歐陽(yáng)良良　袁育珺　汪紅

【摘要】 目的：觀察P53、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因在高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染宮頸上皮組織中表達(dá)情況，并分析P53、CyclinD1與HR-HPV感染的關(guān)系。方法：收集2019年1月-2020年12月于本院完成宮頸活檢的100例宮頸上皮組織標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室資料進(jìn)行回顧性分析。將其根據(jù)病變程度分為子宮頸癌組（n=47）、宮頸上皮內(nèi)瘤變組（n=27）及正常組（n=26）。比較三組P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與HR-HPV陽(yáng)性檢出率，分析P53、CyclinD1與HR-HPV的關(guān)系。結(jié)果：子宮頸癌組與宮頸上皮內(nèi)瘤變組P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、HR-HPV陽(yáng)性檢出率均高于正常組，且子宮頸癌組中P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、HR-HPV陽(yáng)性檢出率均高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組（P<0.05）。HR-HPV陽(yáng)性宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于HR-HPV陰性的宮頸上皮組織（P<0.05）。HR-HPV感染與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)均呈正相關(guān)（τ=0.459、0.565，P<0.05）。結(jié)論：HR-HPV感染與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1基因陽(yáng)性表達(dá)存在一定聯(lián)系。

【關(guān)鍵詞】 高危型人乳頭瘤病毒 P53 細(xì)胞周期蛋白D1 宮頸上皮組織

[Abstract] Objective： To observe the expression of P53 and CyclinD1 genes in high-risk human papillomavirus （HR-HPV） infection cervical epithelial tissues， and analyze the relationship between P53， CyclinD1 and HR-HPV infection. Method： The laboratory data of 100 cervical epithelial tissue specimens completed cervical biopsy in our hospital from January 2019 to December 2020 were collected for retrospective analysis. According to the lesion degree， they were divided into cervical cancer group （n=47）， cervical intraepithelial neoplasia group （n=27） and normal group （n=26）. The positive expression rates of P53 and CyclinD1 protein and the positive detection rates of HR-HPV were compared among the three groups， and the relationship between P53， CyclinD1 and HR-HPV was analyzed. Result： The positive expression rates of P53， CyclinD1 and positive detection rates of HR-HPV in cervical cancer group and cervical intraepithelial neoplasia group were higher than those in normal group， and the positive expression rates of P53， CyclinD1 and positive detection rate of HR-HPV in cervical cancer group were higher than those in cervical intraepithelial neoplasia group （P<0.05）. The positive expression rates of P53 and CyclinD1 protein in HR-HPV positive cervical epithelial tissues were higher than those in HR-HPV negative cervical epithelial tissues （P<0.05）. HR-HPV infection was positively correlated with P53 and CyclinD1 protein in cervical epithelial tissue （τ=0.459， 0.565， P<0.05）. Conclusion： HR-HPV infection has a certain relationship with the positive expression of P53 and CyclinD1 genes in cervical epithelial tissues.

[Key words] High-risk human papillomavirus P53 CyclinD1 Cervical epithelial tissues

First-author’s address： Eastern Hospital of Jiujiang University Affiliated Hospital， Jiujiang 332000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.22.006

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是引發(fā)宮頸癌的重要原因，特別是高危型HPV（high-risk HPV，HR-HPV）感染是宮頸癌病變最為重要因素，威脅女性生命安全[1]。研究顯示，宮頸上皮感染HR-HPV后可通過(guò)多種生物學(xué)途徑引起細(xì)胞生物學(xué)行為改變，進(jìn)而造成細(xì)胞癌變[2]。宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展過(guò)程中，HPV可長(zhǎng)期在宮頸相關(guān)細(xì)胞內(nèi)繁殖，促進(jìn)病變發(fā)展，導(dǎo)致病情加重，且HPV含量越高，感染越重，HR-HPV陽(yáng)性者宮頸病變程度較陰性者重[3]。可見(jiàn)，HR-HPV感染在宮頸癌發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，尋求HR-HPV感染在子宮頸癌病情變化中可能的分子機(jī)制十分必要。P53是一種重要的抑癌基因，可抑制DNA聚合酶功能，阻礙多核苷酸延伸，突變型P53基因可與細(xì)胞周期蛋白相結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增生，加速腫瘤發(fā)生、發(fā)展[4]。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）是一種原癌基因，通過(guò)與細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK）4或CDK6相結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)DNA轉(zhuǎn)錄，縮短細(xì)胞周期，加速細(xì)胞增殖速度，在腫瘤發(fā)展中具有一定作用[5-6]。推測(cè)CyclinD1、P53可能與HR-HPV有一定關(guān)系，相互作用促進(jìn)子宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展，但目前關(guān)于兩者與HR-HPV感染的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本研究主要觀察P53、CyclinD1與HR-HPV感染的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年1月-2020年12月于本院完成宮頸活檢的100例宮頸上皮組織標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室資料進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）子宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤病變符合文獻(xiàn)[7]中診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)病理學(xué)檢查確診;（2）患者入院前未經(jīng)化療或放療干預(yù);（3）病歷資料、本次研究所需實(shí)驗(yàn)室相關(guān)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并乳腺癌、胃癌等其他惡性腫瘤者;（2）合并肝腎功能不全者;（3）既往存在宮頸手術(shù)史或?qū)m頸病變史者;（4）伴血液系統(tǒng)疾病者;（5）凝血功能障礙者。根據(jù)病變程度將組織標(biāo)本分為子宮頸癌組（n=47）、宮頸上皮內(nèi)瘤變組（n=27）及正常組（正常炎癥，n=26）。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 HR-HPV檢測(cè)方法 用凱普無(wú)菌細(xì)胞采集刷取患者宮頸脫落細(xì)胞，液氮冷凍后保存在-80 ℃冰箱備用;取液氮冷凍的宮頸組織標(biāo)本，采用HPV-DNA分型檢測(cè)試劑盒（山東達(dá)安公司）測(cè)定宮頸組織標(biāo)本中HR-HPV DNA的含量，方法為第2代雜交捕獲法，首先采用分離法抽提DNA，而后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，最后進(jìn)行雜交檢測(cè)并判斷HR-HPV分型，共測(cè)定HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，13種HR-HPV，操作嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行;以標(biāo)本表達(dá)值相對(duì)光單位（RLU）/陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品閾值（CO）作為病毒負(fù)荷量，RLU/CO值越高，病毒負(fù)荷量越大;RLU/CO≥1.0則判定為HR-HPV陽(yáng)性，反之為陰性。

1.2.2 P53、CyclinD1蛋白表達(dá)檢測(cè)方法 常規(guī)石蠟包埋宮頸上皮組織，4 μm切片;90℃烤箱烤片15 min;常規(guī)脫蠟，進(jìn)行梯度乙醇脫水（100%、95%、80%、75%），沖洗酒精，置于蒸餾水中清洗，枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入P53、CyclinD1一抗4 ℃過(guò)夜;進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色（試劑盒均購(gòu)自北京夢(mèng)怡美生物科技公司），鏡下觀察可見(jiàn)黃色顆粒顯色，終止染色;蘇木精復(fù)染3 min，碳酸鋰返藍(lán)10 s;脫水及透明處理后，中性樹(shù)膠封片，以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，PBS為0.01 mol/L，pH=7.4。結(jié)果判定：P53、CyclinD1蛋白均表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色染色，每張切片于高倍（×400）鏡下選擇5個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞，取陽(yáng)性細(xì)胞占比的平均值。P53以陽(yáng)性細(xì)胞占比<10%為陰性（-）;陽(yáng)性細(xì)胞占比10%～25%為弱陽(yáng)性（+）;陽(yáng)性細(xì)胞占比26%～50%為中度陽(yáng)性（++）;陽(yáng)性細(xì)胞占比超過(guò)50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。CyclinD1以無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性（-）;陽(yáng)性細(xì)胞占比低于10%為弱陽(yáng)性（+）;陽(yáng)性細(xì)胞占比為10%～25%為中度陽(yáng)性（++）;陽(yáng)性細(xì)胞占比超過(guò)25%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，三組比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，若期望值<5，采用連續(xù)校正字2檢驗(yàn);等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn);宮頸上皮組織中P53、CyclinD1基因表達(dá)與HR-HPV的關(guān)系采用Kendall’s tau-b等級(jí)相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 正常組年齡35～65歲，平均（50.36±2.45）歲;身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）17.6～26.9 kg/m2，平均（22.36±1.21）kg/m2。宮頸上皮內(nèi)瘤變組年齡34～64歲，平均（50.48±2.41）歲;BMI 17.9～26.7 kg/m2，平均（22.45±1.17）kg/m2。子宮頸癌組年齡32～64歲，平均（50.12±2.50）歲;BMI 18.1～26.8 kg/m2，平均（22.33±1.18）kg/m2。三組一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 三組P53、CyclinD1蛋白表達(dá)情況比較 子宮頸癌組與宮頸上皮內(nèi)瘤變組P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常組，且子宮頸癌組中P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3 三組HR-HPV陽(yáng)性檢出率比較 子宮頸癌組、宮頸上皮內(nèi)瘤變組、正常組患者HR-HPV陽(yáng)性檢出率分別為93.62%（44/47）、40.74%（11/27）、15.38%（4/26）;子宮頸癌組與宮頸上皮內(nèi)瘤變組HR-HPV陽(yáng)性檢出率均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=45.497、4.197，P<0.001）;且子宮頸癌組HR-HPV陽(yáng)性檢出率高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=25.125，P<0.001）。

2.4 HR-HPV陽(yáng)性與陰性宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況比較 HR-HPV陽(yáng)性宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于HR-HPV陰性宮頸上皮組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.5 宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白表達(dá)與HR-HPV的關(guān)系分析 經(jīng)Kendall’s tau-b相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，HR-HPV感染與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)均呈正相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

盡管近年宮頸癌篩查及防治工作不斷進(jìn)展，但其發(fā)病率及病死率仍處于較高水平，且發(fā)病年齡趨于年輕化趨勢(shì)[8]。研究顯示，HR-HPV感染是宮頸癌發(fā)生重要原因，且抑癌基因失活、癌基因激活、DNA轉(zhuǎn)錄失控、細(xì)胞周期調(diào)控紊亂等均與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。宮頸上皮內(nèi)瘤變中HR-HPV感染不直接影響細(xì)胞生物學(xué)行為，常通過(guò)改變宿主細(xì)胞基因表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)作用，細(xì)胞中的原癌、抑癌基因均受到HR-HPV調(diào)控[11]。

P53是目前常見(jiàn)的抑癌基因，正常情況下，P53基因不穩(wěn)定，半衰期短，一旦細(xì)胞內(nèi)DNA受到異常刺激或損傷時(shí)，P53被激活，蛋白表達(dá)增加，半衰期延長(zhǎng)，參與致癌作用[12]。P53基因活化不僅使細(xì)胞停止在G1或者G2期，修復(fù)損傷細(xì)胞，還可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增生，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[13]。但P53抑癌功能常因突變而消失，當(dāng)P53功能失活，會(huì)使得受損DNA進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[14]。CyclinD1是原癌基因，在細(xì)胞周期中具有正調(diào)節(jié)作用，可與相應(yīng)的激酶結(jié)合形成復(fù)合物后，促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄，使得細(xì)胞發(fā)生分裂及增殖，增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)活力[15-16]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)CyclinD1表達(dá)異常時(shí)，細(xì)胞發(fā)生分裂及增殖紊亂，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及發(fā)展[17]。綜上推測(cè)P53、CyclinD1基因表達(dá)可能與HR-HPV感染有關(guān)，相互作用共同促進(jìn)宮頸癌發(fā)生及發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，子宮頸癌組、宮頸上皮內(nèi)瘤變組的P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、HR-HPV陽(yáng)性檢出率均高于正常組，且以子宮頸癌組最高，其次是宮頸上皮內(nèi)瘤變組;HR-HPV陽(yáng)性宮頸組織中的P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于HR-HPV陰性宮頸組織，說(shuō)明隨著子宮頸癌病變發(fā)展及HR-HPV的持續(xù)感染，P53、CyclinD1蛋白表達(dá)升高，推測(cè)HR-HPV感染與P53、CyclinD1蛋白表達(dá)有關(guān)。分析其原因可能為，HR-HPV的遺傳物質(zhì)可整合進(jìn)入宮頸上皮細(xì)胞的基因組DNA，引起多種基因表達(dá)異常，HR-HPV通過(guò)調(diào)控原癌、抑癌基因表達(dá)影響細(xì)胞生物學(xué)行為，促進(jìn)宮頸癌發(fā)展[18]。CyclinD1蛋白表達(dá)升高或基因擴(kuò)增時(shí)，CyclinD1-CDK復(fù)合物增加，促使細(xì)胞異常增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展[19]。P53過(guò)表達(dá)時(shí)，受損的DNA常進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[20]。為驗(yàn)證假說(shuō)，本研究進(jìn)一步做相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HR-HPV與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），證實(shí)上述假說(shuō)，提示HR-HPV感染可能與宮頸上皮組織中P53、CyclinD1蛋白表達(dá)有關(guān)，HR-HPV感染可能通過(guò)原癌及抑癌基因異常表達(dá)造成生物學(xué)行為改變，最終引發(fā)宮頸癌。未來(lái)可考慮通過(guò)阻斷P53、CyclinD1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)HR-HPV感染細(xì)胞凋亡。但目前關(guān)于P53、CyclinD1基因表達(dá)與HR-HPV感染關(guān)系的具體作用機(jī)制尚未明確，未來(lái)仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，子宮頸癌組織中P53、CyclinD1蛋白高度表達(dá)，且P53、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與HR-HPV感染存在一定聯(lián)系，P53、CyclinD1有望成為子宮頸癌基因治療的潛在靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2021-03-10） （本文編輯：田婧）