shù))為0.4%，0.25%，0.125%，0.1%，0.05%，0.025%，0.005%，0.30℃培養(yǎng)24 h后觀察溶液，肉眼觀察無渾濁的為最低抑菌濃度.在超凈臺中從每管吸取100 μL溶液涂布至YPD平板上，繼續(xù)過夜培養(yǎng)，無菌落生長的為最低殺菌濃度.

1.4 白色念珠菌生長曲線繪制

調(diào)整菌濃度為(0.1～1)×106個/mL，將菌液分為4組，分別使用不同濃度精油(0.125%，0.1%，0.05%)和DMSO進行處理，每組3個平行.每隔1 h測量菌液D值，繪制白色念珠菌生長曲線.

1.5 觀察香雪蘭精油對細胞膜和細胞形態(tài)的影響

取活性良好的菌懸液，經(jīng)PBS洗滌后用不同濃度的香雪蘭精油分別處理2 h和4 h.處理完成后10 000 r/min離心10 min，取上清測量其在260和280 nm處的吸光值，確定白色念珠菌大分子物質(zhì)泄漏情況，判斷細胞膜通透性變化.

收集不同濃度的精油處理過的白色念珠菌，PBS洗滌后重懸，移入裝有玻璃片的24孔培養(yǎng)板中，靜置1 h使菌液沉淀至玻璃片上.小心除去上清液，2.5%戊二醛固定并用系列叔丁醇脫水干燥.取干燥的樣品進行金屬濺射涂層，用S-570掃描電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài).

1.6 檢測白色念珠菌氧化還原狀態(tài)

離心收集精油處理后的白色念珠菌，用DCFH-DA探針測定活性氧(ROS)含量.設置激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm，用全波長酶標儀檢測.根據(jù)(Fsample-Fblank)/(FDMSO-Fblank)×100%將實驗結(jié)果轉(zhuǎn)換為百分比.式中，F(xiàn)DMSO，F(xiàn)sample，F(xiàn)blank分別是DMSO處理組、精油處理組和PBS處理組的熒光值.用JC-1染色工作液測定白色念珠菌線粒體膜電位變化.設置激發(fā)光波長490 nm、發(fā)射光波長530 nm檢測JC-1單體；設置激發(fā)光波長525 nm、發(fā)射光波長590 nm檢測JC-1聚合物.線粒體膜電位表示為聚合物與單體的比.

離心收集精油處理后的白色念珠菌，液氨研磨破碎細胞，用PBS溶解并離心，取上清作為待測樣品.按碧云天總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)說明書、過氧化氫酶檢測試劑盒說明書和脂質(zhì)氧化檢測試劑盒說明書測定白色念珠菌超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)酶活性和丙二醛(MDA)含量.

1.7 抗氧化基因表達分析

通過Trizol法提取白色念珠菌RNA，轉(zhuǎn)化為cDNA，并使用SYBR Green PCR Master mix專用試劑通過Real time-qPCR檢測相關(guān)基因的表達.引物序列如下：

ACT正向引物序列，5′-CGATGGAAGTTTGAGGCAATA-3′，反向引物序列，5′-CTCTCGGCC AAGGCTTATACT-3′；SOD2正向引物序列，5′-CGCAACTACCCGTGCTACTTT-3′，反向引物序列，5′-TGGTTCAGTAGCGGAGAATTCA-3′；SOD6正向引物序列，5′-GACCCCGACCCACCTCAACAA-3′，反向引物序列，5′-GGGTAGCAAGGAGTGCCGGT-3′；CAT正向引物序列，5′-CCACCCCAGCTGATTTCAAA-3′，反向引物序列，5′-ACACTCTGTCTTGGATAGCAGCAT-3′.

2 結(jié)果與分析

2.1 精油及其成分對白色念珠菌生長的抑制能力

表1顯示了香雪蘭精油及其主要成分對白色念珠菌的抗真菌作用.DMSO作為陰性對照對白色念珠菌沒有明顯的抑制作用.兩性霉素B作為抑制白色念珠菌的陽性對照，抑菌圈的直徑為(1.283±0.029)cm，這意味著白色念珠菌對其具有中度敏感性.精油對白色念珠菌的抑制作用強于兩性霉素B，抑菌圈直徑為(2.267±0.208)cm，說明白色念珠菌對精油極度敏感.在精油的主要成分中，芳樟醇與精油具有相似的作用，松油醇、香葉醇和橙花醇具有中度或高度的抑制作用，而羅勒烯、環(huán)檸檬醛、紫羅蘭酮和二氫-β-紫羅蘭酮幾乎沒有抑菌作用，因此，選擇精油和芳樟醇來檢查對白色念珠菌生長的影響.檢測結(jié)果表明，它們的抗真菌作用都是劑量依賴性的.此外，0.1%的精油顯著抑制了白色念珠菌的生長(P<0.05)，而0.1%的芳樟醇沒有明顯的抑制作用(見圖1(A))，表明精油具有顯著的抑制作用，抗真菌作用比其組分要強.

表1 香雪蘭配制精油及其主要成分對白色念珠菌的抑制作用

當白色念珠菌懸液沒有肉眼可見的渾濁時，精油達到最小抑菌濃度(MIC).當精油濃度為0.1%時，液體沒有渾濁，D(600)值接近空白對照，因此，判斷精油的MIC為0.1%.繼續(xù)培養(yǎng)后，當精油質(zhì)量分數(shù)達到0.25%時，平板上沒有菌落生長，精油的MFC為0.25%(見圖1(B)).綜合考慮MIC和MFC，在以下實驗中選擇質(zhì)量分數(shù)為0.05%，0.1%和0.125%的精油探究抑菌殺菌機制.

圖1 精油對白色念珠菌的抑制作用

用不同濃度的精油和芳樟醇處理白色念珠菌細胞24 h(A).在去除精油的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，測得MFC(B).數(shù)據(jù)代表3次平行實驗的平均值.

2.2 精油對白色念珠菌增殖和形態(tài)的作用

檢查精油對白色念珠菌20 h內(nèi)增殖的劑量影響，結(jié)果見圖2.由圖2(A)可見，0.05%的精油在最初的8 h內(nèi)對白色念珠菌的生長具有抑制作用，而其抗真菌作用在隨后的12 h內(nèi)逐漸降低.但是，在整個20 h內(nèi)，0.1%和0.125%精油處理的白色念珠菌都沒有生長趨勢，表明0.1%和0.125%的精油抗真菌作用是持續(xù)的.對白色念珠菌的進一步形態(tài)學觀察表明：DMSO組白色念珠菌的形狀規(guī)則，背景干凈；0.05%處理組細胞黏附無明顯改變；0.1%處理組細胞融合在一起，輪廓模糊，背景中存在一些細胞碎片；在0.125%的處理組中，可以發(fā)現(xiàn)大量細胞碎片(見圖2(B)).

為了檢測精油是否會導致細胞膜受損，在不同處理組中檢測大分子物質(zhì)的泄漏情況，結(jié)果(見圖2(C))表明，精油處理2 h后，大量核酸和蛋白質(zhì)從細胞中流出，隨著精油處理時間的延長，大分子物質(zhì)的泄漏程度也在增加.

(A)生長曲線；(B)細胞形態(tài)變化；(C)核酸泄漏和蛋白質(zhì)泄漏情況

2.3 精油誘導白色念珠菌的氧化還原失衡

正常細胞代謝產(chǎn)生的活性氧會被抗氧化酶(如超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)迅速分解為無害物質(zhì)[13].為了了解白色念珠菌中活性氧(ROS)的產(chǎn)生和積累情況，檢測了細胞內(nèi)ROS水平以及SOD、CAT的活性，結(jié)果見圖3.由圖3(A)可見，ROS水平在0.05%精油處理組略有增加，而在0.1%和0.125%處理組極顯著增加.為了檢查ROS的積累是否能引起脂質(zhì)過氧化水平的提高，檢測了丙二醛的含量.與ROS的結(jié)果類似，0.1%和0.125%處理組中丙二醛的含量有所增加(見圖3(B)).對線粒體膜電位的測量結(jié)果如圖3(C)所示，當用0.1%和0.125%的精油處理白色念珠菌時，線粒體膜電位極顯著降低.這表明ROS積累與粒體功能障礙有關(guān).此外，在蛋白質(zhì)和mRNA水平觀察精油處理后白色念珠菌超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的變化情況，SOD和CAT酶活性和基因表達水平均呈下降趨勢(見圖3(D)，(E)，(F)).

(A)ROS的積累情況；(B)MDA含量變化；(C)線粒體膜電位變化；(D)超氧化物歧化酶活性；

3 討論與結(jié)論

白色念珠菌嚴重威脅著艾滋病、癌癥和器官移植等免疫薄弱的患者的安全[14-15].傳統(tǒng)抗真菌藥物的使用具有局限性，為此人們迫切尋找新的藥物替代或協(xié)助治療白色念珠菌感染.由于毒性低且易于獲取，多種植物代謝產(chǎn)物引起了科學家的關(guān)注[16-18].1969—2015年，多達142種具備抗真菌作用的天然產(chǎn)物被記錄發(fā)表[19].本實驗采用香雪蘭RedRiver?花朵提取精油，通過濾紙片瓊脂擴散法得到香雪蘭精油對白色念珠菌的抑菌圈直徑為22.67 mm，藥物敏感程度為極度敏感.芳樟醇、松油醇和香葉醇等主要成分單獨實驗時也表現(xiàn)出抑菌作用，這與Pinto E.，Carson C.和Riley T.等人的研究結(jié)果[20-21]一致.但本實驗中單一成分的抑菌圈直徑小于香雪蘭精油本身，證明香雪蘭精油的抑菌效果優(yōu)于單一成分.常量稀釋法測定的香雪蘭精油對白色念珠菌的MIC和MFC分別為0.1%和0.25%.生長曲線的結(jié)果與之相符，MIC及更高濃度的香雪蘭精油能在較長時間內(nèi)持續(xù)阻礙白色念珠菌的生長，而更低濃度的精油只能起到延緩生長、降低真菌活性的作用.與國內(nèi)一些其他精油相比，如朱梅芳等[22]提取的五味子-薄荷-連翹混合精油，香雪蘭精油的MIC更小，對白色念珠菌抑菌作用更強.

精油抗真菌的機制包括破壞細胞壁和細胞膜、影響細胞分裂、破壞DNA/RNA和蛋白質(zhì)合成以及阻礙線粒體功能等[10-11，23-25].在本實驗中，利用分光光度計探測菌液上清中核酸及蛋白質(zhì)的含量可以發(fā)現(xiàn)，精油處理后上清液吸光值上升，白色念珠菌細胞膜通透性增加導致細胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏.掃描電鏡下也觀察到精油導致白色念珠菌形態(tài)改變，相互粘連.對細胞內(nèi)相關(guān)指標的檢測顯示，精油處理后白色念珠菌的線粒體膜電位喪失、ROS大量積累、脂質(zhì)過氧化水平加強，表明精油導致的生長抑制可能與線粒體功能障礙有關(guān).線粒體是細胞的重要細胞器，它們的損傷會導致大量活性氧的產(chǎn)生[26]，進一步誘導脂質(zhì)過氧化作用加強，產(chǎn)生以MDA為代表的終產(chǎn)物.MDA能引起大分子(如蛋白質(zhì)和核酸)的交聯(lián)聚合，并且具有細胞毒性[27-28].此外，香雪蘭精油抑制了具有清除ROS作用的抗氧化酶SOD和CAT的活性.抗氧化酶的缺乏導致活性氧和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的大量積累，進一步破壞了生物膜結(jié)構(gòu).根據(jù)以上結(jié)果，香雪蘭精油影響白色念珠菌的機制包括破壞細胞膜導致內(nèi)溶物泄露以及誘導線粒體功能障礙導致氧化還原失衡，這也表明不同的作用機制在精油抑制白色念珠菌的過程中并非單獨發(fā)生，而是共同起作用.

香雪蘭精油對白色念珠菌有良好的抑制作用，該作用具有時間效應和劑量效應.這種抑制機制造成細胞膜損傷與線粒體功能障礙，使細胞內(nèi)氧化還原失衡，細胞不能正常生長生存.香雪蘭精油富含多種萜烯類化合物，成分復雜，可能比傳統(tǒng)單一成分的抗真菌藥更難產(chǎn)生耐藥性現(xiàn)象.另外，香雪蘭精油氣味清新，容易為患者所接受.有關(guān)香雪蘭精油的產(chǎn)品值得進一步研究，為開發(fā)天然抗真菌藥物奠定基礎.