李欣 周倩 綜述 唐小葵 審校

肺癌每年新發(fā)病率約占全部腫瘤的12%，死亡人數(shù)占癌癥總死亡人數(shù)的20%左右，是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌治療的傳統(tǒng)方式是手術(shù)、化療、放療，隨著分子診斷的發(fā)展，靶向和免疫治療成為肺癌治療的新選擇，肺癌患者診斷后的生存率也逐漸提升。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的提出，肺癌的研究已逐漸深入分子層面，這有利于對(duì)不同患者進(jìn)行分層以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療。傳統(tǒng)的分子檢測(cè)在實(shí)體組織中進(jìn)行，但近年來(lái)基于血液的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）檢測(cè)已成為具有前景的檢測(cè)手段。

CTCs 是自腫瘤原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶脫落進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，因此，CTCs 基因表達(dá)和基因突變圖譜可以反映原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤成分[2]。與傳統(tǒng)組織學(xué)活檢相比，CTCs 檢測(cè)具有創(chuàng)傷小、可重復(fù)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，可動(dòng)態(tài)提供患者疾病信息。既往研究多局限于CTCs 計(jì)數(shù)，現(xiàn)在對(duì)于CTCs 的研究已深入基因組譜、轉(zhuǎn)錄組譜、蛋白代謝物如程序性細(xì)胞凋亡配體-1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）等成分，并且可進(jìn)行單細(xì)胞分析以描述腫瘤異質(zhì)性特征、進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)或建立CTCs 來(lái)源的異種移植物（cell-derivede xplants，CDX）模型以實(shí)現(xiàn)藥物篩選等[3-4]。本文將對(duì)CTCs 在肺癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展進(jìn)行論述，從指導(dǎo)治療、揭示轉(zhuǎn)移機(jī)制、評(píng)估PD-L1 表達(dá)等方面展開(kāi)。此外，同為液體活檢技術(shù)的循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）檢測(cè)，已成為檢測(cè)肺癌治療靶點(diǎn)的常用臨床手段，本文也將探討CTCs 與cfDNA 在肺癌診治中聯(lián)合應(yīng)用的價(jià)值。

1 指導(dǎo)肺癌藥物治療

1.1 細(xì)胞體外培養(yǎng)及CDX 技術(shù)與藥物

CTCs 作為完整的細(xì)胞，可在體外進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增以進(jìn)行臨床前藥物測(cè)試。Zhang 等[5]在1 例ALK 基因重排的肺腺癌患者中，對(duì)獲得的CTCs 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ALK 基因上的L1196M 發(fā)生耐藥性突變，進(jìn)一步對(duì)CTCs 進(jìn)行體外擴(kuò)增，比較兩種間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制劑（anaplastic lymphoma kinase-tyrosine kinase inhibitor，ALK-TKI）克唑替尼和塞瑞替尼的藥物敏感性，表明塞瑞替尼療效更突出。CTCs還可以在免疫缺陷小鼠中構(gòu)建CDX 模型，用于臨床前藥物測(cè)試及耐藥機(jī)制的分析。Lallo 等[6]通過(guò)CDX模型構(gòu)建了針對(duì)小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的臨床前模型，在CDX 模型中，多聚ADP 核糖聚合酶抑制劑奧拉帕利聯(lián)合Wee1 抑制劑AZD1775 的疾病控制時(shí)間較順鉑聯(lián)合依托泊苷更長(zhǎng)。CDX 模型為探究新的治療方法提供了機(jī)會(huì)，但CDX的成功構(gòu)建通常要求較高的CTCs 數(shù)量，常用于高侵襲性的SCLC，而在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的應(yīng)用較少，但Morrow 等[7]通過(guò)晚期NSCLC 患者的間質(zhì)性CTCs 成功構(gòu)建CDX 模型，這也證明了間質(zhì)CTCs 的致瘤性?？傮w來(lái)說(shuō)，CDX模型在藥物選擇及新藥物研發(fā)方面具有一定價(jià)值。

1.2 預(yù)測(cè)SCLC 化療耐藥性

SCLC 的化療耐藥是臨床治療的一大難題。Su等[8]對(duì)48 例SCLC 患者的CTCs 進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，依據(jù)拷貝數(shù)變異（copy number alterations，CNAs）建立評(píng)分系統(tǒng)以評(píng)估SCLC 患者初始化療療效。與高CNA患者相比，低CNA 患者在一線化療后無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）顯著延長(zhǎng)，表明不同CNA 水平的CTCs具有預(yù)測(cè)SCLC 患者的化療療效的潛能。同樣，Carter 等[9]從6 例化療耐藥及7 例化療敏感的SCLC患者中分離出88 個(gè)CTCs，對(duì)CTCs 進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，建立基于CNA 的化療耐藥預(yù)測(cè)模型，該模型在另外18 例患者的CTCs（112 個(gè)）和基于6 例SCLC 患者的CDX 中得到驗(yàn)證，根據(jù)CNA 將SCLC 患者分為化療敏感性或化療難治性，分組的準(zhǔn)確率達(dá)到83.3%。上述研究表明，通過(guò)CTCs 能發(fā)現(xiàn)不同患者間遺傳模式的差異，可用于探究產(chǎn)生藥物耐藥的機(jī)制，并推動(dòng)個(gè)性化治療的進(jìn)步。

1.3 預(yù)測(cè)肺癌預(yù)后

多項(xiàng)大型隊(duì)列研究均表明晚期肺癌患者中外周CTCs 的高基線計(jì)數(shù)及計(jì)數(shù)升高與預(yù)后不良相關(guān)[10]，并有薈萃分析表明，基線CTCs 計(jì)數(shù)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后顯著相關(guān)[11]。但由于不同CTCs 表型的預(yù)后不同，不同檢測(cè)方法制定的截?cái)嘀挡煌形磳?duì)CTCs 的截?cái)嘀颠M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，無(wú)法確保結(jié)果的可重復(fù)性。

2 揭示腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制

單細(xì)胞測(cè)序能深入探索細(xì)胞與細(xì)胞之間的異同，揭示特定CTCs 亞群與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。Ni 等[12]對(duì)肺癌患者外周血單個(gè)CTC 進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和測(cè)序，在肺腺癌和SCLC 患者中均發(fā)現(xiàn)來(lái)自相同患者的不同CTCs 展現(xiàn)出高度一致的全基因組拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），并且和同一患者的轉(zhuǎn)移腫瘤組織的CNV 一致，但區(qū)別于原發(fā)腫瘤。該研究還發(fā)現(xiàn)不同肺腺癌患者的CTCs 中CNV 具有高度的相似性。異質(zhì)性是惡性腫瘤的重要特征，在CTCs中觀察到的高度一致的CNV 模式提示，特定的CNV在腫瘤形成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。同樣，Gao 等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)，原發(fā)病灶腫瘤細(xì)胞的CNV 經(jīng)歷不同的中間狀態(tài)逐步積累，最終單個(gè)CTC 與轉(zhuǎn)移病灶組織表達(dá)相同的CNV 模式，這表明腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程存在基因組拷貝數(shù)變化的趨同選擇，有助于了解癌癥轉(zhuǎn)移機(jī)制。

不同表型的CTCs 的侵襲性也存在差異，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺癌中最重要的表型轉(zhuǎn)換，EMT 與腫瘤干性、侵襲性和治療抵抗相關(guān)[14]。通常認(rèn)為間充質(zhì)CTCs 在肺癌患者中與較差的預(yù)后及轉(zhuǎn)移相關(guān)[15]。但Fischer 等[16]在乳腺癌動(dòng)物模型中的研究提示，EMT 并非腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件，而是參與化療耐藥過(guò)程。Liu 等[17]構(gòu)建轉(zhuǎn)移性乳腺癌的同源性小鼠模型，研究結(jié)果表明以上皮細(xì)胞表型為主的CTCs 細(xì)胞亞型具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移和增殖能力。關(guān)于EMT 的研究仍在不斷深入中。

3 PD-L1 在CTCs 表達(dá)的臨床意義

根據(jù)KEYNOTE-024 試驗(yàn)結(jié)果，在PD-L1 表達(dá)≥50%且未發(fā)生肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變的ⅡB 至Ⅳ期NSCLC 患者中，帕博利珠單抗已獲批準(zhǔn)使用于PDL1 表達(dá)陽(yáng)性的患者[18]。但有研究者在臨床使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤活檢PD-L1 陰性患者也會(huì)受益于PD-1/PD-L1 抑制劑治療[19]，這說(shuō)明仍需要繼續(xù)探索更精準(zhǔn)的方法用以預(yù)測(cè)治療療效，而CTCs 作為細(xì)胞整體可對(duì)PD-L1 的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

從NSCLC 患者中分離的CTCs 評(píng)估PD-L1 表達(dá)是可行的，但由于檢測(cè)技術(shù)不同，PD-L1 在CTCs 的檢出率存在較大差異（23.0%~95.0%），已有多項(xiàng)研究表明，CTCs 中PD-L1 的表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)[20-23]，PDL1 表達(dá)陽(yáng)性的CTCs（PD-L1+-CTCs）基線數(shù)量高及治療后數(shù)量升高通常預(yù)示較差的預(yù)后。Dong 等[20]在114 例可手術(shù)的NSCLC 患者的研究表明，基線肺靜脈PD-L1+-CTCs 與預(yù)后不良相關(guān)。Boffa 等[21]在112 例NSCLC 患者的研究表明，基線時(shí)外周血PDL1+-CTCs>1.1 個(gè)/mL 患者的2年生存率為31.2%，而PD-L1+-CTCs≤1.1 個(gè)/ mL 的患者2年生存率為78.8%（P<0.01）。Kallergi 等[22]在30 例接受化療的NSCLC 患者中發(fā)現(xiàn)，基線PD-L1+-CTCs>3 個(gè)/mL 的患者PFS 較短（P=0.02）。同樣，Nicolazzo 等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在接受納武利尤單抗治療的患者中，PD-L1+-CTCs 數(shù)量增加與疾病進(jìn)展相關(guān)。PD-L1 在CTCs 的表達(dá)預(yù)示疾病進(jìn)展這可能與PD-1/PD-L1 介導(dǎo)的免疫逃逸有關(guān)。

該研究檢測(cè)了PD-L1 在接受納武利尤單抗治療的Ⅳ期NSCLC 患者中CTCs 的表達(dá)，在19 例患者治療前檢測(cè)出PD-L1+-CTCs，其中僅5 例在治療半年后獲得了臨床獲益。Guibert 等[24]對(duì)96 例接受納武利尤單抗治療的NSCLC 患者研究表明，高基線PD-L1+-CTCs（≥1%）的患者與CTCs 中未表達(dá)PD-L1 的患者相比，治療效果更差（68%vs.40%，P=0.04）。同樣，Kulasinghe 等[25]也未觀察到PD-L1+-CTCs 與免疫治療效果的相關(guān)性。目前的研究表明，CTCs 的PD-L1表達(dá)尚無(wú)法預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1 抑制劑治療療效，仍需要更多的研究探索PD-L1+-CTCs 與PD-1/PD-L1 抑制劑治療療效的關(guān)系。

4 CTCs 聯(lián)合cfDNA 應(yīng)用

cfDNA 是指游離于血液中的細(xì)胞外DNA，由于cfDNA 的檢測(cè)無(wú)需預(yù)先富集，已成為檢測(cè)肺癌治療靶點(diǎn)的常用臨床手段。但血漿中cfDNA 片段的大小分布表明，多數(shù)DNA 由凋亡細(xì)胞釋放[26]，且在一些良性疾病的血液中也能檢測(cè)到較高含量的cfDNA[27]，這可能會(huì)限制對(duì)治療耐藥的存活腫瘤細(xì)胞DNA 的檢測(cè)；其次，無(wú)法將特定的循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor-DNA，ctDNA）與對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行匹配，限制了腫瘤異質(zhì)性的評(píng)估。

與cfDNA 相比，CTCs 的檢測(cè)需要更多技術(shù)的發(fā)展，但CTCs 作為細(xì)胞整體，可以分析來(lái)自活性細(xì)胞的基因組譜、PD-L1 表達(dá)，并且可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或CDX 實(shí)現(xiàn)藥物篩選等。由于CTCs 檢測(cè)需要經(jīng)歷從血細(xì)胞中富集的過(guò)程，其檢測(cè)效能在很大程度上取決于檢測(cè)方法的敏感性，而不同技術(shù)平臺(tái)存在差異，尚需進(jìn)一步提升檢測(cè)技術(shù)。相信在檢測(cè)技術(shù)的支持下，CTCs 作為細(xì)胞整體在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展上將有更大的潛能。

Sundaresan 等[28]前瞻性地研究了對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）臨床耐藥的40 例晚期肺癌患者，分別檢測(cè)活檢組織標(biāo)本、CTCs、ctDNA 中T790M 的突變情況。結(jié)果表明T790M 突變陽(yáng)性率分別為63%、50% 和50%，組織與CTCs 中T790M 檢測(cè)一致率達(dá)74%，與ctDNA 的一致率為61%。將CTCs 聯(lián)合ctDNA 用于基因分型，發(fā)現(xiàn)14 例（35%）組織活檢不確定或T790M 陰性的患者存在T790M?；诖隧?xiàng)研究反映出的液體活檢與腫瘤活檢的差異，表明腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性[29]，同時(shí)也證明腫瘤活檢和CTCs、ctDNA 的互補(bǔ)作用，在未來(lái)可考慮結(jié)合ctDNA 和CTCs 以更全面篩選突變靶點(diǎn)。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

CTCs 技術(shù)發(fā)展最大的障礙是低效率以及無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)系統(tǒng)，技術(shù)的限制使其在臨床中的應(yīng)用不及cfDNA，在未來(lái)應(yīng)重視技術(shù)的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，并聯(lián)合應(yīng)用CTCs 和cfDNA 以提供更全面的信息[30]。

CTCs 計(jì)數(shù)與肺癌預(yù)后不良相關(guān)。目前CTCs 的研究已深入分子層面，各種技術(shù)不斷開(kāi)發(fā)被用于CTCs 的研究。CDX 的研究是具有潛力的發(fā)展方向，CDX 模型的建立使得體外篩選新的治療藥物成為可能，但對(duì)CTCs 的數(shù)量要求高，在NSCLC 患者中應(yīng)用仍有較大難度。近年來(lái)，單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展加深了對(duì)于腫瘤異質(zhì)性的理解，通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳方面的分析，有望為腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制研究及治療新靶點(diǎn)提供重要信息。但是單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)本身尚存在局限性，未來(lái)還需要單細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)。

檢測(cè)CTCs 的PD-L1 表達(dá)是可行的，但還需要更多的研究探索PD-L1+-CTCs 與PD-1/PD-L1 抑制劑治療療效的關(guān)系。有研究表明免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效可以通過(guò)基于ctDNA 的腫瘤突變負(fù)荷評(píng)估來(lái)預(yù)測(cè)[31]，但其有效性仍在評(píng)估中。

本文主要總結(jié)了分子層面的CTCs 檢測(cè)在肺癌個(gè)性化診療的潛在臨床意義。精準(zhǔn)醫(yī)療作為肺癌發(fā)展的趨勢(shì)，CDX 模型、單細(xì)胞分析及PD-L1 檢測(cè)等技術(shù)將是未來(lái)CTCs 檢測(cè)的重點(diǎn)發(fā)展方向。但技術(shù)障礙仍是阻礙其廣泛應(yīng)用于臨床的主要原因，因此標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)及技術(shù)效率的提升是亟待解決的問(wèn)題。