王領(lǐng)弟綜述,楊洪艷審校

0 引 言

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾是真核生物最常見和最豐富的RNA表觀修飾，m6A修飾存在于很多物種中，占到了RNA堿基甲基化修飾的80%[1]。甲基化酶(METTL3/14/16、WTAP、RBM15、KIAA1429)、去甲基化酶(FTO、ALKBH5)和甲基化識別酶(YTHDF1-3、YTHDC1-3、hnRNP、elF3)是對m6A修飾至關(guān)重要的種關(guān)鍵酶，分別發(fā)揮著對mRNA甲基化的“編輯”、“消除”和位點“識別”的作用[2]。3種關(guān)鍵酶調(diào)控m6A的修飾是一種可逆的過程，影響RNA的代謝過程，比如剪切、核轉(zhuǎn)運、翻譯和穩(wěn)定性，進而影響下游分子機制的發(fā)揮，影響生物學(xué)功能[2]。

卵子發(fā)生、精卵結(jié)合及早期胚胎發(fā)育在人類生殖活動中至關(guān)重要[3]。卵母細胞進行減數(shù)分裂形成成熟卵細胞，與精子結(jié)合后的合子進行有絲分裂，在植入前發(fā)育成囊胚，這些過程中存在活躍的DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄與翻譯[4-5]，作為mRNA重要的調(diào)控因素，m6A在生殖過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，本文將綜述在卵子及早期胚胎發(fā)育過程中m6A調(diào)控的相關(guān)研究進展。

1 卵母細胞及早期胚胎發(fā)育與m6A

1.1 m6A參與卵泡及早期胚胎的發(fā)育在出生前，卵原細胞發(fā)育形成卵母細胞停留在減數(shù)分裂前期。進入青春期后受到激素、信號因子等刺激，生發(fā)泡期(GV期)的卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，完成第一次減數(shù)分裂，排出第一極體，進入第二次減數(shù)分裂并再次停留在第二次減數(shù)分裂中期(MII期)。排卵后在輸卵管中與精子相遇，恢復(fù)完成第二次減數(shù)分裂，排出第二極體，形成受精卵，精卵融合成后稱為合子[6-7]；合子進入卵裂期，經(jīng)過細胞增殖分裂，形成囊胚[8- 9]。m6A在細胞增殖過程中調(diào)控RNA的剪切、轉(zhuǎn)錄、降解等[10-11]，現(xiàn)有不少研究表明，m6A參與了卵母細胞的減數(shù)分裂過程，并且在早期胚胎發(fā)育過程中也呈現(xiàn)出動態(tài)變化，是影響生殖功能的重要因素。

在非洲蟾的卵母細胞中，檢測到GV期和MII期的卵母細胞中均存在大量m6A，從GV期發(fā)展到MII期，其卵母細胞中m6A總體修飾水平呈現(xiàn)下降的趨勢[12]。然而在雞的卵細胞發(fā)育過程中，從卵泡選擇前的小黃卵泡到發(fā)育至選擇后的最小排卵前卵泡，雞卵內(nèi)的m6A總體水平是上升的趨勢，與之前非洲蟾的研究結(jié)果相反[13]。在哺乳動物豬的卵母細胞研究中，發(fā)現(xiàn)m6A既存在細胞質(zhì)中，也存在與細胞核中，但是細胞質(zhì)中表達水平更豐富，與雞卵的研究結(jié)果類似，豬卵母細胞從GV期發(fā)育到MII期，m6A的整體水平是增強的，并伴有METTL3、WTAP和FTO的表達上調(diào)。當(dāng)使用甲基供體干預(yù)豬卵母細胞后，可以促進METTL3、METTL14、FTO及m6A水平的表達，但并不促進豬卵母細胞的成熟；而使用甲基化抑制劑則降低豬卵母細胞發(fā)育過程中m6A水平，并且阻礙卵母細胞成熟[14]。在小鼠的卵母細胞中，甲基化酶缺乏引起的m6A修飾降低，下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本在3′UTR和終止密碼子附近有較高的m6A峰和顯著的m6A峰富集，表明m6A修飾較多的轉(zhuǎn)錄本表達下降。以上研究均提示m6A修飾可能參與調(diào)節(jié)卵母細胞的發(fā)育過程[15]。

受精后的卵裂和早期胚胎發(fā)育，與前期減數(shù)分裂緊密相連，m6A修飾持續(xù)存在并且呈現(xiàn)動態(tài)變化。在果蠅的早期胚胎發(fā)育過程中，m6A總體水平被發(fā)現(xiàn)有先下降、后升高的波動變化，而在成年后果蠅的檢測中，卵巢中的m6A與其他組織相比，處于較高的修飾水平[16]。在斑馬魚的卵巢組織和早期胚胎中，也檢測到了m6A的大量表達，以斑馬魚未受精的卵細胞m6A修飾水平為基準(zhǔn)，從受精卵到早期胚胎中的m6A水平，表現(xiàn)出先升高、后下降、又回升的趨勢[17]。在小鼠中，m6A修飾水平降低的早期胚胎將不能終止其幼稚狀態(tài)，可能與m6A調(diào)控某些關(guān)鍵mRNA的異常表達相關(guān)，最終導(dǎo)致胚胎死亡[15]。這些均提示早期胚胎發(fā)育與m6A的表達有關(guān)。

1.2m6A對卵母細胞成熟以及胚胎發(fā)育相關(guān)基因及信號通路的調(diào)控m6A修飾在mRNA的5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)、編碼序列區(qū)(CDS)和3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)豐富度較高[18-21]。m6A對減數(shù)分裂、細胞增殖的作用，主要是通過調(diào)控相關(guān)基因、參與某些關(guān)鍵途徑來完成的。通過生物信息學(xué)分析m6A參與減數(shù)分裂和早期胚胎發(fā)育的相關(guān)通路，提示高甲基化轉(zhuǎn)錄本主要參與ErbB通路、孕酮介導(dǎo)的卵母成熟途徑、細胞周期途徑；低甲基化轉(zhuǎn)錄本可能參與RNA降解、DNA復(fù)制、核糖體途徑、剪接體途徑、戊酸磷酸途徑、糖酵解-葡萄糖途徑[12]。

m6A在雞卵巢內(nèi)卵泡的選擇過程中發(fā)揮作用：在雞的卵母細胞選擇過程前后，轉(zhuǎn)錄本的總體數(shù)量維持穩(wěn)定，但是m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本比例增加[13]；并且在選擇前卵泡中m6A在CDS區(qū)域更多，而在選擇卵泡中，m6A則富集在起始密碼子和終止密碼子區(qū)域更多，并且出現(xiàn)更長的外顯子片段，這種差異變化暗示動態(tài)變化的m6A可能參與了mRNA的剪切，促進相關(guān)轉(zhuǎn)錄本形成，進一步影響下游翻譯活動，參與調(diào)控卵泡的選擇過程[1, 13]。通過分析富集基因的功能，發(fā)現(xiàn)選擇后新出現(xiàn)的m6A富集基因多與“翻譯”“mRNA加工”“細胞增殖”等過程相關(guān)，而選擇后m6A顯著下調(diào)的基因多與“翻譯”“RNA剪切”相關(guān)，其中m6A降低的FGF2、FZD1和m6A增加的WNT9a，可能參與Wnt信號通路的調(diào)節(jié)導(dǎo)致下游信號變化，在卵泡選擇過程中起主要作用[13]。

m6A調(diào)控相關(guān)因子促進卵母細胞成熟及受精后早胚的細胞增殖。在非洲蟾的實驗研究中，發(fā)現(xiàn)動態(tài)變化的m6A修飾調(diào)控轉(zhuǎn)錄本翻譯和細胞分裂過程：Cyclin B2是一種重要的細胞周期蛋白，在減數(shù)分裂中起重要作用，是紡錘體形成過程中必不可少的[22]，Mos蛋白可能在MII期促進減數(shù)分裂的恢復(fù)[23]。在非洲蟾卵母細胞中，Cyclin B2和Mos的mRNA 3′UTR區(qū)m6A富集降低，3′UTR元件介導(dǎo)翻譯激活，使得其翻譯效率升高，m6A通過調(diào)節(jié)Cyclin B2及Mos的表達參與減數(shù)分裂活動，進而影響卵母細胞的發(fā)育[12]。此外，Cdt1的mRNA于CDS區(qū)的m6A修飾降低，可以促進有絲分裂DNA的復(fù)制，有利于細胞增殖以促進早期胚胎的發(fā)育[12]。另外，在豬的研究中表明，豬卵母細胞發(fā)育m6A相關(guān)基因有CDK1、ERK1、ERK2和Lin28[14]。CDK1作為MPF成熟促進因子，一方面可以促進染色體濃縮、核膜消失[22]，另一方面可以調(diào)節(jié)紡錘體形成和MII期停滯，是減數(shù)分裂中調(diào)節(jié)卵母細胞成熟的關(guān)鍵信號[24]；MAPK家族重要成員ERK1和ERK2，可以被磷酸化激活，激活后的ERK1/2通過調(diào)控下游因子促進微管蛋白形成紡錘體[24]。在豬卵內(nèi)的m6A水平下降，下調(diào)了CDK1和ERK1/2表達，改變了MII期MPF及MAPK這兩條關(guān)鍵通路傳導(dǎo)，引發(fā)紡錘體形成和染色體分離障礙，最終表現(xiàn)為卵母細胞成熟阻滯[14]。Lin28是高度保守的RNA結(jié)合蛋白，通過結(jié)合let-7家族microRNA前體或直接與mRNA結(jié)合，調(diào)控其翻譯和穩(wěn)定性，參與細胞多能性、葡萄糖代謝、配子發(fā)生等多個過程[25]，m6A下調(diào)Lin28表達量也減少，影響豬卵發(fā)育及后續(xù)的卵裂和胚泡發(fā)育形成[14]。

2 m6A相關(guān)酶的缺乏對卵泡發(fā)育及早期胚胎發(fā)育的影響

目前被廣泛認知的甲基化轉(zhuǎn)移酶有METTL3/14/16、KIAA1429、WTAP等，去甲基化酶為FTO和ALKBH5，甲基化識別酶有YTHDF1/2/3和YTHDC1/2/3等。甲基化轉(zhuǎn)移酶上調(diào)m6A，去甲基化酶則下調(diào)m6A水平，這兩類酶在細胞核內(nèi)發(fā)揮相反的作用[26]，也是m6A能夠動態(tài)調(diào)控卵母細胞減數(shù)分裂及早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵。甲基化識別酶定位甲基化的位點，有促進mRNA穩(wěn)定性、翻譯、降解、剪切、加工、出核等功能[27]。以上m6A相關(guān)酶共同調(diào)控卵泡及早期胚胎發(fā)育，任何一種酶的缺失都可能引起發(fā)育障礙。

2.1甲基化酶和去甲基化酶敲除的影響METTL3敲除影響斑馬魚卵母細胞的發(fā)育。在斑馬魚體內(nèi)條件性敲除METTL3后，與野生型比較，雌性突變體卵巢內(nèi)生發(fā)泡破裂發(fā)生率降低，成熟卵泡的數(shù)量顯著減少，導(dǎo)致產(chǎn)卵量大幅下降，甚至影響到產(chǎn)子后代雌雄比例，使得雄性比例上升[17]。這可能是因為METTL3缺失引起m6A在LHβ、NPR、IGF3、Star、3β-HSD和CYP19A1等基因上修飾不足，以及11-酮基睪酮和雌二醇的濃度下降，影響了促性腺激素和雌激素合成信號途徑，導(dǎo)致突變體的卵母細胞發(fā)育受阻[17]。

KIAA1429特異性敲除導(dǎo)致小鼠卵母細胞發(fā)育停滯。在小鼠卵母細胞中特異性敲除KIAA1429后，卵巢表現(xiàn)出體積的縮小、GVBD率降低、MII期卵母細胞缺乏、第一極體排除率降低、次級卵母細胞數(shù)量減少、顆粒細胞的數(shù)量減少等，可能與KIAA1429通過調(diào)控剪切因子SRSF3參與卵母細胞發(fā)育相關(guān)mRNA的選擇性剪切相關(guān)[15]。SRSF介導(dǎo)的PDLIM7外顯子包涵體已經(jīng)被證明對小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中維持適當(dāng)?shù)腉VBD至關(guān)重要[28]。并且KIAA1429與SRSF3和YTHDC1在促進外顯子增加方面有類似的作用趨勢[15]。

METTL3的敲除對于小鼠胚胎具有致死性。METTL3基因敲除小鼠，其植入前的外胚層細胞和幼稚胚胎干細胞在mRNAs中缺失m6A，m6A修飾影響mRNA的穩(wěn)定性，包括關(guān)鍵的促進多能干轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，以致胚胎的幼稚狀態(tài)不能被終止；Mettl3在體內(nèi)調(diào)節(jié)多潛能啟動和分化，純合缺失突變影響胚胎多能性及分化，胚胎著床后發(fā)生異常的族系啟動，最終引發(fā)胚胎死亡[29]。

在METTL16條件性敲除的小鼠雜交后代中，無法得到純合缺失的METTL16-/-小鼠，表明了METTL16缺失具有潛在胚胎致死性。研究在E2.5和E3.5期觀察到了所有基因型的早期胚胎，但是在E8.5和植入后的胚胎中完全沒有純合缺失的基因型，表明敲除METTL16后可以使胚胎發(fā)育到囊胚期，但是在著床前后發(fā)育停滯[30]。其機制與METTL16的缺失導(dǎo)致編碼SAM(SAM是細胞中甲基化的重要供體)合成酶的MAT2A mRNA下調(diào)有關(guān)[31]。

WTAP基因敲除的小鼠也具有胚胎致死性。WTAP突變體胚胎在E7.5期雖然可以形成胚外組織和內(nèi)臟前胚層，但不能分化為內(nèi)胚層和中胚層，胚胎發(fā)育停滯，最終死亡[32]。WTAP被認為在選擇性剪接、mRNA穩(wěn)定等方面發(fā)揮作用[32-33]。

顆粒細胞與卵母細胞發(fā)育相互促進，在人的卵巢顆粒細胞中分別使去甲基化酶FTO和ALKBH5基因沉默，結(jié)果提示FTO或ALKBH5的缺乏都會引起m6A水平上升，但FTO缺失會引起細胞增殖相關(guān)因子和激素相關(guān)因子如FOXL2、CYP191A、FSHR和AMH的表達量下降，使得顆粒細胞的細胞凋亡增多，進而抑制了卵母細胞發(fā)育及卵泡的成熟[34]。

2.2甲基化識別酶敲除的影響YTHDC1在卵母細胞及后續(xù)胚胎發(fā)育發(fā)揮重要作用。YTHDC1在卵母細胞的GV期表達量少，在MII期表達量顯著增加，YTHDC1與MII期之后的母體轉(zhuǎn)錄本活躍有關(guān)[35]。而在雌性小鼠中條件性敲除YTHDC1，發(fā)現(xiàn)YTHDC1的缺乏會引起3′UTR端廣泛的多聚腺苷酸化(APA)，APA是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控手段，可以調(diào)節(jié)3′UTR的長度來影響mRNA的剪切及穩(wěn)定性，YTHDC1敲除的小鼠卵母細胞內(nèi)發(fā)生廣泛的mRNA剪切缺陷，延長的3′UTR引起局部剪切變異，在細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)異常的mRNA積聚顆粒，影響卵母細胞發(fā)育[35]。此外，YTHDC1是唯一位于細胞核內(nèi)的m6A識別酶，YTHDC1缺失抑制了與SRSF6的相互作用，阻礙了SRSF3、SRSF7與NXF1的結(jié)合，使得前體RNA的加工和出核受阻，進而影響下游轉(zhuǎn)錄本的翻譯[35]。

YTHDC2在卵泡發(fā)育減數(shù)分裂中必不可少。研究表明，YTHDC2條件性敲除小鼠卵巢內(nèi)缺乏發(fā)育中的卵泡，缺乏DDX4生殖細胞標(biāo)記，在小鼠胚胎發(fā)育的第14.5-15.5天時，YTHDC2突變體小鼠胚胎卵巢內(nèi)卵原細胞并沒有像野生型一樣如期進入減數(shù)分裂期，僅能檢測到較少的減數(shù)分裂前期Sycp3標(biāo)記并僅出現(xiàn)減數(shù)分裂前期征象，表現(xiàn)出異常的染色質(zhì)濃縮[36]。此外，突變體卵巢內(nèi)生殖細胞不僅沒有進入減數(shù)分裂期，而且有絲分裂標(biāo)記物CyclinD1和pH3持續(xù)表達，表明缺乏YTHDC2可能是在進入減數(shù)分裂的前期發(fā)揮調(diào)控作用[36]。另有研究表明YTHDC2是與MEIOC結(jié)合形成復(fù)合物一起發(fā)揮促進減數(shù)分裂作用的，認為MEIOC是YTHDC2必不可少的伴侶蛋白[37]。

YTHDF2在早期胚胎發(fā)育中清除母源RNA方面發(fā)揮重要作用。YTHDF2在卵母細胞減數(shù)分裂的影響較小，但是引起mRNA 3′UTR區(qū)的m6A修飾轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)，從而促進母本mRNA的清除[38]。條件性敲除YTHDF2后的小鼠，雖然純合缺失的雌性小鼠有排卵發(fā)生，但是能夠發(fā)育到2個細胞期的合子數(shù)量減少[38]。YTHDF2敲除后在MII期無法識別靠近3′UTR端的m6A修飾，轉(zhuǎn)錄本數(shù)量下降，使得mRNA發(fā)生異常清除，從而影響到卵細胞的質(zhì)量，卵子質(zhì)量的改變進一步影響精卵結(jié)合后合子期的發(fā)育[38]。在斑馬魚敲除實驗研究中，證明斑馬魚早期胚胎中超過三分之一的母源mRNA上存在m6A修飾，這些mRNA之后會被YTHDF2調(diào)控清除，所以YTHDF2被敲除后，帶有m6A修飾的母源mRNA清除受阻，進而影響合子基因組的激活，使得這些胚胎無法及時開啟從母體向合子期的過渡，細胞周期發(fā)生中止，停在G2晚期或M早期，從而導(dǎo)致斑馬魚子代發(fā)育延緩[39]。并且應(yīng)用MO阻斷劑阻斷YTHDF2功能的驗證，與YTHDF2敲除的結(jié)果一致[39]。此外，有研究顯示YTHDF3也可能通過與YTHDF2合作加速m6A mRNA的降解[40]。

3 m6A及相關(guān)酶與女性卵巢衰老的關(guān)系

上述研究提示m6A及其相關(guān)酶的變化在女性卵母細胞發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，卵巢顆粒細胞(Granulosa cells，hGCs)是伴隨卵母細胞發(fā)生并且發(fā)揮促進卵泡發(fā)育作用的一類細胞，二者構(gòu)成卵泡的主體，維持著卵巢功能。研究收集早發(fā)性卵巢功能不全(POI)不孕癥患者hGCs，并獲取與輸卵管不通不孕癥患者的hGCs與之對照，分別檢測m6A水平，發(fā)現(xiàn)POI患者hGCs內(nèi)m6A水平升高，并且FTO下調(diào)，ALKBH5無顯著變化。通過基因沉默分別檢驗去甲基化酶FTO和ALKBH5沉默后對卵巢顆粒細胞的影響，發(fā)現(xiàn)FTO沉默后hGCs的m6A水平升高，而沉默ALKBH5則無明顯影響[34]。應(yīng)用環(huán)磷酸酰胺(CTX)建立的卵巢早衰小鼠模型實驗中，CTX抑制了卵巢內(nèi)FTO、YTHDC1和YTHDF1-3的表達，促進了METTL3、METTL14、KIAA1429的表達，卵巢內(nèi)m6A水平總體升高。進一步研究證明了化療藥物環(huán)磷酰胺(CTX)干預(yù)hGCs是一種行之有效的POI體外細胞模型，與正常hGCs相比，模型組m6A升高，與甲基化酶METTL3/14、KIAA1429上調(diào)、去甲基化酶FTO下調(diào)、甲基化識別酶YTHDF1/2/3及YTHDC1下調(diào)有關(guān)，與WTAP、RBM15、ALKBH5等酶無明顯相關(guān)[41]。CTX對甲基化識別酶的下調(diào)可能干擾了mRNA的剪切與出核運動，使得卵巢生殖細胞的發(fā)育受阻[41]。

總之，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶的上升、FTO的減少共同影響m6A修飾水平，影響卵巢功能。分析其原因，可能是m6A通過影響卵母細胞成熟相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，并且下調(diào)甲基化識別酶表達影響mRNAs轉(zhuǎn)錄后加工與出核運動，多途徑阻礙了卵母細胞及卵巢顆粒細胞的成熟和增殖，使得卵巢功能下降，最終導(dǎo)致不孕[34, 41]。

4 結(jié) 語

m6A的研究正在逐漸被報道，關(guān)于甲基化酶、去甲基化酶和甲基化識別酶三類關(guān)鍵的酶蛋白在m6A修飾中作用機制的研究探索日漸豐富，對于m6A機制本身的研究挖掘也不斷在更新中。對于編輯器、擦除器和讀碼器的功能繼續(xù)研究，將會進一步揭示m6A修飾的發(fā)生與維持機制。異常的m6A甲基化程度，包括m6A RNA甲基化酶識別酶、甲基化酶和去甲基化酶的缺失，可導(dǎo)致RNA的失效和各種疾病[42]。雖然關(guān)于m6A在生殖領(lǐng)域的研究還較少，且當(dāng)前研究結(jié)果存在爭議與矛盾點[42]，但綜合現(xiàn)有研究證據(jù)都提示了m6A在卵子發(fā)育和早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，具體的影響機制還亟待進一步研究。此外，m6A的測定技術(shù)也在不斷發(fā)展中，新技術(shù)升級改進對m6A領(lǐng)域的研究進展起到重要影響。隨著對m6A修飾的各方面研究逐漸增加，有望針對m6A修飾的研究挖掘出更多的規(guī)律，為生殖領(lǐng)域的研究帶來新的思路。