趙佳琳，王學(xué)晶，曹 希，孫 強(qiáng)

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1超聲醫(yī)學(xué)科 2乳腺外科，北京100730

根據(jù)全球癌癥(GLOBOCAN)統(tǒng)計(jì)報(bào)告，在全球范圍內(nèi)，乳腺癌約占所有女性惡性腫瘤的24.2%；僅2018年，乳腺癌在全球新發(fā)病例數(shù)約為209萬，其中約62萬患者死于乳腺癌[1]。在中國女性中，乳腺癌是發(fā)病率最高的癌癥，在癌癥相關(guān)死亡中排名第六，若按這樣的趨勢發(fā)展，預(yù)計(jì)到2021年，乳腺癌總發(fā)病例數(shù)將達(dá)250萬[2]。目前以乳腺癌的臨床病理分期及分子分型為基礎(chǔ)制定輔助治療策略已得到廣泛應(yīng)用，三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體均為陰性的乳腺癌，占所有乳腺癌的10%～17%，以發(fā)病年齡輕、分期晚、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)大、組織學(xué)分級(jí)高及組織病理學(xué)淋巴細(xì)胞浸潤密度高為特征，與其他亞型的乳腺癌相比預(yù)后較差[3]。TNBC預(yù)后差的原因主要是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移比例高，且復(fù)發(fā)后病情進(jìn)展快，由于缺乏明確的治療靶點(diǎn)，TNBC患者的治療選擇受限，因此研究TNBC的治療意義重大[4]。現(xiàn)有研究表明，乳腺癌的預(yù)后不僅受腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性影響，腫瘤間質(zhì)狀態(tài)也與之密切相關(guān)[5]。關(guān)于乳腺癌中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)，相關(guān)研究最早可追溯至數(shù)十年前，雖然乳腺癌最初被歸為非免疫原性腫瘤，但部分亞型的乳腺癌表現(xiàn)出高TILs水平。TNBC的特點(diǎn)是腫瘤免疫浸潤比例高，且TILs可能預(yù)測更好的化療反應(yīng)和生存結(jié)果[6]。隨著對TNBC免疫治療的探索，相關(guān)藥物也逐漸從前期試驗(yàn)走向臨床實(shí)踐。本文主要對TILs進(jìn)行總結(jié)，并對其在TNBC免疫治療中的進(jìn)展進(jìn)行闡述。

TILs相關(guān)概述

正常情況下，人體的免疫系統(tǒng)和免疫細(xì)胞維持在相對平衡的狀態(tài)，該平衡狀態(tài)一旦被打破，不僅可能引起一些感染性疾病，也可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，并影響患者的預(yù)后和治療效果。TILs是指存在于腫瘤癌巢內(nèi)及間質(zhì)中的以淋巴細(xì)胞為主的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群體，是機(jī)體應(yīng)對腫瘤、誘發(fā)免疫反應(yīng)的一種形式，位于腫瘤組織周圍，能殺傷腫瘤細(xì)胞、減少腫瘤的轉(zhuǎn)移[7]。

TILs的生物學(xué)特性早在20世紀(jì)40年代，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳腺髓樣癌的主要特點(diǎn)為大量的間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，即使腫瘤組織學(xué)分級(jí)高或伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，乳腺髓樣癌在系統(tǒng)治療后仍可有良好的預(yù)后[8]。多年研究表明，乳腺腫瘤浸潤免疫細(xì)胞由不同的細(xì)胞亞群構(gòu)成，包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及肥大細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞亞群與乳腺腫瘤的特異及非特異性免疫相關(guān)[9]。Gu-Trantien等[10]對乳腺腫瘤浸潤免疫細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)分類，其中T淋巴細(xì)胞約占75%，B淋巴細(xì)胞比例不到20%，單核細(xì)胞比例約為10%，而NK細(xì)胞及NK/T細(xì)胞則不足5%；TILs又可分為間質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(stromal TILs，sTILs)和上皮內(nèi)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(intra-epithelial or intra-tumoral TILs，iTILs)，前者位于腫瘤間質(zhì)而不與浸潤性癌細(xì)胞直接接觸，后者則為上皮內(nèi)或瘤內(nèi)浸潤細(xì)胞，與癌細(xì)胞直接接觸。

TILs的檢測方法目前最常使用基于免疫組織化學(xué)或免疫熒光的方法來檢測腫瘤組織中的TILs[11]，該方法使用石蠟包埋的腫瘤標(biāo)本做染色，并可用于研究回顧性分析的檔案標(biāo)本[12]，其優(yōu)點(diǎn)在于可利用大型臨床試驗(yàn)所獲得的患者資料進(jìn)行預(yù)后分析。單克隆抗體可用于檢測不同細(xì)胞亞群，如CD3+、CD4+、CD8+及FOXP3+淋巴細(xì)胞亞群[13]。近年來，組織芯片或組織微陣列技術(shù)(tissue microarray，TMA)及多重?zé)晒饷庖呓M織化學(xué)(multiplex immunohistochemistry，mIHC)也被用于TILs檢測，其中后者通過在同一切片上產(chǎn)生多個(gè)彩色信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)不同TILs亞群與腫瘤細(xì)胞共定位[14]。此外還可通過檢測TILs相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物來分析乳腺癌預(yù)后，如Schmidt等[15]研究證實(shí)，由腫瘤浸潤效應(yīng)B淋巴細(xì)胞表達(dá)的免疫球蛋白κC可能與乳腺癌預(yù)后相關(guān)。

由病理學(xué)家、腫瘤學(xué)家和免疫學(xué)家組成的國際免疫生物標(biāo)志物協(xié)作組(International Immuno-Oncology Biomarker Working Group)一直致力于制定TILs檢測的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，并于2014年發(fā)表了首部關(guān)于TILs檢測的國際指南[16]。在乳腺癌中，iTILs 的絕對數(shù)量較少、存在的區(qū)域范圍小、分布的異質(zhì)性明顯，且不易通過HE染色法觀察；而sTILs數(shù)量相對較多，易于觀察評(píng)價(jià)，且癌巢密度、形態(tài)等變化對sTILs 影響較小，因此目前協(xié)作組推薦以sTILs作為試驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用的主要指標(biāo)。此外，協(xié)作組近期研究證實(shí)了TILs檢測的可重復(fù)性，并努力減少因檢測者的觀察差異所帶來的不一致性，這些研究奠定了TILs成為乳腺癌生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)[17]。

上述檢測方法從技術(shù)方面并不復(fù)雜，基本上可在所有病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，但相較于目前常使用的其他乳腺癌生物標(biāo)志物(如激素受體等)，TILs的檢測要求較高，且強(qiáng)烈依賴病理學(xué)家的專業(yè)知識(shí)。Nederlof等[18]比較了病理學(xué)家們對iTILs、sTILs及6種免疫細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8+、CD20+、CD68+、FOXP3+)的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中sTILs檢測一致性最高，且高浸潤者檢測一致性優(yōu)于低浸潤者，由此建議在使用現(xiàn)有方法評(píng)估免疫浸潤時(shí)需格外謹(jǐn)慎，并強(qiáng)調(diào)必要時(shí)可在TILs檢測外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組及甲基化等標(biāo)準(zhǔn)化免疫特征分析。但顯微鏡下TILs計(jì)數(shù)和基于多組學(xué)評(píng)估的一致性、以及不同組學(xué)之間的相關(guān)性均存在很強(qiáng)的異質(zhì)性，目前臨床試驗(yàn)中仍以免疫組織化學(xué)檢測方法為主，尚需制定統(tǒng)一的國際標(biāo)準(zhǔn)，以定量和定性的方式結(jié)合多種方法(如免疫細(xì)胞的結(jié)構(gòu)化空間分布和細(xì)胞活動(dòng)的轉(zhuǎn)錄組信息等)，并根據(jù)免疫浸潤程度對腫瘤進(jìn)行分類，從而更準(zhǔn)確地闡明TILs在腫瘤進(jìn)展中的作用。

TILs與TNBC的免疫治療

TNBC的免疫治療淋巴細(xì)胞優(yōu)勢型乳腺癌(lymphocyte predominant breast cancer，LPBC)指sTILs或iTILs浸潤比例在50%或60%及以上(以不同臨床研究中各自定義為準(zhǔn))。TNBC在所有乳腺癌分型中淋巴細(xì)胞浸潤比例最高，這也從側(cè)面支持了其潛在免疫原性?，F(xiàn)有研究數(shù)據(jù)中TNBC中LPBC約占10%～20%，其中sTILs比例約為15%～25%，而iTILs比例則低于5%～10%。與其他分型乳腺癌相比，TNBC擁有更高的克隆異質(zhì)性、基因組不穩(wěn)定性及突變負(fù)荷量，理論上可能有助于刺激宿主對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答[19]。近年來，關(guān)于TNBC“分型而治”的理念逐漸被強(qiáng)調(diào)，Jiang等[20]通過全面分析465例原發(fā)性TNBC隊(duì)列的臨床病理、基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，將TNBC分為腔內(nèi)雄激素受體型、免疫調(diào)節(jié)型、基底樣免疫抑制型及間充質(zhì)樣型4種亞型，并在每個(gè)亞型中鑒定出相應(yīng)的治療靶標(biāo)或生物標(biāo)志物，其中免疫調(diào)節(jié)型TNBC的特點(diǎn)為TILs比例高，適用免疫治療且預(yù)后好。

TNBC因其生物學(xué)特性，除常規(guī)放化療之外治療選擇有限，出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后治療更為棘手。免疫治療可激活人體本身的免疫系統(tǒng)，依靠自身免疫機(jī)制殺滅癌細(xì)胞。乳腺癌細(xì)胞可隨著免疫細(xì)胞浸潤而發(fā)生增殖和凋亡，在這個(gè)動(dòng)態(tài)環(huán)境中腫瘤特異性抗原通過腫瘤浸潤抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)在主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子上表達(dá)，與T細(xì)胞受體結(jié)合激活抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(antigen-specific cytotoxic T cell，CTL)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡的腫瘤細(xì)胞被吞噬[21]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)在TNBC治療中逐漸被重視，如程序性死亡受體1(programmed cell death l，PD-1)、程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)等，近年來不僅被證實(shí)可能是潛在的預(yù)后標(biāo)志物，同時(shí)也是調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的治療靶點(diǎn)[22]。靶向PD-1/PD-L1的免疫療法作為新型治療方法，主要通過阻斷PD-1/PD-L1通路，誘導(dǎo)腫瘤凋亡及破壞免疫逃逸系統(tǒng)，達(dá)到殺傷腫瘤的目的。在乳腺癌治療領(lǐng)域，美國食品及藥物管理局已加速批準(zhǔn)首個(gè)針對TNBC的免疫治療方案，即阿特珠單抗(Atezolizumab)聯(lián)合紫杉醇(Abraxane)用于一線治療無法切除的局部晚期或轉(zhuǎn)移性PD-L1 陽性TNBC，為臨床治療提供了新的選擇[23]。

正常狀態(tài)下，機(jī)體免疫系統(tǒng)可以識(shí)別并清除腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中異常增殖的腫瘤細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞可通過不同策略抑制免疫系統(tǒng)來產(chǎn)生免疫逃逸。傳統(tǒng)放化療可能通過殺傷腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤特異性抗原釋放，刺激樹突狀細(xì)胞成熟，激活T細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。而ICIs可防止活化的T細(xì)胞失活，從理論上講，聯(lián)合治療可提高免疫系統(tǒng)的抗腫瘤能力，放療及化療還可能增加TME中TILs的浸潤，提高機(jī)體對ICIs的敏感性，聯(lián)合治療的有效性及安全性正逐漸被臨床試驗(yàn)證實(shí)。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞可能通過涉及多個(gè)免疫檢查點(diǎn)的信號(hào)途徑產(chǎn)生免疫逃逸，因此不同ICIs的組合可能提高免疫治療的有效性[21]。此外，ICIs聯(lián)合抗血管生成藥物也是目前的研究熱點(diǎn)。新生血管的生成在腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中意義重大，可能與腫瘤的免疫逃逸和耐藥性密切相關(guān)。抗血管生成治療可使腫瘤周圍血管趨于正?；龠M(jìn)TILs浸潤，減輕免疫抑制[22]。雖然目前初步的試驗(yàn)結(jié)果令人振奮，但聯(lián)合治療的適宜時(shí)機(jī)、合理方法和獲益人群仍然需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

TILs與PD-L1的檢測目前研究證實(shí)TILs是早期TNBC的預(yù)后因素，對接受ICIs單藥治療的患者同樣具有預(yù)測價(jià)值。現(xiàn)有研究主要集中在PD-L1陽性腫瘤患者的臨床獲益，但PD-L1既可在腫瘤微環(huán)境中的活化T細(xì)胞上表達(dá)，也可在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，既往試驗(yàn)中PD-L1的檢測標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，為達(dá)到相同的效果需要根據(jù)免疫標(biāo)志物的結(jié)果進(jìn)行分層分析[24]。北京協(xié)和醫(yī)院病理科及乳腺外科通過研究PD-L1在TNBC腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)，證實(shí)其在TNBC中預(yù)后價(jià)值不優(yōu)于TILs上的表達(dá)[25]?；谇捌诘难芯拷Y(jié)果[26]，美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)在2020年第2版乳腺癌管理指南中建議，對擬使用阿特珠單抗聯(lián)合白蛋白紫杉醇的TNBC患者進(jìn)行TILs上PD-L1表達(dá)的檢測，并將PD-L1陽性表達(dá)的閾值界定為≥1%。IMpassion130研究中TILs僅能預(yù)測PD-L1陽性腫瘤患者的ICIs療效，現(xiàn)有臨床試驗(yàn)將有望進(jìn)一步明確乳腺癌患者的免疫標(biāo)記物，并確定多維免疫分析是否優(yōu)于目前僅基于PD-L1的療效預(yù)測，從而定制更為精確的免疫療法[27]。

TILs與聯(lián)合治療目前針對ICIs對TNBC的治療研究已證實(shí)這些藥物的潛在價(jià)值，但單用并非效果最佳；IMPassion130研究中，ICIs與抑制有絲分裂的紫杉烷化療聯(lián)用的可能理由是，化療可能促進(jìn)腫瘤抗原的釋放和ICIs的抗腫瘤反應(yīng)[28]。同樣，聯(lián)合放療、靶向治療或其他免疫治療可通過產(chǎn)生和放大T細(xì)胞反應(yīng)和抑制免疫檢查點(diǎn)來促進(jìn)療效。此外，在其他實(shí)體瘤中證實(shí)有效的ICIs，也逐漸在乳腺癌中進(jìn)行研究；除前述CTLA-4外，還有T細(xì)胞上與PD-1共表達(dá)并抑制T細(xì)胞活化的淋巴細(xì)胞活化基因3分子(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，Tim-3)，以及增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤活性的共刺激受體等[29]。因TILs在TNBC腫瘤微環(huán)境中的存在已證明與治療反應(yīng)及生存改善相關(guān)，通過不同分子機(jī)制從特定腫瘤抗原中制備的腫瘤疫苗，可能進(jìn)一步提高TNBC的治療效果[7]。

TILs與精準(zhǔn)治療雖然IMpassion130研究結(jié)果證實(shí)免疫治療聯(lián)合化療的有效性，但免疫相關(guān)不良事件(immune-related adverse events，irAEs)同樣值得關(guān)注。最常見的irAEs包括惡心、疲勞及肌肉痛，還有結(jié)腸炎、肝炎和甲狀腺功能減退等。從成本效益的角度分析，免疫治療也并非目前晚期TNBC的一線選擇[30]。近日，由中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)專家委員會(huì)牽頭，制定肺癌相關(guān)ICIs治療的專家共識(shí)，以期指導(dǎo)國內(nèi)同行進(jìn)行更好的臨床實(shí)踐[31]。目前乳腺癌領(lǐng)域尚無相關(guān)共識(shí)，但為最大限度提高ICIs的有效性，并探索其在早期乳腺癌患者的價(jià)值，尚需進(jìn)一步研究以明確PD-L1等在腫瘤細(xì)胞和TILs上的表達(dá)、最佳陽性閾值界定及TNBC免疫微環(huán)境的全景[32]。目前正進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中，研究者們正探索預(yù)測免疫治療可靠的生物標(biāo)志物，除上述TILs浸潤比例及PD-L1表達(dá)外，還包括腫瘤突變負(fù)荷及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性[33]。隨著乳腺癌免疫治療的發(fā)展，將免疫基因表達(dá)及TILs納入預(yù)后模型，或有助于現(xiàn)有多基因檢測方法的發(fā)展[34]。

共識(shí)與爭議如前所述，NCCN指南中已有TNBC免疫治療的相關(guān)內(nèi)容，2019年St.Gallen大會(huì)中同樣進(jìn)行了針對預(yù)后生物標(biāo)志物的投票。關(guān)于TILs，66%的投票者推薦其作為常規(guī)病理報(bào)告內(nèi)容，但90%的投票者表示不會(huì)根據(jù)高TILs水平?jīng)Q定化療的適應(yīng)證，且只有28%的投票者所在機(jī)構(gòu)存在常規(guī)TILs檢測[35]。德國專家組在針對共識(shí)的評(píng)論中指出，目前尚無PD-1/PD-L1抑制劑在早期TNBC中應(yīng)用的成熟研究數(shù)據(jù)，因此德國專家組及79.2%的投票者不支持在早期TNBC中進(jìn)行常規(guī)的PD-L1檢測；但對于轉(zhuǎn)移性TNBC，91.5%的專家組成員支持進(jìn)行TILs上PD-L1的檢測[36]。但近期一項(xiàng)針對4個(gè)隊(duì)列的綜合分析結(jié)果顯示，在未接受系統(tǒng)治療的早期TNBC患者中，sTILs與組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，與其他臨床病理因素?zé)o關(guān)；高sTILs水平的患者預(yù)后更佳，且預(yù)后影響與其他預(yù)后因素?zé)o關(guān)。結(jié)合前期研究結(jié)果，無論是否有系統(tǒng)治療，sTILs都有望成為TNBC患者的良好預(yù)后指標(biāo)，并能幫助識(shí)別出可能避免化療的患者[37]。

問題及展望首個(gè)免疫治療藥物獲批是轉(zhuǎn)移性TNBC精準(zhǔn)治療的重要里程碑，但目前免疫治療相關(guān)問題仍亟待解決，如預(yù)測ICIs治療反應(yīng)和毒性的生物標(biāo)志物，確定治療的最佳方法及目標(biāo)人群，以及合并自身免疫性疾病和/或免疫抑制狀態(tài)患者使用的安全性等。隨著ICIs進(jìn)入乳腺癌領(lǐng)域，早期識(shí)別和及時(shí)管理irAEs，實(shí)現(xiàn)治療風(fēng)險(xiǎn)及臨床獲益的平衡是優(yōu)化預(yù)后的關(guān)鍵[38]。近期有研究指出，irAE可能預(yù)測PD-1抑制劑的治療效果，當(dāng)存在irAEs時(shí)，患者治療的應(yīng)答率從16.6%提高到82.5%，無病生存期從3個(gè)月延長到10個(gè)月，總生存期則從22個(gè)月延長至32個(gè)月[39]；提示irAEs可能預(yù)測免疫治療的應(yīng)答率，從而進(jìn)一步揭示免疫治療有效性的潛在生物學(xué)機(jī)制。此外，乳腺癌中TILs浸潤比例不高，既往研究認(rèn)為多數(shù)乳腺癌是免疫“冷”腫瘤，因此通過刺激TILs浸潤將“冷”腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”腫瘤的聯(lián)合治療策略，可能實(shí)現(xiàn)患者對免疫治療的持久應(yīng)答[21]。如上所述，研究者們以此為目的已進(jìn)行了多種嘗試，包括聯(lián)合化療、放療、靶向治療和癌癥疫苗等；乳腺癌免疫治療的結(jié)果取決于患者選擇和治療方案，提高免疫應(yīng)答及阻斷免疫逃逸可能實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。

綜上，TILs是一種易于重復(fù)檢測且價(jià)格低廉的生物標(biāo)志物，關(guān)于TILs的研究已初步證實(shí)其在免疫治療中的預(yù)后價(jià)值。研究者們目前積極探索TNBC的不同治療方案，從而為實(shí)現(xiàn)TNBC的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)，并優(yōu)化乳腺癌不同免疫亞型的治療策略。因腫瘤微環(huán)境中TILs可能與化療和免疫治療相關(guān)，如何使抗腫瘤的免疫殺傷效應(yīng)更好地在機(jī)體免疫系統(tǒng)中得以發(fā)揮，尋找提高TNBC免疫原性的聯(lián)合治療方法，以提高腫瘤對免疫治療的反應(yīng)性并使更多的患者受益，可能是這一領(lǐng)域未來的研究方向[40]。同時(shí)，高TILs水平最常見于TNBC的免疫調(diào)節(jié)亞型，對此類患者進(jìn)行多基因檢測，在早期TNBC患者中開展關(guān)于乳腺癌異質(zhì)性的研究，可能為早期TNBC的治療提供新思路。