景志忠，房永祥，陳國華，賈懷杰，何小兵，李軍成，高真貞，莫斯科，馮海燕，王春燕，李守杰，曾 爽，楊 帆，高建平，姚文娟，李政廳，景 偉，曹健民，張春祥

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，甘肅 蘭州 730046）

近交系實驗動物由于遺傳背景清楚、基因均一、個體間差異小、科學(xué)實驗重復(fù)性強等，被譽為“生命天平”“活的試劑”，廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、免疫學(xué)和感染性疫病研究以及生物制品的質(zhì)量檢驗中，是科學(xué)技術(shù)研究和應(yīng)用的重要基礎(chǔ)和支撐條件。由于家豬體型壯大，在試驗操作、微生物的環(huán)境控制及飼養(yǎng)管理等方面均不方便，因此早在20世紀50年代美、德、法、日等國家就專門培育出十幾個小型豬品系（通稱Mini Pig）用于科學(xué)研究。我國在20世紀80年代對南方地方原始品種，如貴州香豬、西雙版納小耳豬、廣西巴馬豬、海南五指山豬等小型豬品系資源進行了挖掘和利用，培育實驗用小型豬，在近交系、SPF實驗用小型豬的培育與應(yīng)用方面取得了世界領(lǐng)先成果[1,2]。

合作豬（Sus scrofa）（Hezuo Pig），俗稱蕨麻豬、藏豬等，體型矮小，具有適應(yīng)高原環(huán)境、抗逆性強等特性，是我國珍貴的北方地方豬品種，但合作豬毛色雜、野性大、攻擊性較強，不符合實驗動物要求。如何在保證合作豬矮小基因穩(wěn)定遺傳的同時，培育單一毛色的純種豬品系是實驗動物化利用的前提和難點[1-3]。本研究擬通過全同胞或半同胞近交封閉繁殖，分離或淘汰不需要的遺傳特性，保留優(yōu)良遺傳特性，有針對性地篩選體型矮小和毛色單一的合作豬，建立符合實驗動物標準的近交系合作小型豬品系，可用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究和產(chǎn)品開發(fā)，填補高原型小型豬這一國際空白。

1 合作豬的基本特性與利用優(yōu)勢

合作豬又稱蕨麻豬，因采食蕨麻（Potentilla anserina）而得名，也稱藏豬或山豬，是甘肅、青海、四川、云南、西藏等省（區(qū)）藏族地區(qū)飼養(yǎng)的一種小型原始地方豬品種。合作豬主要分布在甘肅省西南部、青藏高原東部邊緣，中心產(chǎn)區(qū)在甘南藏族自治州的合作市以及周邊夏河、碌曲、卓尼等縣，因而1984年被定名為合作豬[4]。

1.1 品種形成環(huán)境與特點

合作豬的生存條件非常惡劣，長期生長在高寒氣候（最低氣溫-28℃，最高氣溫27.7℃，年平均溫度1～7℃，溫差較大）和低劣的飼養(yǎng)條件下（終年以放牧為主，采食蕨麻等牧草的根、莖、籽及農(nóng)作物的秸稈等），具有體質(zhì)結(jié)實、四肢健壯、性野、行動敏捷、鬃長和絨毛密生等特點。由于其地處偏僻山村，長期自繁自養(yǎng)封閉繁殖，未受外來血緣的影響，因此形成了一個遺傳相對穩(wěn)定、均一的原始地方豬種。但合作豬體型小、生長緩慢，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用價值不大。據(jù)2000年之前的不完全統(tǒng)計，甘南州“合作豬”的數(shù)量僅有6萬多頭，且大部分地區(qū)的合作豬已被雜交，豬種血緣混亂，致使這一珍貴種質(zhì)資源瀕臨滅絕，亟待保護[3][5,6]。近年來，隨著合作豬生物學(xué)價值和食用價值被重新認識，其優(yōu)秀的抗逆性和肉質(zhì)特征以及適于實驗動物化利用的優(yōu)勢，成為未來發(fā)展的方向。

1.2 品種基本特征

合作豬體型較小，性情野，行為機靈活潑[3][5,6]，毛色純黑的少，一般四肢、腹部、背部等部位為白色，被毛粗密而長，冬生棕色絨毛，鬃長且堅韌。初生仔豬背部毛色帶有棕黃色或褐色縱行條紋（松鼠背色），隨日齡增長而逐漸消失。合作豬頭窄長，呈錐形，嘴長而尖，犬齒發(fā)達，耳小向上直立，額無明顯皺紋，頸和體軀較短，胸較狹窄，背腰平直或微弓，后軀較前軀略高，臀窄而傾斜，四肢長短適中，健壯，跟系短而有力，蹄小堅實；乳頭4～6對，排列整齊。成年公豬體重約33.31 kg，母豬約34.84 kg。母豬4～5月齡開始配種，產(chǎn)仔數(shù)較少（平均3.6頭），繁殖率較低。合作豬日增重較低，約210.01 g/d，料肉比偏高，達3.51∶1。

1.3 實驗動物化利用前景

合作豬體型小，品種純，遺傳穩(wěn)定，易于微生物學(xué)質(zhì)量控制，由于分布在偏僻的高原地帶，很少受外來血緣的影響，一般未能進行雜交改良用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，因此保存了原始的、均一的矮小基因庫，且遺傳背景比較清楚，可培育出國內(nèi)外獨特的高原型小型豬新品系。目前培育成功的貴州小型豬（Guizhou Mini-pig）、版納小型豬（Banna mini-pig）、巴馬小型豬（Bama mini-pig）和五指山小型豬（Wuzhishan mini-pig,WZSP），均來自低海拔、高濕度及高溫度地區(qū)，合作豬則生長在截然不同的自然環(huán)境。

若能對合作豬進行實驗動物定向培育，使之保持體型小、抗病性強等特點，且具有其他品種的優(yōu)良繁殖性能，符合實驗動物科學(xué)的需要，如遺傳均一性、微生物可控性以及實驗可重復(fù)性等，可望培育成國際上更為理想的實驗小型豬品系，以滿足生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗以及對生命科學(xué)研究的需要，具有十分廣闊的應(yīng)用前景[3][5,6]。

2 合作小型豬的培育過程與遺傳控制

2004年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所從夏河縣等地引進2頭3～4月齡的1公1母仔豬（兄妹）和1母豬帶仔5頭（母豬全黑，約1～2歲；仔豬約20日齡，1頭為松鼠背，其余4頭為黑色或六端白即白蹄、白尾、白額頭），在蘭州進行異地適應(yīng)性飼養(yǎng)和觀察。按照“合作豬實驗動物化培育、近交系培育和SPF（Specific

pathogen Free）化培育”的三階段總體設(shè)想和長遠布局，在國家和甘肅省科技計劃的支持下，先后開展了中國合作小型豬實驗動物化培育及分子遺傳特性研究（1004TCYA001）、近交系合作小型豬的培育及其分子遺傳特性研究（1207TCYA025）、疫病易感型小型豬動物模型研究（2017YFD0501606）等項目，重點對其生活習(xí)性、生長發(fā)育、繁殖性能和抗病性進行觀察，同時采用現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)對其生長發(fā)育控制和免疫抗病關(guān)鍵分子進行遺傳特征研究與監(jiān)測，培育出了標準化的實驗合作小型豬，并在生命科學(xué)研究中推廣應(yīng)用。

2.1 實驗合作小型豬的培育

2.1.1 合作豬的馴化與適應(yīng)性培育 根據(jù)實驗動物學(xué)的質(zhì)量要求，制定了合理的合作豬飼養(yǎng)、馴化以及管理規(guī)范[7]，在非產(chǎn)地（蘭州市，海拔1 500 m，溫度15～28℃）進行了舍飼環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)（配合飼料自由采食和飲水），觀察其外貌特征及生活習(xí)性，并監(jiān)測合作豬的生長發(fā)育、生產(chǎn)性能和生理生化指標的變化。研究發(fā)現(xiàn)，合作豬在飼養(yǎng)和培育至F6～7代時，其野性逐漸消失，吻突變短，絨毛減少，體型鈍圓，毛色光亮，未因營養(yǎng)、環(huán)境優(yōu)越而出現(xiàn)體重、體型明顯增大的現(xiàn)象，為實驗合作小型豬的標準化培育提供了依據(jù)。

2.1.2 近交系合作小型豬的培育 按照近交系實驗動物遺傳控制標準（甘肅省地方標準DB62/T 4074-2019），采用“兄妹”或“父女”交配的方式進行近交繁育，追蹤性地觀察并監(jiān)測其外貌特征、生長發(fā)育及生產(chǎn)繁殖性能指標。經(jīng)封閉近交定向培育，已近交培育到F15～16代，其遺傳性狀日趨穩(wěn)定，初步建立了全黑、六端白、松鼠背和大黑白花合作小型豬4個近交家系的種群繁殖單元，總種群達50頭以上。同時制定、發(fā)布和實施了甘肅省地方標準《實驗用合作小型豬繁育技術(shù)規(guī)程》（DB62/T 2897-2018）、《實驗用合作小型豬遺傳質(zhì)量控制》（DB62/T 4074-2019）、《實驗用合作小型豬微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》（DB62/T 4075-2019）、《實驗用合作小型豬飼養(yǎng)環(huán)境和設(shè)施要求》（DB62/T 4076-2019）、《實驗用合作小型豬病理學(xué)檢查規(guī)范》（DB62/T 4360-2021）和《實驗用合作小型豬配合飼料要求》（DB62/T 4359-2021），以指導(dǎo)近交系合作小型豬的擴群繁殖與生產(chǎn)[7-12]。

2.1.3 封閉群合作小型豬的培育 對合作小型豬的培育是以近交小型豬的種群繁殖單元為基礎(chǔ)，嚴格根據(jù)封閉群的遺傳標準和要求，重點建立了六端白、全黑、松鼠背3個封閉群單元以擴展繁殖，種群60頭，生產(chǎn)提供800多頭實驗用合作小型豬，以用于生長發(fā)育分子遺傳特性研究、免疫和抗病特性研究以及疫苗質(zhì)量評估，進而探討作為實驗動物的可行性。通過一系列的實驗應(yīng)用，結(jié)果顯示，與商品豬相比，培育的合作小型豬具有清晰的遺傳背景、明確的微生物攜帶情況及基因純等特征，試驗結(jié)果均一、重復(fù)性好，適合作為感染、免疫機制以及疫苗質(zhì)量評價的靶動物模型[13-23]。

2.1.4 實驗合作小型豬的生產(chǎn) 按照實驗用合作小型豬的飼養(yǎng)繁殖標準以及飼養(yǎng)環(huán)境和設(shè)施要求、遺傳控制和微生物質(zhì)量控制標準，在甘肅省蘭州和靜寧兩地同時進行保種、培育和擴大生產(chǎn)。在飼養(yǎng)管理過程中，通常情況下不給豬群接種任何疫苗，這為培育和生產(chǎn)非免疫或SPF合作小型豬的培育和生產(chǎn)創(chuàng)造了條件。

2.2 合作小型豬的生理生化指標監(jiān)測與特征

2.2.1 生理指標監(jiān)測與特征 采集試驗豬外周血共92頭份，其中近交培育的合作小型豬58頭份，原產(chǎn)地合作豬34頭份。抗凝血用全自動獸用血液細胞分析儀，共檢測12項血液生理指標，分別為紅細胞數(shù)目（RBC）、白細胞數(shù)目（WBC）、紅細胞壓積（HCT）、血紅蛋白（HGB）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板數(shù)目（PLT）、紅細胞分布寬度變異系數(shù)（RDW-CV）、血小板分布寬度（PDW）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）。

近交培育的合作小型豬與原產(chǎn)地合作豬的血液生理指標比較顯示，除RDW-CV指標外，近交培育的合作小型豬大多數(shù)指標都高于原產(chǎn)地合作豬的指標，其中WBC指標存在差異（0.01≤P＜0.05），PDW和MCH指標差異顯著（0.001≤P＜0.01），HGB、HCT、MCV、RDW-CV、PLT、MPV、PCT指標差異極顯著（P＜0.001），RBC和MCHC指標差異不顯著。

2.2.2 生化指標監(jiān)測與特征 采集試驗豬外周血共92頭份，其中近交培育的合作小型豬58頭份，原產(chǎn)地合作豬34頭份。血清經(jīng)過全自動生化分析儀共檢測16項血液生化指標，分別為總蛋白（TP）、白球比（A/G）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、鈣（Ca2+）、無機磷（P）、尿素氮（BUN）、淀粉酶（AMY）、葡萄糖（GLU）、膽固醇（CHOL）、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酸激酶（CK）、肌酐（CRE）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素氮/肌酐比（BUN/CRE）。

將近交培育的合作小型豬與原產(chǎn)地合作豬的血液生化指標進行比較，結(jié)果顯示，近交培育的合作小型豬的ALB、A/G、Ca2+、AMY高于原產(chǎn)地合作豬，而P、CHOL、TBIL、BUN/CRE、ALT酶含量指標低于原產(chǎn)地合作豬。其中ALB、Ca2+、P、AMY、CHOL指標差異極顯著（P＜0.001），A/G、TBIL、BUN/CRE指標差異顯著（0.001≤P＜0.01），TP、GLO、GLU、BUN、ALT、ALP、CRE、CK 8項指標無顯著差異。

近交培育的合作小型豬已在低海拔地區(qū)繁殖15代左右，經(jīng)檢測，其生理、生化指標基本與原產(chǎn)地合作豬相似，但一些表征動物生存及適應(yīng)高原地區(qū)環(huán)境的重要指標升高，說明近交培育的合作小型豬仍然保持著原產(chǎn)地合作豬良好的異地生存適應(yīng)能力[24]。

2.3 合作小型豬遺傳穩(wěn)定性控制與特征

2.3.1 合作小型豬的染色體核型分析與特征 隨機無菌采集近交系合作小型豬（公、母各半）的抗凝血，37℃恒溫培養(yǎng)68～72 h，在終止培養(yǎng)前2～3 h加入秋水仙素溶液使細胞分裂停止在中期，在顯微鏡下觀察細胞染色體的形狀、數(shù)目和核型。證實合作小型豬體細胞染色體為2n=38（性染色體以X、Y表示，故用XX代表母豬，XY代表公豬），共19對，其中合作小型豬常染色體18對，性染色體1對，與原產(chǎn)地合作豬以及其他相關(guān)報道相同。根據(jù)染色體的相對長度、著絲點指數(shù)和臂比，將18對常染色體分為A、B、C、D 4個形態(tài)組，分別用1～18號標記合作小型豬的染色體核型，其中A組由5對（1～5號）染色體組成，屬于近中著絲點染色體（sm）；B組由2對（6～7號）染色體組成，屬于近端著絲點染色體（st）；C組由5對（8～12號）染色體組成，屬于中著絲點染色體（m）；D組由6對（13～18號）染色體組成，屬于末端著絲點染色體（t）。性染色體X、Y染色體均屬于中著絲點染色體，X染色體大小介于8號、9號染色體間，Y染色體是最小的中著絲點染色體，較易辨別。合作小型豬染色體核型特征基本與其他豬種相同。

2.3.2 合作小型豬的生長激素基因與遺傳特征與動物生長發(fā)育和控制有關(guān)的分子較多，其中生長激素是控制動物生長發(fā)育的關(guān)鍵分子，故在基因組DNA和RNA水平對其生長激素基因進行分子結(jié)構(gòu)、多態(tài)性和遺傳特征研究。

2.3.2.1 合作小型豬生長激素基因組的結(jié)構(gòu)特征。從合作小型豬基因組DNA中可擴增出1 671 bp的豬生長激素基因序列，全長包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，外顯子1、2、3、4和5的堿基數(shù)依次是10 bp、161 bp、117 bp、162 bp和201 bp，內(nèi)含子1、2、3和4的堿基數(shù)依次是244 bp、210 bp、192 bp和277 bp，外顯子和內(nèi)含子間的剪切序列符合GT-AG規(guī)則。合作小型豬生長激素功能基因全長651 bp，推測編碼216個氨基酸的前體蛋白，成熟蛋白由190個氨基酸殘基組成，屬于分泌性蛋白。與參考序列比對，外顯子中取代和缺失的堿基數(shù)合計為4 bp，內(nèi)含子中取代和缺失的堿基數(shù)合計為15 bp，說明內(nèi)含子的序列多態(tài)性大于外顯子[25,26]。

2.3.2.2 合作小型豬生長激素功能基因的多態(tài)性特征。為探討合作小型豬的遺傳多態(tài)性，選擇GenBank中豬生長激素基因序列14條作為參考序列，與合作小型豬的5條生長激素基因序列進行比較，其多態(tài)性主要表現(xiàn)在內(nèi)含子1有1個轉(zhuǎn)換和1個顛換，內(nèi)含子2有2個轉(zhuǎn)換，說明合作小型豬個體間的差異可能與其內(nèi)含子的關(guān)系更密切。合作小型豬與其他14種豬之間在編碼區(qū)和非編碼區(qū)共檢測到核苷酸變異155個，其中內(nèi)含子中有119個，外顯子中有28個，5'端有8個。在所有的核苷酸變異中，其中顛換104個，轉(zhuǎn)換14個，缺失23個，插入14個。在出現(xiàn)的堿基取代位點中，大多數(shù)是顛換型突變，顛換與轉(zhuǎn)換之比為7.43∶1，存在顛換偏移現(xiàn)象。對合作小型豬生長激素基因同源性和趨異性進行分析發(fā)現(xiàn)，合作小型豬與國內(nèi)其他小型豬同源性較近，與大型豬同源性較遠。15種豬生長激素基因遺傳演化分析表明，合作小型豬與Vize豬有較遠的親緣關(guān)系，與貴州榕江香豬親緣關(guān)系最近[27,28]。

2.3.3 合作小型豬的遺傳演化關(guān)系與特征

2.3.3.1 合作小型豬與其他豬種群間的遺傳演化關(guān)系。用9個（SW769、S0005、SW781、SW1653、SW1032、MN006、MN004、SW1876和SW1355）微衛(wèi)星DNA座位對5個豬群體（合作小型豬以及蘭州、武威、臨洮和青海4個雜種豬群）的125個個體的平均等位基因頻率、遺傳距離DA、標準遺傳距離DS，主成分PC1、PC2、PC3值進行遺傳檢測。研究結(jié)果表明，5個豬群體共檢測到148個等位基因，所有豬群體等位基因數(shù)在55～100個間，其中青海豬群中最多為100個；合作小型豬群中最少為55個，說明青海豬群多態(tài)性高，合作小型豬群多態(tài)性低。其次，合作小型豬群體與蘭州白雜豬群體不但遺傳距離值最大（DA=0.678 1），而且標準遺傳距離DS值仍最大，達到1.331 2。主成分分析顯示，PC1、PC2和PC3分別占比62.17%、16.89%和10.94%，其中第1主成分PC1與合作小型豬有較大的正相關(guān)，與其他呈較大的負相關(guān)，它代表合作小型豬；第2主成分PC2與蘭州白雜豬有較大的正相關(guān)，與其他呈負相關(guān)，它代表蘭州白雜豬群體；臨洮、青海和武威等3個雜種豬群體在PC1、PC2坐標中具有較近的距離，表明臨洮、青海和武威這3個雜種豬群體有相似的主成分。這些結(jié)果說明合作小型豬群體在遺傳上遠離蘭州白雜豬群體，更遠于臨洮、青海和武威3個雜種豬群體，沒有杜洛克、長白、約克夏等西方豬血緣，是一群比較理想的自繁群體[27,28]。

2.3.3.2 合作小型豬與原產(chǎn)地豬群間的遺傳演化關(guān)系。用10個（S0005、S0009、SW769、S0218、CGA、SW240、SW72、SW857、S0355、SW24）微衛(wèi)星DNA座位對近交培育14、15代的合作小型豬（松鼠背、全黑、大白花、六端白）與原產(chǎn)地合作豬群體共計55個個體（其中近交系合作小型豬35頭，原產(chǎn)地合作豬20頭）的等位基因數(shù)進行微衛(wèi)星短串聯(lián)重復(fù)序列標記技術(shù)（short tandem repeat，STR）遺傳檢測。研究結(jié)果表明，近交系合作小型豬群體不同家系的等位基因數(shù)平均為24個，原產(chǎn)地合作豬群體等位基因數(shù)為71個，其中近交系全黑、六端白家系豬群中等位基因數(shù)均最多為26個，大白花豬群中的最少為19個，松鼠背豬群中為25個，說明原產(chǎn)地合作豬群體的多態(tài)性高，而近交系合作小型豬群體的多態(tài)性低，且單一近交家系的等位基因數(shù)更少，高度純合，符合近交培育小型豬的遺傳特征。

總之，通過重點分析合作小型豬染色體核型及其生長激素基因的分子組成結(jié)構(gòu)和多態(tài)性，探討遺傳與營養(yǎng)和環(huán)境對合作小型豬生長發(fā)育控制的影響，初步證實了合作小型豬生長發(fā)育穩(wěn)定、體型小的特性，主要由遺傳基因控制，而非營養(yǎng)、氣候環(huán)境因素決定。

3 合作小型豬在抗病免疫研究中的應(yīng)用

機體對病原微生物感染的防御是由天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的，其中天然免疫在機體的非特異性抗感染免疫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是機體抵御病原感染的第一道防線。獲得性免疫是由T細胞和B細胞介導(dǎo)的針對病原成分而啟動的特異性細胞免疫和體液免疫應(yīng)答，發(fā)揮著重要作用?？衫靡雅嘤暮献餍⌒拓i對其抗病免疫關(guān)鍵分子，如主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex,MHC）或豬白細胞抗原（swine leukocyte antigen,SLA,Ⅰ類和Ⅱ類分子）、T細胞抗原受體（Tcell antigen receptor,TCR）以及模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）和細胞因子（cytokine）家族分子基因進行系統(tǒng)研究，探討其基因結(jié)構(gòu)組成、多樣性與抗病分子遺傳特征，從而為免疫抗病基礎(chǔ)研究提供理想的動物模型。

3.1 在豬天然免疫細胞因子中的研究應(yīng)用

機體免疫系統(tǒng)的應(yīng)答程度決定了其能否阻擋病原的感染，并阻礙感染的進一步發(fā)展，而其效應(yīng)機制主要是通過高活性多功能的小分子多肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白等細胞因子來實現(xiàn)，大多數(shù)細胞因子以旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌的形式發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。目前按其主要生物學(xué)功能分為白介素（interleukin,IL）、干擾素（interferon,IFN）、集落刺激因子（colony stimulating factor,CSF）等6大類。合作豬是適應(yīng)性和抗逆性較強的豬種，由于細胞因子是免疫抗病的主要效應(yīng)分子，因此從其抗病免疫相關(guān)的細胞因子研究入手探討合作小型豬與抗病的關(guān)系。

以合作豬為研究對象，通過建立刺激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增法、cDNA表達文庫法的克隆發(fā)現(xiàn)抗病免疫相關(guān)細胞因子基因的技術(shù)，先后克隆、表達和鑒定分析了豬白介素家族的IL-2、4、6、12、18基因[29-36]，豬干擾素家族的IFN-α/γ基因[37,38]，集落刺激因子基因CSF[39]，CD58（cluster of differentiation 58，CD58）基因[40]以及CD4/CD8分子基因等[41-43]，為高通量篩選和發(fā)現(xiàn)未知細胞因子或其他相關(guān)分子奠定了基礎(chǔ)。

3.2 在豬天然免疫模式識別分子中的研究應(yīng)用

由于模式識別受體是近20年來才發(fā)現(xiàn)和定義的與機體天然免疫最重要的、最直接的相關(guān)分子，目前已先后發(fā)現(xiàn)TOLL樣受體（Toll-like receptor,TLR）、RIG-I樣受體（RIG-I like receptor,RLR）、NOD樣受體（NOD-like receptor,NLR）、AIM2樣受體（AIM2-like receptor,ALR）、C型凝集素受體（Type C lectin like receptor,CLR）、胞質(zhì)DNA識別受體家族如cGAS（cGAMP synthase）等，故以這些模式識別受體及其信號途徑關(guān)鍵分子為重點，探討其與抗病的相關(guān)性。

以合作小型豬為模型動物，先后成功克隆、表達和分析了豬TLR2[44,45]、TLR3[46]、TLR7/TLR8[47,48]、TLR9[49]以及接頭分子MyD88基因[50]等，明確了其分子遺傳演化關(guān)系，揭示了其與天然免疫的關(guān)系；同時克隆、表達和分析了豬cGAS、RIG-I、DHX15、DHX16等受體的分子結(jié)構(gòu)特征與模式識別抗病毒作用[51]，為模式識別天然免疫分子機制研究以及免疫佐劑、抗病毒藥物的研發(fā)提供了依據(jù)。

3.3 在豬獲得性免疫相關(guān)分子MHC中的研究應(yīng)用

動物機體識別自我、排除非己成分以維持其正常生理活動和抵抗疾病的能力，與其主要組織相容性復(fù)合體（MHC）密切相關(guān)，其不僅控制著機體移植排斥反應(yīng)，還參與機體對內(nèi)（外）源性抗原的識別、結(jié)合，與機體獲得性免疫應(yīng)答有關(guān)。MHC分子在豬稱為SLA，其中經(jīng)典的SLAⅠ類和SLAⅡ類分子是其免疫相關(guān)的最重要的分子家族[52]。

以合作小型豬為研究對象，系統(tǒng)克隆和分析了豬MHCⅠ類/Ⅱ類分子中的SLA-1、SLA-2、SLA-3以及DRA/DRB、DQA/DQB的基因組13個（SLAⅠ類分子GenBank登錄號為FJ905829～FJ905834，SLAⅡ類分子為FJ905835～FJ905840）和功能基因14個（SLAⅠ類分子GenBank登錄號為FJ905817～FJ905822，SLAⅡ類分子為FJ905823～FJ905828），證實合作小型豬SLAⅠ類分子的基因組均由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成；而SLAⅡ類分子α、β鏈的外顯子和內(nèi)含子組成有差異，其中DRA和DQA由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，DQB由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，DRB則由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，明確了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子基因組的組成結(jié)構(gòu)[53,54]。

通過系統(tǒng)分析合作豬SLAⅠ類基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SLAⅠ類分子基因可分為5個功能區(qū)，其多態(tài)性位點主要集中在α1與α2結(jié)構(gòu)域，具有較多的單一核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms,SNP），其中核苷酸非同義置換位點數(shù)多于同義置換位點數(shù)。SLAⅠ類分子基因共有14個新的SNPs位點，其中SLA-2有7個，主要位于α2功能區(qū)；SLA-3有7個，主要位于α2和α3功能區(qū)。系統(tǒng)分析合作豬SLAⅡ類基因的結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)SLAⅡ類分子基因共有3個新的SNPs位點，其中DQB有2個位點，主要位于β1區(qū)，DRB有1個位點，主要位于β1區(qū)。這基本明確了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子功能基因的多態(tài)性和遺傳特征，針對這些遺傳特點重點分析了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子與抗原多肽、TCR、CD4/CD8結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)與特征，揭示了合作小型豬SLA分子與抗原多肽、TCR及CD4/CD8多分子識別結(jié)合的特異性和復(fù)雜性[55,56]。

3.4 在豬獲得性免疫相關(guān)分子TCR中的研究應(yīng)用

T細胞受體（T cell receptor，TCR）在機體獲得性細胞免疫過程中發(fā)揮著重要作用，但由于該基因的遺傳多樣性及結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，基于病毒感染或免疫特異的豬αβT細胞克隆化增殖研究在國際上尚屬空白[57,58]。

以合作小型豬為研究對象，開展了豬TCR分子基因結(jié)構(gòu)與復(fù)雜性研究，系統(tǒng)克隆和分析了TCRα基因108個[59]、TCRβ基因98個[60]、TCRγ基因15個和TCRδ鏈基因5個，共計226個功能分子基因，初步建立了“健康”豬αβTCR和γδTCR T細胞TCR基因庫。序列分析表明，豬α、β、γ、δ4種TCR亞基鏈都含有信號肽區(qū)、V區(qū)、D/J區(qū)和C區(qū)基因片段，但其亞基鏈間以及同一亞基基因序列組成都有所不同，這驗證了T細胞激活后能產(chǎn)生胚系發(fā)育和基因重排現(xiàn)象，證實了TCR基因的胚系發(fā)育、基因重排規(guī)律與其分子結(jié)構(gòu)多樣性的相關(guān)性。

用建立的豬CD8+、CD4+T細胞亞群TCR CDR3（complementary determining region 3，CDR3）區(qū)基因譜型分析技術(shù)，研究了臨床健康豬TCRα、β鏈CDR3的譜型種類和多樣性，發(fā)現(xiàn)大部分αβTCR家族中表達20個TRAV家族和TRBV家族。此外，其CDR3的譜型呈類高斯分布狀態(tài)，大多數(shù)含8種或更多長度不同的CDR3片段；同一個體不同的TRV家族CDR3出現(xiàn)頻率變化較大，但同一TRV家族不同個體的頻次并不完全相同。這些結(jié)果與αβT細胞的胚系發(fā)育、基因重排分子機制以及多樣性特征相一致[57,58]。

通過分析豬瘟C株疫苗毒感染特異的T細胞αβTCR表達規(guī)律及其結(jié)構(gòu)特征，明確了免疫后豬CD4+和CD8+T細胞TCRα鏈和β鏈的多樣性與克隆化動態(tài)規(guī)律，明晰了二次免疫后呈現(xiàn)克隆性擴增的TRAV和TRBV家族CDR3序列結(jié)構(gòu)特征，為豬瘟病毒抗原免疫機制研究提供了依據(jù)[23]。

克隆化的αβTCR家族CDR3區(qū)及全長基因的測序分析結(jié)果顯示，αβTCR家族的CDR3區(qū)含有經(jīng)典的分子結(jié)構(gòu)特征，如TRBV CDR3區(qū)存在保守的P-A-V氨基酸基序，TRAV CDR3區(qū)也具有保守的D-D-Y氨基酸基序，且CDR3區(qū)序列相同的基因表達頻率更高，可達50%以上。其次，克隆化αβTCR相同CDR3區(qū)的全長基因成員間的核苷酸序列相似度超過99%，表明這些克隆化αβTCR家族CDR3區(qū)的保守氨基酸基序有可能參與了豬瘟病毒特異抗原肽的識別和結(jié)合，為豬瘟多肽疫苗高通量篩選和開發(fā)提供了理論和技術(shù)依據(jù)[61]。

3.5 在豬疫苗免疫佐劑創(chuàng)制中的研究應(yīng)用

免疫佐劑是動物疫苗的主要組成部分，在增強疫苗抗原免疫原性和免疫保護效果方面發(fā)揮著多種作用。細胞因子是機體細胞分泌的一類具有高免疫刺激活性和調(diào)節(jié)作用的多功能小分子，可通過天然免疫和獲得性免疫的不同途徑與機制發(fā)揮免疫佐劑的效應(yīng)[62][19]。通過利用克隆表達的細胞因子或合成的CpG基序，以及構(gòu)建的重組質(zhì)粒及其組合作為豬用疫苗免疫佐劑，以培育的合作小型豬等為動物模型，開展了大量的免疫增強試驗研究，證實重組IL-4、IFN-γ、CpG DNA及其組合均能發(fā)揮免疫佐劑增強效應(yīng)[13-21]，先后獲授權(quán)發(fā)明專利5項，通過轉(zhuǎn)化應(yīng)用獲得5項省部級科技獎相關(guān)研究成果。

4 結(jié)論

本研究成功近交培育了合作小型豬4個近交家系和3個封閉群，證實其體型小的特性主要由遺傳基因控制，而非營養(yǎng)、氣候環(huán)境因素決定；合作小型豬群體內(nèi)等位基因數(shù)目少、重復(fù)次數(shù)高和遺傳穩(wěn)定，與其他豬群體間的親緣關(guān)系遠，是一群比較理想的、獨特的高原型近交群體；合作小型豬抗病免疫關(guān)鍵分子具有多態(tài)性和多樣性，表明其具有適應(yīng)各種惡劣的自然環(huán)境和復(fù)雜的病原微生物環(huán)境的抗病遺傳能力，這種遺傳特性適用于研究復(fù)雜的生命科學(xué)現(xiàn)象與機制，可滿足獸醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)對高原型動物模型研究和應(yīng)用的需要。