馬濤 張曉剛* 趙永利 于海洋 曹盼舉 趙希云 張宏偉 權(quán)禎 陳缽

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種慢性代謝性疾病，其特征在于骨礦物質(zhì)密度降低和骨組織結(jié)構(gòu)缺陷[1]。OP的發(fā)生伴隨著骨骼強度的漸進(jìn)性降低，增加了脆性骨折的風(fēng)險。隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，其發(fā)病率不斷升高，導(dǎo)致了患者生活質(zhì)量下降以及高昂的醫(yī)療費用支出，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題，因此如何有效防治OP成為亟待解決的難題[2]。近年來研究表明自噬與成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)、破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖分化、功能發(fā)揮密切相關(guān)，自噬活性的變化對于維持骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，是OP發(fā)病的關(guān)鍵因素。本文擬對中藥干預(yù)OP細(xì)胞自噬的影響及最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 自噬相關(guān)概述

細(xì)胞自噬(autophagy)是一種高度保守的細(xì)胞分解代謝和能量產(chǎn)生過程，通過溶酶體途徑回收降解細(xì)胞內(nèi)衰老的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和致病微生物，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)和能量更新代謝并且維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[3]。正常條件下基礎(chǔ)自噬在所有細(xì)胞中均處于較低水平，是維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能的必需條件，但在缺氧、感染以及氧化應(yīng)激等因素作用下可能會刺激細(xì)胞自噬異常激活[4]。細(xì)胞自噬過程主要分為成核、延伸、成熟和降解等4個主要步驟，其中自噬小體的形成為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該過程被大約35種自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene, ATG)家族蛋白控制[5]。首先，由Ⅲ類PI3K/Vps34復(fù)合物激活后結(jié)合ATG14、Vps15、Beclin-1等蛋白形成多蛋白復(fù)合體，誘導(dǎo)雙層膜結(jié)構(gòu)繼續(xù)延伸[6]。隨后Atg12/Atg5與Atg8/LC3兩個進(jìn)化保守的泛素樣結(jié)合系統(tǒng)協(xié)調(diào)完成其延伸和閉合過程，該系統(tǒng)促使LC3-1與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)偶聯(lián)至LC3-II，其中LC3-II作為自噬體中存在的完整膜蛋白，被認(rèn)為是自噬可靠標(biāo)志物[7]。最后，分離的物質(zhì)和內(nèi)部自噬體膜被溶酶體水解酶分解并降解以進(jìn)行更新[8]。最新研究表明，細(xì)胞自噬作為一種細(xì)胞存活途徑，參與調(diào)控BMSCs、OB及OC，在維持骨穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用，并且該途徑的改變在某種程度上與OP密切相關(guān)[9]。

2 自噬與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬

BMSCs是骨髓中的常駐細(xì)胞群，負(fù)責(zé)成骨、成脂和軟骨分化，其自我更新和多向分化潛能的異常是OP的關(guān)鍵病理因素。越來越多的證據(jù)表明，BMSCs的干性維持和功能活性取決于自噬與凋亡之間的協(xié)調(diào)平衡[10]。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)自噬可以通過拮抗細(xì)胞凋亡來抑制ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而延長BMSCs的壽命，維持其干性。此外，過量使用激素會損害BMSCs的增殖能力，而自噬可以減輕激素對BMSCs增殖的負(fù)面影響[12]。另一方面，自噬與BMSCs成骨分化之間存在內(nèi)在聯(lián)系。BMSCs被證明在分化未開始時積累自噬體并將其遞送至溶酶體，并通過與AMPK/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)協(xié)同刺激BMSCs向OB分化[13]。Wan等[14]發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，OP患者的BMSCs自噬水平及成骨潛力顯著降低。在動物實驗中，同樣可以觀察到OP小鼠模型中BMSCs自噬水平的降低，以及成骨分化和免疫調(diào)節(jié)的異常[15]?；诖丝梢钥闯?，自噬活性影響B(tài)MSCs的增殖分化、功能活性以及干性維持，并與OP密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于自噬介導(dǎo)BMSCs的成骨分化仍存在爭議，有學(xué)者認(rèn)為OB的分化不受自噬藥理學(xué)或基因失活的影響[16]。因此，需要更充分有力的證據(jù)來分析自噬途徑及其在BMSCs成骨過程中的作用。

2.2 成骨細(xì)胞自噬

OB作為骨形成的調(diào)節(jié)劑，其重要作用之一是刺激骨基質(zhì)礦化，發(fā)揮骨骼構(gòu)建的基本功能。研究證實自噬相關(guān)基因不僅在BMSCs向OB分化過程中意義重大，而且通過影響OB的正常生理功能以及骨基質(zhì)的礦化干預(yù)OP的發(fā)病[17-18]。Weng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，沉默ATG5可抑制OB的增殖和分化并增加細(xì)胞凋亡，過表達(dá)ATG5則可增強OB的抗氧化能力并減少細(xì)胞凋亡，這表明自噬對維持OB活力及正常增殖、凋亡至關(guān)重要。ATG7和Beclin-1是OB譜系中礦化所必需的自噬相關(guān)基因，自噬體作為重要的運輸載體參與了OB礦化過程。Nollet等[20]發(fā)現(xiàn)對ATG7和Beclin-1進(jìn)行基因沉默后，OB譜系的礦化效率顯著下降。Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)通過敲除OB中FAK家族相互作用蛋白(FIP200)導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)減少，其原因在于自噬水平的降低導(dǎo)致了OB分化和礦化能力的下降。此外，自噬也積極參與了對成骨具有重要意義的信號通路。例如，胰島素樣生長因子-I(IGF-I)刺激OB的成骨分化，其部分機制是通過激活A(yù)MPK信號通路和上調(diào)自噬來實現(xiàn)的[22]。此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)誘導(dǎo)的促成骨級聯(lián)反應(yīng)涉及ATG7的激活，該因子隨后靶向調(diào)控Wnt16以激活MMP-13并最終促進(jìn)OB分化[23]。上述研究表明自噬相關(guān)基因ATG7、Beclin-1、ATG5 等均介導(dǎo)了OB的骨形成過程。通過明確自噬對OB功能的影響，為探索骨骼病理狀況及OP發(fā)生機制提供有力的理論支撐。

2.3 破骨細(xì)胞自噬

OC是由BMSCs分化以及單核前體細(xì)胞融合形成的一類高度分化的多核巨細(xì)胞，不僅主導(dǎo)骨吸收過程，而且是機體免疫系統(tǒng)不可替代的組成部分[24]。最新研究表明，自噬在促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向OC分化及發(fā)揮OC正常生理功能方面扮演重要角色。破骨前體細(xì)胞向OC的分化過程由巨噬細(xì)胞集落刺激因子(monocyte colony-stimulating factor，M-CSF)和RANKL(receptor activator for nuclear factor-κB ligand)通過信號調(diào)節(jié)開始，趨化因子CXCL12以及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine- 1- phosphate，S1P)則負(fù)責(zé)其中OC的粘附和遷移，而S1P被證實可以通過mTOR途徑抑制自噬，預(yù)示自噬與OC的形成關(guān)系密切[25-26]。此外，對于OC主導(dǎo)的骨吸收過程中，ATG5、ATG7、Beclin-1、P62、LC3等自噬相關(guān)基因均參與其中。有學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn)通過敲除去卵巢 (ovariectomized，OVX)小鼠中的ATG7，能抑制OC活性并降低骨吸收水平，最終引起骨量丟失。骨吸收的關(guān)鍵在于OC在骨表面的遷移過程，而LC3-II缺乏導(dǎo)致OC不能降解過時的偽足小體，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白結(jié)構(gòu)的紊亂和OC的遷移受損[27]。另一項關(guān)于Beclin-1敲除小鼠的體內(nèi)外實驗，顯示出OC的分化障礙以及骨吸收功能的受損[28]。除了維持OC的形成及功能發(fā)揮，多項研究證實在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的體外缺氧、微重力、氧化應(yīng)激等條件下，自噬活性增加有利于減少細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，從而保護OC的形成和存活[29-31]。

3 中藥干預(yù)骨質(zhì)疏松癥細(xì)胞自噬

3.1 中藥單體

Zheng等[32]在OVX小鼠中分離出BMSCs，發(fā)現(xiàn)LC3和Beclin-1的蛋白和mRNA表達(dá)均顯著降低，表明OVX小鼠的自噬水平下降，進(jìn)一步應(yīng)用蛇床子素(osthole，Ost)處理BMSCs，導(dǎo)致LC3和Beclin-1蛋白的上調(diào)以及mRNA的產(chǎn)生，認(rèn)為Ost可以維持BMSCs自噬并促進(jìn)其成骨分化。同樣可以通過增加自噬活性來增強BMSC成骨分化，從而逆轉(zhuǎn)骨量丟失的還有蘆丁(rutin，Rut)[33]、淫羊藿苷(icariin，Ica)[34]、歐前胡素(imperatorin，Imp)[35]等。此外，Kim等[36]發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽導(dǎo)致OB活性下降并加速其凋亡，應(yīng)用高良姜素后則觀察到OB自噬水平的提高以及凋亡過程的逆轉(zhuǎn)，提示類黃酮保護OB的活性及功能是通過自噬來實現(xiàn)的。白藜蘆醇(resveratrol，Res)、芒果苷(mangiferin，Mag)以及水晶蘭苷可以通過促進(jìn)OB自噬降低氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而保護OB免受過氧化氫(H2O2)的細(xì)胞毒性作用，達(dá)到保護OB存活的目的[37-39]。Feng等[40]發(fā)現(xiàn)葛根素(puerarin，Pur)可以通過自噬促進(jìn)OB增殖和分化，但是對其礦化沒有顯著影響，其可能的分子機制是下調(diào)miR-204導(dǎo)致LC3B表達(dá)增強。而Pur對OC自噬的誘導(dǎo)作用可能是基于Akt/mTOR通路實現(xiàn)的[41]。山萘酚(kaempferol，Ka)可以通過阻斷自噬抑制OC分化和骨吸收[42]。上述研究提示中藥單體及其有效成分可干預(yù)BMSCs、OB、OC等多種細(xì)胞的自噬相關(guān)基因表達(dá)水平。

3.2 中藥復(fù)方

近年來，中藥復(fù)方調(diào)控OP細(xì)胞自噬的相關(guān)實驗及臨床研究逐漸增加。趙旭等[43]對OP大鼠給予左歸丸干預(yù)后，從基因組學(xué)層面分析BMSCs的基因表達(dá)譜時間序列變化，發(fā)現(xiàn)左歸丸可能通過調(diào)控BMSCs、OB及OC的自噬凋亡、增殖分化水平，進(jìn)而促進(jìn)OB分化，減弱OC活化，抑制骨吸收并減少骨量丟失，最終達(dá)到治療OP的目的。沈耿楊[44]通過在體及體外實驗，運用基因沉默等技術(shù)進(jìn)一步證明了左歸丸對BMSCs成骨分化的促進(jìn)作用，并推測其可能與let-7f以及自噬的相互作用有關(guān)。石垚[45]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動物實驗，提出二仙湯可以調(diào)控Akt/mTOR通路提高OB自噬水平，提升OB的抗氧化和抗凋亡能力，達(dá)到抗衰老性O(shè)P的作用。于巖松[46]發(fā)現(xiàn)補正續(xù)骨丸可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)mTOR信號通路中4EBP1、p70S6K蛋白的表達(dá)來抑制骨吸收，進(jìn)而治療絕經(jīng)后OP以及骨質(zhì)疏松性骨折。譚登等[47]將補腎通絡(luò)方作用于斑馬魚OP模型，發(fā)現(xiàn)其不僅可以增加斑馬魚椎骨面積，顯著降低CTSK，TRAP表達(dá)及肌動蛋白環(huán)數(shù)目，而且可以抑制ATG5、ATG7、p62等破骨分化標(biāo)志基因表達(dá)。提示補腎通絡(luò)方可以通過降低自噬來抑制OC增殖分化以及骨吸收進(jìn)程。

4 小結(jié)

自噬參與調(diào)控BMSCs、OB以及OC的增殖分化、功能發(fā)揮，其活性的降低會影響骨形成與骨吸收之間的動態(tài)平衡即骨穩(wěn)態(tài)，以此來作為自噬防治OP的分子層面的作用機制。此外由于OP進(jìn)程中復(fù)雜的骨量丟失機制，我們推測自噬不僅可以干預(yù)骨穩(wěn)態(tài)，其與雌激素缺乏、衰老狀態(tài)、代謝性酸化之間的相互關(guān)系同樣不容忽視。

目前尚未開發(fā)出安全、有效的藥物來干預(yù)OP復(fù)雜進(jìn)程中的細(xì)胞自噬?，F(xiàn)階段，中藥干預(yù)OP細(xì)胞自噬的研究雖具有廣闊前景但仍處于探索期，但有研究認(rèn)為中藥對BMSCs、OB以及OC等細(xì)胞的自噬水平有不同程度的干預(yù)作用，其機制尚未明確。未來應(yīng)該不斷開展以中醫(yī)藥理論指導(dǎo)的臨床及實驗研究，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥以及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，深入發(fā)掘中醫(yī)藥干預(yù)OP細(xì)胞自噬的靶向治療機制，盡可能多的探索可以干預(yù)OP細(xì)胞自噬的中藥單體及有效成分、中藥復(fù)方以及治療方法等，以期為中醫(yī)藥防治OP提供新的視角與思路。