張 燕，韓 悅，周博宇，于龍政

（延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

羊大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的傳染病，臨床表現(xiàn)常見(jiàn)于腸炎，有時(shí)引起敗血癥和毒血癥，導(dǎo)致動(dòng)物急性死亡。由于該疾病的急性發(fā)作、快速死亡和無(wú)法治療，通常給養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。本文主要對(duì)延吉某養(yǎng)羊場(chǎng)的耐藥性大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，旨在為大腸桿菌的臨床診斷和有效控制提供理論依據(jù)。

1 發(fā)病情況

延吉某養(yǎng)羊場(chǎng)目前羊只存欄量為500只。從2019年9月3日開(kāi)始，每天有羊只死亡，且數(shù)量不斷增加。發(fā)病癥狀表現(xiàn)為腹瀉、流鼻涕、咳嗽，發(fā)病期間養(yǎng)殖戶用青霉素對(duì)病羊進(jìn)行治療，但療效并不明顯，隨后到延邊大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)送檢的患病羊鼻拭子涂布于麥康凱固體培養(yǎng)基，37℃需氧培養(yǎng)24 h。挑取部分生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，按照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌染色法對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。革蘭氏染色結(jié)果表明，分離菌為革蘭氏陰性無(wú)芽孢的直桿菌，兩端鈍圓，疑似大腸桿菌。將剩余部分菌落接種于液體培養(yǎng)基，觀察發(fā)現(xiàn)小凸起的圓形紅色菌落，其邊緣整齊，表面光滑。

2.2 生化鑒定

對(duì)分離菌株進(jìn)行單菌落劃線培養(yǎng)純化后，開(kāi)展吲哚試驗(yàn)及MR試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果均呈陽(yáng)性，并采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行發(fā)酵糖試驗(yàn)，結(jié)果表明分離菌能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖。將試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，符合大腸桿菌的生化特性，將該菌株命名為DC001株。

2.3 細(xì)菌菌落PCR鑒定

將保存的菌液作為模板，以1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'和27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'為引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，獲得約1 407 bp的片段，與預(yù)期大小一致。將PCR產(chǎn)物送往吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，表明分離菌與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）收錄的大腸桿菌序列（GenBank登錄號(hào)分別為KC136138、MF399285、MH671483、MK621243、MK691481、MK778500、MN557058）相似度在99.9%以上。

2.4 藥敏試驗(yàn)

通過(guò)K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離出來(lái)的細(xì)菌接種到普通瓊脂培養(yǎng)基上，并貼上常用的抗生素藥敏片，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)培養(yǎng)皿中各種抗生素藥敏片周?chē)志Φ拇笮?lái)篩選敏感的抗生素藥物。試驗(yàn)結(jié)果表明：分離菌對(duì)頭孢喹肟、萬(wàn)古霉素敏感，對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星中度敏感，對(duì)青霉素、氨芐西林、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、螺旋霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明均耐藥。

3 臨床診斷及治療

結(jié)合臨床癥狀、相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果，診斷該羊場(chǎng)出現(xiàn)連續(xù)羊只死亡的原因?yàn)橹虏⌒源竽c桿菌感染，因此選用頭孢喹肟對(duì)癥治療。按照2 mg/kg體重頸部肌肉注射，每天用藥1次，連續(xù)治療2 d后病情得到了緩解，治療5 d后病情得到了控制。

4 討論

羊大腸桿菌病病原屬腸桿菌科，埃希菌屬中的大腸埃希菌，此菌在羊腸道內(nèi)正常寄居，構(gòu)成固定的細(xì)菌群，當(dāng)羊正常生理機(jī)能受到破壞，羊腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致大腸桿菌的生物特性發(fā)生變化，由正常菌群轉(zhuǎn)變成致病菌群，對(duì)出生不久、抵抗力不強(qiáng)的羔羊更為明顯[1,2]。

本試驗(yàn)對(duì)病羊的鼻拭子進(jìn)行了分離純化和細(xì)菌傳代培養(yǎng)，從形態(tài)學(xué)和生化特征上判定為大腸桿菌，并通過(guò)16S rDNA PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，在分子水平上證實(shí)分離菌為大腸桿菌。由于大腸桿菌對(duì)人類具有傳染性，因此養(yǎng)殖戶應(yīng)避免與病羊密切接觸。

近年來(lái)，由于抗生素大范圍的不合理使用，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥譜、耐藥范圍、耐藥率及多重耐藥性都呈上升趨勢(shì)[3,4]。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：該分離菌具有廣譜的耐藥性，對(duì)試驗(yàn)中15種抗生素中的11種具有不同程度的耐藥性，且其中8種抗生素抑菌圈直徑為0。細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生和傳播是相當(dāng)復(fù)雜的，會(huì)受到所用藥物類型、藥物治療方案、動(dòng)物種類和管理模式影響。因此，在使用抗生素預(yù)防和治療疾病時(shí)，應(yīng)遵循相關(guān)原則，并考慮各種因素對(duì)耐藥性產(chǎn)生的影響，以提高臨床效果。

大腸桿菌是條件病原體，廣泛存在于動(dòng)物有機(jī)體的內(nèi)部和外部環(huán)境中。當(dāng)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）飼養(yǎng)管理、疾病防控工作落實(shí)不到位時(shí)，羊群抵抗力下降，很容易受內(nèi)源性或外源性因素的影響而感染大腸桿菌[5]。該羊場(chǎng)已建多年，多種設(shè)施老化陳舊，且9—10月份季節(jié)更替，早晚溫差較大，都可能是本次疾病暴發(fā)的原因。