姚鵬飛，張鵬江，孫 楊

瘧疾是由瘧原蟲引起的蟲媒傳染病，在全球尤其是熱帶地區(qū)肆虐流行，每年約2.28億人發(fā)病，40.5萬人死亡[1]，嚴重威脅著人類的健康。目前，臨床常用奎寧和青蒿素類藥物對瘧疾患者進行預防和救治[2]，但是在瘧疾肆虐的國家，上述藥物不易獲得且價格昂貴，會給患者造成較重的醫(yī)療和經(jīng)濟負擔。此外，隨著藥物耐藥性增加，瘧疾的治療與防控效果也逐年下降，因此具有適應性和持久性的抗瘧疾疫苗成為研究熱點。目前，疫苗相關研究主要圍繞瘧原蟲生命周期不同階段或多個階段的生物分子抗原開展。因此，本文重點就瘧原蟲在人體內(nèi)發(fā)育過程的研究進展進行綜述，為瘧疾疫苗研發(fā)和瘧疾防控救治提供參考。

1 無癥狀紅細胞外期

1.1 子孢子接種 瘧原蟲感染的雌性按蚊叮咬人體后，通過唾液管注射唾液至皮下，產(chǎn)生局部麻醉效應并形成局部小血腫，位于唾液腺中的感染性子孢子與唾液一起注入皮膚真皮層。由于人體皮膚的分層結構，按蚊的喙部常刺入真皮層，但皮膚的厚度因部位不同，少部分子孢子也可能被注入表皮層或皮下組織。只有20%接種的子孢子能夠成功離開真皮層[3]。

1.2 子孢子遷移 感染的雌性按蚊唾液中含有γ干擾素誘導的巰基還原酶，其不利于子孢子遷移運動[4]。子孢子接種于皮膚后，必須離開皮膚遷移到血管才能成功轉運至肝臟繼續(xù)其生命周期，因此須要突破多個細胞屏障，包括皮膚成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、皮膚吞噬細胞以及肝竇狀隙的Kupffer細胞和肝細胞。子孢子能靶向肝細胞遷移，是因為肝竇組織及肝細胞表面含有高度硫酸化的硫酸肝素蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycans,HSPGs）[5]。子孢子離開皮膚依賴子孢子滑行運動和細胞穿越能力的兩種行為[6-7]。

滑行運動是一種基質依賴性運動，其特點是缺乏纖毛或鞭毛，并且沒有明顯細胞形態(tài)的改變[8]。滑行運動的關鍵分子是子孢子細胞表面跨膜蛋白——血小板反應蛋白相關匿名蛋白（thrombospondin-related anonymous protein,TRAP）家族，上述蛋白在區(qū)域構造上具有幾個共同特征，包括細胞外黏附結構域和胞漿結構域，其連接到肌動蛋白-肌球蛋白分子馬達[5]，子孢子必須黏附到基質或細胞上以提供拉力[8]。子孢子細胞外黏附域與基質結合，使分子馬達向后轉移TRAP，從而將子孢子向前推進。TRAP家族中最關鍵的蛋白是TRAP，因為靶向TRAP導致的突變，子孢子的運動方式或速度只發(fā)生輕微變化，但血管侵襲性和感染性顯著降低[6]。同樣，輻射減毒能夠消弱子孢子，調整其運動角度，影響移動速度，改變運動類型和方向[9]?；羞\動幾乎是任意方向，直到它們接觸血管內(nèi)皮細胞或者淋巴系統(tǒng)。子孢子遷移特征的研究有助于終止遷移運動抗體的研發(fā)[10]。

子孢子離開皮膚的另外一個關鍵特性是子孢子穿越宿主細胞的能力，這種能力對于子孢子從接種點遷移至肝細胞非常重要。細胞穿越包括活躍的子孢子進入宿主細胞，快速遷移通過細胞質，然后從宿主細胞膜排出等過程[11]。子孢子能夠穿越細胞依賴子孢子穿越微絲蛋白和穿孔素樣蛋白-1（perforin-like protein-1,PLP-1）。子孢子在不破壞宿主細胞膜的基礎上，通過封包于暫時性空泡（transient vacuoles,TV）內(nèi)穿越細胞，隨后子孢子利用pH敏感性和PLP-1自TV排出，避免了宿主溶酶體降解，達到逃避宿主細胞防御的目的[11]。研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除編碼子孢子穿越微絲蛋白的基因對子孢子穿越宿主細胞的能力具有重要影響[12]。

兩種活動類型表明，遠離血管真皮層的子孢子移動快且移動距離相對較大，鄰近血管處的子孢子活力受到限制，移動慢且路徑更加彎曲，但有利于與血管接觸[6]。上述過程中，僅部分子孢子到達目的地，大部分在真皮層被宿主自身免疫系統(tǒng)破壞清除；或者進入淋巴管，引流到達淋巴結，最終被吞噬清除。進入血管的子孢子快速被血流帶走，進入淋巴系統(tǒng)的則較緩慢。大約15%～20%的子孢子最終引流進入淋巴結，成為最初存活的子孢子，但其不能繼續(xù)發(fā)育至紅細胞期，將成為免疫反應的抗原。子孢子的靶向抗體顯著影響其在小鼠皮膚中的運動，證實子孢子是有效的疫苗靶點[3]。

1.3 子孢子入侵肝細胞 子孢子通過血流靶向HSPGs運輸?shù)竭_肝臟，通過感知肝竇狀隙血流環(huán)境，黏附到竇狀隙內(nèi)皮細胞。子孢子在TV內(nèi)穿越有孔內(nèi)皮細胞和巨噬細胞樣Kupffer細胞構成的竇狀隙屏障[13]，最后駐留在一個肝細胞中。穿越竇狀隙屏障對子孢子感染肝細胞很重要，因為它啟動了子孢子入侵肝細胞的過程。缺乏細胞穿越能力的子孢子不能達到血管，逐漸被吞噬清除[13]。細胞穿越需要的蛋白包括子孢子穿越微絲蛋白、PLP-1、動合子和子孢子細胞穿越蛋白、磷脂酶、配子逸出和子孢子穿越蛋白等[14]。

子孢子一旦跨過內(nèi)膜轉運至肝臟，就由“遷移模式”轉變?yōu)椤叭肭帜Ｊ健?。子孢子表?-半胱氨酸結構域蛋白P36是識別和有效入侵肝細胞的關鍵決定因素之一。惡性瘧和間日瘧分別與宿主細胞CD81受體和清道夫受體BI結合進而感染肝細胞[15]。鈣依賴蛋白激酶6激活轉換信號，通過結合肝細胞呈遞的HSPGs，降低了子孢子細胞穿越能力，促進了環(huán)子孢子蛋白（circumsporozoite protein,CSP）的分解，使子孢子轉換為肝細胞入侵模式[16]。CSP由一個高重復區(qū)和一個黏附性I型凝血酶敏感蛋白重復序列（thrombospondin repeat,TSR）組成。遷移過程中，CSP羧基端掩蓋了細胞黏附域，該域在唾液腺子孢子中也被掩蓋。接觸肝細胞時，CSP與HSPGs結合，激活CSP水解程序，CSP被瘧原蟲蛋白酶水解，移除羧基末端，暴露細胞器頂端TSR黏附域，進而附著在內(nèi)皮上，將遷移性子孢子轉化為侵入性子孢子[17]。到達肝細胞后不久，細胞的穿越活動就停止了，進入了生命周期的下一階段。

子孢子頂端微線體釋放蛋白P36和P52能與肝細胞肝配蛋白A2受體相互作用，形成納蟲空泡（parasitophorous vacuole,PV）[18]。無論哪種跨膜轉運方式，子孢子最終都在肝細胞中的納蟲空泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）內(nèi)。由于瘧原蟲駐留在PV中，從宿主細胞到瘧原蟲的營養(yǎng)運輸和從瘧原蟲到宿主細胞的信號傳遞變得復雜。瘧原蟲駐留在細胞內(nèi)PVM中，持續(xù)發(fā)育，直至肝細胞期結束。

1.4 肝細胞內(nèi)分裂增殖 子孢子進入肝細胞后，速發(fā)型子孢子第2 d開始DNA復制并進入分裂模式。經(jīng)過反復分裂，子孢子逐漸發(fā)育成為侵入性結構，稱為裂殖子，發(fā)育頂峰時每一個感染的肝細胞能夠釋放40 000個裂殖子。遲發(fā)型子孢子須經(jīng)過休眠期后才開始裂體增殖，這個階段的子孢子叫做休眠子，惡性瘧原蟲和三日瘧原蟲無休眠子。

PVM完全解體后，大量裂殖子釋放到宿主細胞細胞質，同時被宿主細胞膜包裝成充滿裂殖子的小囊泡（稱為微體），使瘧原蟲避開宿主免疫系統(tǒng)，尤其是在進入血液的過程中，避開了眾多的Kupffer細胞[19]。研究表明，肝細胞內(nèi)瘧原蟲排出需要半胱氨酸蛋白酶，因此靶向破壞半胱氨酸蛋白酶活性可以阻止瘧原蟲從肝細胞排出[20]。成熟的裂殖子稱為紅細胞外裂殖子，其進入血液后部分被吞噬細胞吞噬殺滅，部分侵入紅細胞定居于PVM內(nèi)發(fā)育增殖[21]。

2 有癥狀紅細胞內(nèi)期

2.1 裂殖子入侵紅細胞 裂殖子釋放到血液循環(huán)中后，游離裂殖子以快速、動態(tài)、多步驟的過程侵入紅細胞[22]，由此進入瘧原蟲紅細胞內(nèi)期。瘧原蟲裂殖子結構包括稠密顆粒、微絲、棒狀體以及這些細胞器分泌的多種蛋白，比如活性酶二肽氨基肽酶[23]、紅細胞結合樣蛋白家族[24]、RhopH復合體[25]，上述結構或蛋白有利于裂殖子侵入并附著紅細胞。裂殖子通過表面蛋白1將裂殖子附著于紅細胞，頂膜抗原-1（apical membrane antigen-1,AMA-1）通過再定向作用，使裂殖子尖端與紅細胞膜并列，棒狀體頸部蛋白2與AMA-1相互作用，使裂殖子和紅細胞膜間形成緊密連接，最后裂殖子跨膜蛋白TRAP在肌動蛋白-肌球蛋白分子馬達產(chǎn)生的拉力下完全侵入紅細胞[26-27]。紅細胞期的疫苗能夠減慢裂殖子黏附侵入紅細胞，從而達到預防目的[28]。

2.2 裂殖子紅細胞內(nèi)繁殖 裂殖子從受感染的紅細胞中排出和侵入新的紅細胞，是瘧原蟲指數(shù)級無性繁殖的必要過程。在感染的紅細胞內(nèi)，瘧原蟲經(jīng)歷了裂殖的無性繁殖過程。侵入紅細胞不久，瘧原蟲變成擁有紅色核點和藍色環(huán)狀胞漿的環(huán)狀體，稱為早期滋養(yǎng)體。隨著發(fā)育長大，胞漿伸出不規(guī)則的偽足以攝噬血紅蛋白，最終形成晚期滋養(yǎng)體。未被利用的血紅蛋白分解成正鐵血紅素顆粒沉積在原漿內(nèi)呈棕褐色，稱為瘧色素。當宿主紅細胞營養(yǎng)耗竭時，裂殖子細胞器分泌不同的蛋白酶，促使PVM和紅細胞膜破裂[29]，瘧原蟲爆發(fā)性釋放并侵入新的紅細胞。一旦紅細胞期產(chǎn)生的瘧原蟲數(shù)量超過某個閾值（大約100/μl），瘧疾的癥狀就會出現(xiàn)。

2.3 瘧疾臨床發(fā)作過程 裂殖子通過體內(nèi)TNF-α和血糖水平的日常節(jié)律變化進行周期性生長發(fā)育。瘧原蟲幾乎于同時間點，以類似的速率發(fā)育并釋放裂殖子、解體的液泡和其他代謝產(chǎn)物[30]，瘧原蟲抗原成分的集中出現(xiàn)，誘導產(chǎn)生了大量促炎細胞因子和趨化因子，引起強烈的先天性免疫反應，導致瘧疾寒戰(zhàn)、高熱、頭痛等典型癥狀發(fā)作[31]。惡性瘧原蟲可以在感染紅細胞表面表達惡性瘧紅細胞膜蛋白-1分子，后者介導感染的紅細胞與宿主血管內(nèi)皮細胞受體結合，使感染的紅細胞沉積在重要臟器的微血管床上，導致肺、肝、腸、腦和胎盤血液循環(huán)障礙[32-34]。

在瘧原蟲的血液期，部分裂殖子在紅細胞內(nèi)經(jīng)3～6 代裂體增殖后，不再進行無性分裂，逐漸發(fā)育為雌性配子體或雄性配子體。配子體在人體內(nèi)可存活2～3個月，當人體再次被雌性按蚊叮咬后，病原體又傳播給按蚊，配子體繼續(xù)在按蚊體內(nèi)發(fā)育。因此，阻斷配子體傳播給蚊蟲可以有效控制瘧疾的傳播和感染[35]。

3 小 結

綜上所述，瘧原蟲在人體內(nèi)發(fā)育過程極其復雜，經(jīng)歷了瘧原蟲（即子孢子、裂殖子）人體紅細胞外、紅細胞內(nèi)入侵及發(fā)育等過程，瘧原蟲在各階段擁有不同的生物學特征，據(jù)此可以研究和開發(fā)阻斷瘧原蟲發(fā)育繁殖的藥物和疫苗，以達到高效控制瘧疾傳播目的。