張飛 牛瑞芳

促紅細胞生成素誘導肝細胞受體（erythropoietinproducing hepatocyte receptor，Eph）是目前已知的受體型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）中最龐大的家族，人類基因中包括EphA（EphA1-A8 和EphA10）和EphB（EphB1-B4 和EphB6）兩個亞家族共14 個成員[1-3]。與Eph 受體相結合的配體被稱為Eph 家族受體相互作用蛋白（Eph family receptor-interacting protein，Ephrin），其中與Eph A 相結合的配體主要為Ephrin A1。該家族成員與經典RTK 如表皮生長因子受體EGFR 的配體EGF 相比，具有一個明顯的不同之處，即Ephrin 均為定位在細胞膜上的分子，是一種非可溶性配體。表達Eph 受體的細胞通過與鄰近細胞的膜結合配體Ephrin 相結合。因此，Ephrin-Eph 家族介導的信號傳導依賴于細胞間的直接接觸[2-5]。生理情況下，該家族介導的信號傳導通路在調控胚胎發(fā)育和維持組織內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[6]。Ephrin-Eph 信號系統(tǒng)的失調與包括腫瘤在內的多種疾病的發(fā)生密切相關，目前在多種腫瘤中發(fā)現Eph 受體的表達異常，其中EphA2 表達升高與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系最為密切[1-4]。本文主要針對EphA2 的結構、參與介導的信號傳導通路以及在乳腺癌治療耐藥中的作用進行綜述。

1 EphA2 的結構及作用機制

人EphA2 蛋白由EPHA2 基因編碼，該基因定位于第1 號染色體短臂3 區(qū)6 帶（1p36），全長約31 768 bp，包含17 個外顯子，編碼蛋白的全長包含976 個氨基酸，分子量大小約130 kD，成熟的EphA2蛋白主要定位于細胞膜[4]。EphA2 在結構上是一種典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)構成。其中胞外區(qū)由一個N 末端的配體結合結構域，緊接著一個富含半胱氨酸的區(qū)域和兩個串聯的纖連蛋白Ⅲ型重復結構域構成。而胞內區(qū)則由一個近膜結構域、酪氨酸激酶結構域、SAM 結構域和一個C末端的PDZ 結合基序構成[2-4]。由于EphA2 的配體Ephrin A1 是一種通過糖基磷脂酰肌醇鏈（glycophosphatidylinositol，GPI）錨定在細胞膜上的分子，因此Ephrin A1-EphA2 的結合發(fā)生在相鄰的兩個細胞之間[4]。配體與受體結合二聚化后再進一步形成異四聚體，激活EphA2 胞內區(qū)的酪氨酸激酶活性，繼而磷酸化受體上的酪氨酸殘基并介導下游信號傳導[3]。與經典RTK（如EGF-EGFR）通常只介導單向信號傳導不同的是，Ephrin A1-EphA2 的結合能夠觸發(fā)一種獨特的雙向信號傳導，即正向信號（由Ephrin A1 向EphA2 傳導）在表達EphA2 的細胞中傳導；而反向信號（由Eph A2 向Ephrin A1 傳導）則在表達Ephrin A1 的細胞中傳導[7]。這種雙向信號傳導模式是細胞之間接觸依賴性通訊的主要形式。此外，EphA2 還能介導不依賴Ephrin A1 的正向信號傳導。目前多數研究表明，依賴配體的正向信號傳導往往與EphA2 的酪氨酸激酶活性有關，而非依賴配體的正向信號通路則與其激酶活性無關[3-6]。最近的研究發(fā)現，EphA2 可以表達至細胞產生的外泌體上，能夠向遠距離傳遞信號，代表了一種非依賴細胞直接接觸的Ephrin-Eph 信號途徑的新機制[8-9]。EphA2 參與細胞內信號傳導的方式靈活多樣，說明其是一個多功能蛋白，提示了Ephrin A1-EphA2 信號系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有非常復雜的作用。

2 EphA2 在乳腺癌中的表達以及在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

在所有Eph 受體中，EphA2 在乳腺癌中的研究最受關注。多項研究發(fā)現，EphA2 在大約40% 的乳腺癌組織中表達升高，而且其陽性表達往往出現在三陰性乳腺癌和HER-2 陽性乳腺癌組織中[1-2，4]。臨床病理學參數的分析結果表明，乳腺癌組織中EphA2 表達增高與患者出現較多淋巴結轉移、組織學分級高、雌激素受體（estrogen receptor，ER）丟失和抗雌激素治療抵抗等密切相關。預后分析表明EphA2 表達升高與患者的總生存率（median overall survival，OS）和無復發(fā)生存率（relapse-free survival，RFS）呈顯著負相關；與此相一致，體外細胞學實驗和小鼠體內乳腺癌模型研究發(fā)現，EphA2 常在轉移能力較強的三陰性乳腺癌細胞中表達升高，而在低惡性度的乳腺癌細胞或正常乳腺上皮細胞中表達降低[10]。此外，最近有研究發(fā)現，乳腺癌耐藥細胞中EphA2 的表達顯著高于非耐藥細胞[8]。因此，上述結果表明EphA2 表達升高在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進作用。

多項研究發(fā)現配體Ephrin A1 在浸潤性乳腺癌組織中低表達，這一現象尤其體現在EphA2 表達較高的乳腺癌組織中[1，11]。同樣體外實驗也發(fā)現EphA2 表達高的乳腺癌細胞中，Ephrin A1 通常低表達甚至丟失。上述現象提示乳腺癌中EphA2 及配體Ephrin A1 的不平衡表達可能是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個關鍵機制[12]。目前不少證據均支持這一假設，如功能學研究發(fā)現恢復Ephrin A1 的表達能夠誘導細胞中EphA2發(fā)生內吞降解，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和腫瘤的生長；反之，Ephrin A1 表達丟失則能顯著促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。目前這個現象在其他多種腫瘤中均得到了證實，即EphA2 非依賴配體的正向信號通路激活能夠促進腫瘤發(fā)展；而依賴Ephrin A1 的正向信號通路激活則發(fā)揮抑制癌細胞增殖、侵襲和轉移的作用[13-15]。與此相一致，最近一項在乳腺癌中的研究發(fā)現，腫瘤組織中EphA2-S897 磷酸化增高（配體非依賴信號通路激活的標志）與乳腺癌患者RFS 和OS 降低顯著相關[16]?？傊鲜鲅芯繑祿С诌@樣一個結論，即配體Ephrin A1 表達丟失能夠減輕腫瘤抑制信號，從而促進EphA2 配體非依賴的促癌信號通路激活。

3 EphA2 促進乳腺癌耐藥

除了促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、血管生成和體內轉移外，近年的一系列研究還發(fā)現，EphA2表達升高與包括乳腺癌在內的多種腫瘤的治療敏感性降低密切相關[17-20]。如EphA2 高表達與乳腺癌內分泌治療抵抗、化療耐藥、分子靶向治療耐藥和免疫治療耐 受等有密切聯系。

3.1 EphA2 與乳腺癌內分泌治療抵抗

內分泌治療是臨床上激素受體陽性乳腺癌患者的主要治療方式，耐藥是導致患者死亡的重要原因。內分泌治療的主要作用靶點是ER，而ER 的突變或丟失是導致臨床上內分泌治療失敗的主要原因[21]。多項研究發(fā)現EphA2 表達增高與乳腺癌組織中ER 的丟失呈顯著正相關[16，22]；相應的現象也在體外乳腺癌細胞模型研究中得到了證實[23]。提示EphA2 的表達水平可能與乳腺癌患者的內分泌治療敏感性相關。體內外實驗同樣證實，乳腺癌細胞中EphA2 表達增高能降低細胞對雌激素的依賴程度，并提高細胞對他莫昔芬的抵抗能力；反之，封閉EphA2 的功能則能增強細胞對他莫昔芬的敏感性[23-24]。上述結果表明EphA2表達上調是導致乳腺癌患者內分泌治療抵抗的重要原因之一，而抑制EphA2 或聯合抑制EphA2 和ER的活性可能是一種逆轉乳腺癌患者內分泌治療耐受的策略[24]。

3.2 EphA2 與乳腺癌的化療耐藥

化療是所有類型乳腺癌治療最常用的手段，患者對化療的反應與其預后密切相關。多項研究發(fā)現，化療藥物阿霉素或紫杉醇處理乳腺癌細胞能夠誘導EphA2 表達升高，提示其可能為一個藥物反應基因[25-26]。最近一項研究發(fā)現EphA2 在多個乳腺癌耐藥細胞中表達升高，而親本細胞則低表達或不表達，提示EphA2 可能與化療耐藥有關[8]。相應的，抑制乳腺癌細胞中EphA2 的活性能顯著增強多種藥物的抗腫瘤效果[27-28]。類似的現象在卵巢癌、胰腺癌、肝癌和黑色素瘤等多項研究中也得到了證實[18，20，29-30]。這些結果說明EphA2 表達升高能夠降低乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性?；熌退幫c腫瘤細胞中多藥耐藥蛋白泵如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達升高有關[31]。有研究發(fā)現EphA2 能夠調控鼻咽癌細胞中P-gp 的表達[32]；而最近的研究也發(fā)現EphA2 與乳腺癌耐藥細胞中P-gp 的表達呈顯著正相關[8]。上述結果提示EphA2 可能通過調控多藥耐藥蛋白的表達促進乳腺癌細胞對化療藥物的抵抗。

3.3 EphA2 在乳腺癌分子靶向治療抵抗中的作用

近年的一系列研究顯示EphA2 表達升高與抗HER-2 分子靶向治療的耐藥密切相關[1，33]。如EphA2通過與HER-2 直接相互作用從而增強HER-2 信號通路的激活，并促進乳腺癌的發(fā)生和轉移[34]；EphA2 在HER-2 陽性乳腺癌組織中表達升高與患者的無病生存率和OS 降低密切相關[33]。體內外實驗證實EphA2 能夠通過促進谷氨酰胺代謝從而促進HER-2陽性乳腺癌細胞的生長[35-36]。此外，EphA2 在對抗HER-2 靶向藥物曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌細胞中高表達，而抑制其表達能夠恢復細胞對曲妥珠單抗治療的敏感性[33]。類似的結果同樣在HER-2 過表達胃癌的研究中得到證實，即抑制EphA2 能夠顯著逆轉抗HER-2 靶向治療的耐藥[37]。上述結果表明EphA2過表達是抗HER-2 治療耐藥的標志之一，而抑制EphA2 有望成為逆轉靶向HER-2 治療耐藥的一種策略[1，4，38]。

3.4 EphA2 在乳腺癌免疫治療中的作用

腫瘤免疫治療是基于激活患者自體免疫系統(tǒng)，殺傷腫瘤細胞從而治療癌癥的一種方式[39]。近年來，隨著免疫檢查點阻斷療法和嵌合抗原受體修飾的CAR-T 細胞療法的應用，免疫治療在多種腫瘤中取得了良好的效果，并展現了非常好的發(fā)展前景[40]。然而其在乳腺癌中的整體療效并不理想，如能尋找到增強乳腺癌免疫治療效果的靶點，將有助于改善乳腺癌的預后。最近一項臨床前研究中，采用靶向EphA2 的脂質體紫杉醇聯合程序性死亡受體-1（programmed cell death protein -1，PD-1）抑制劑能夠更加顯著地抑制乳腺腫瘤的生長，而且這種抑制效應具有非常好的持久性[41]。進一步研究發(fā)現，這種抗腫瘤效應與腫瘤組織中CD8+T 細胞的浸潤增多有關。相對比，單純采用紫杉醇聯合PD-1 抑制劑治療的小鼠中未觀察到T 細胞浸潤增多。該結果提示，腫瘤細胞中的EphA2 可能會抑制T 細胞浸潤，發(fā)揮免疫抑制作用。類似的一項研究發(fā)現，與EphA2 低表達的腫瘤相比，EphA2 高表達的腫瘤組織中T 細胞浸潤更少，顯示更強的免疫抑制微環(huán)境；敲除EphA2 能夠導致腫瘤中抗原呈遞基因的表達顯著上調，同時腫瘤組織中T 細胞浸潤增多，并對免疫治療的敏感性提高[42]。提示EphA2 上調是促進腫瘤內部免疫抑制的重要原因。此外，有研究表明EphA2 在腫瘤組織中表達升高還可能成為腫瘤免疫治療的新抗原，而且靶向EphA2 的CAR-T 細胞在臨床前研究中取得了良好的抗腫瘤治療效果[43-44]。另外發(fā)現，靶向EphA2 的單克隆抗體除了能夠封閉和降解EphA2 以外，還能通過激活抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）殺傷腫瘤細胞[45-47]。上述結果說明，靶向EphA2 不僅能夠殺傷腫瘤細胞，還能解除腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，促進免疫細胞的浸潤，增強免疫治療的效果。

4 結語與展望

近年來，隨著對EphA2 的功能和作用機制研究的深入，逐漸認識到EphA2 是一個在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮非常關鍵且具有復雜作用的分子。EphA2不僅有望成為一個預測乳腺癌治療效果的分子標志物，而且還很有可能成為一個治療乳腺癌的分子靶標。目前多項研究已經開發(fā)了多種靶向EphA2 的策略，并應用到包括乳腺癌在內的多種類型和不同階段惡性腫瘤的臨床試驗中，包括靶向EphA2 的單克隆抗體和小分子抑制劑類、基于EphA2 及其配體Ephrin A1 設計的小分子多肽類、可溶性Ephrin A1 蛋白和靶向EphA2的siRNA 等。上述藥物能夠通過降低EphA2 的表達、促進EphA2 降解和阻斷內源性EphA2 激活等多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，能夠特異識別和靶向EphA2 抗原的CAR-T 細胞已被設計出來并開始進行臨床試驗。另一種策略是將EphA2 的靶向抗體或多肽與細胞毒性藥物偶聯，這種方式能夠將抗體的特異性和細胞毒性藥物的殺傷作用結合起來發(fā)揮抗腫瘤作用[48-49]。一種具有發(fā)展前景的靶向策略是設計靶向EphA2 的納米載體，向腫瘤細胞運輸抗腫瘤藥物[41，50]。隨著上述各種治療策略研究的進展，基于EphA2 的分子靶向治療在乳腺癌中將具有非常好的發(fā)展前景。