王曉亞，安彥波，戴敏高，趙麗娜，劉軍肖，牛占叢

1 艱難梭菌與腸道微生態(tài)概述

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭陽性芽孢桿菌[1]，但它可以在有氧環(huán)境中存活。艱難梭菌定植于3%的健康成人和近80%的健康新生兒及嬰兒的腸道中，它屬于條件致病菌, 正常腸道菌群可以抵抗艱難梭菌的定殖和過度生長，而在長期大量使用抗生素的患者或其他免疫力低下的人群中，艱難梭菌會(huì)過度增殖并釋放毒素，引起以腸道病理損傷為主的感染性疾病，即艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection,CDI)[2]。艱難梭菌是引起抗生素相關(guān)腹瀉的最主要病原菌，可引起一系列疾病，如腹瀉、暴發(fā)性結(jié)腸炎、假膜性結(jié)腸炎、中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔、膿毒癥和多器官功能障礙，是醫(yī)院內(nèi)獲得性細(xì)菌感染及胃腸炎癥相關(guān)死因的首要原因，嚴(yán)重威脅住院患者的健康[3-4]，據(jù)報(bào)道，艱難梭菌感染病死率可高達(dá)6.9%～16.7%[5]。高毒力的艱難梭菌菌株(BI/NAP1/027型)[6]進(jìn)一步加劇了這一問題，使得艱難梭菌感染引起了更多的關(guān)注,該型菌株可引起暴發(fā)型結(jié)腸炎，病情進(jìn)展迅速，病死率高，預(yù)后差。在過去的十年中，由于與艱難梭菌感染相關(guān)的發(fā)病率、死亡率和醫(yī)療費(fèi)用的增加，艱難梭菌受到了新的關(guān)注[7]。

腸道微生態(tài)包含腸道微生物及其代謝產(chǎn)物。人體內(nèi)的微生物數(shù)量至少和人體細(xì)胞的數(shù)量一樣多[8]，這些微生物可存在于人體所有的粘膜部位。腸道是微生物數(shù)量最豐富的器官，由1 000多個(gè)不同的細(xì)菌種類組成，其編碼的基因數(shù)量是人體自身基因數(shù)量的數(shù)百倍，腸道菌群的總質(zhì)量可達(dá)1.5 kg[9-10]。腸道微生物分布廣泛、數(shù)量龐大，人體腸道內(nèi)定居著約一百萬億個(gè)微生物，并且其基因組含有參與膽汁酸代謝、碳水化合物發(fā)酵、氨基酸代謝等基因，在人體作用機(jī)制復(fù)雜，參與人體的多種生理及病理過程。腸道微生物與多種代謝、內(nèi)分泌、自身免疫和炎癥性疾病有關(guān)，并參與物質(zhì)代謝和營養(yǎng)合成[9-13]。了解腸道微生態(tài)的改變與艱難梭菌之間的聯(lián)系有望確定新的治療策略和生物標(biāo)志物，從而預(yù)測(cè)治療結(jié)果并提高診斷水平。

2 艱難梭菌致病機(jī)制

艱難梭菌在人體腸道內(nèi)定植主要分為產(chǎn)毒型菌株和非產(chǎn)毒型菌株，而產(chǎn)生致病作用的主要是產(chǎn)毒型菌株。艱難梭菌在腸道內(nèi)增殖并分泌毒素A(toxin A,TcdA)和毒素B(toxin B,TcdB)兩種毒素，TcdA是一種腸毒素，也有一定的細(xì)胞毒性作用，TcdB是一種細(xì)胞毒素，毒素B的毒力較毒素A強(qiáng)10倍[14-16]，毒素激活腸道宿主免疫，使中性粒細(xì)胞增加，并產(chǎn)生殺菌活性氧中間體、防御素、促炎細(xì)胞因子和趨化因子[17]，導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。這些毒素還通過多種通路與腸道上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，然后修飾Rho、Ras和Rap亞家族的小分子GTP酶，通過這一作用破壞腸道上皮肌動(dòng)蛋白骨架和緊密連接[18]，使真核細(xì)胞骨架崩潰，并對(duì)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，引起結(jié)腸炎癥等一系列病變。有些毒株還會(huì)產(chǎn)生由染色體上致病性決定區(qū)外的基因cdt A、cdt B編碼的二元毒素[19]，從而使艱難梭菌毒力進(jìn)一步增強(qiáng)。CDI 發(fā)病率和嚴(yán)重程度的增加在很大程度上歸因于一種新的艱難梭菌毒株的出現(xiàn)，即 BI/NAP1/027[20]，該菌株中TcdA和TcdB的產(chǎn)生增加，存在二元毒素，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一種重要毒素產(chǎn)生下調(diào)基因 tcd C的缺失，可能有助于艱難梭菌毒性增加[6]。

腸道微生態(tài)紊亂是艱難梭菌致病的另一個(gè)潛在因素。腸道微生態(tài)紊亂可能通過膽汁酸代謝、氨基酸代謝、碳水化合物發(fā)酵物等代謝物來增加艱難梭菌的致病性。腸道微生物對(duì)膳食纖維進(jìn)行厭氧發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)，當(dāng)SCFAs濃度下降時(shí)，pH升高，從而產(chǎn)生有利于艱難梭菌生長的環(huán)境[21]。初級(jí)膽汁酸可以促使艱難梭菌芽孢萌發(fā)[22]。另外一些研究表明，艱難梭菌的非毒素分子，特別是S層蛋白 (S-layer protein, SLP)，具有免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明艱難梭菌外蛋白質(zhì)組組成與艱難梭菌基因型相關(guān)，某些菌株分泌的特定蛋白質(zhì)可能與TcdA和TcdB的毒力增效有協(xié)同作用，生化分析表明，一種基因型為ST54_NAPCR1的菌株分泌的S層蛋白A(S-layer proteinA, SlpA)比其他菌株多，此外，ST54_NAPCR1菌株的SLpA具有較強(qiáng)的促炎活性[23-24]。

3 艱難梭菌感染的高危因素

多種危險(xiǎn)因素可以導(dǎo)致CDI，關(guān)于CDI的危險(xiǎn)因素的研究日益增多，但結(jié)論不盡相同，主要包括長時(shí)間住院、年齡大于65歲、免疫功能低下、使用抗生素治療和應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑等[23,25]。CDI的危險(xiǎn)因素與腸道微生態(tài)的改變有關(guān)。

3.1 抗生素 艱難梭菌感染通常與抗生素引起的正常腸道微生物區(qū)系多樣性喪失有關(guān)。正常情況下，腸道微生態(tài)在維持健康人體新陳代謝，免疫防御方面起重要作用[26]。引起艱難梭菌感染的抗生素，幾乎涵蓋了所有的種類，尤以第三代頭孢菌素、廣譜青霉素、碳青霉烯類等廣譜抗生素居多[27-29]。同時(shí)，CDI 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)取決于抗生素使用的頻率、持續(xù)時(shí)間、抗生素的給藥方式和使用藥物的劑型[30]。不同種抗生素產(chǎn)生了獨(dú)特的腸道微生物群落，增加一些促進(jìn)艱難梭菌生長底物的濃度，例如初級(jí)膽汁酸以及生長所需的甘露醇、果糖、山梨醇、棉子糖和水蘇糖等碳源使艱難梭菌得以定植[22, 31-32]。與健康人相比，接受抗生素治療的人的腸道微生物態(tài)顯示出微生物多樣性、均勻性和豐富度降低?？股貢?huì)改變腸道菌群的組成，包括腸桿菌科豐度增加和毛螺菌科、瘤胃球菌科、雙歧桿菌豐度的降低，影響微生物代謝，使艱難梭菌等增加[33]。另外，抗生素的使用會(huì)改變微生物的結(jié)構(gòu)和膽汁酸的代謝，進(jìn)一步啟動(dòng)艱難梭菌芽孢的萌發(fā)。此外，免疫系統(tǒng)和腸道微生物群之間信號(hào)通路的改變也可能導(dǎo)致抗生素暴露后對(duì)CDI的易感性增加。

3.2 年齡 腸道正常菌群是一種重要的天然防御機(jī)制，可抑制艱難梭菌的生長。多項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)分析提示年齡是CDI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[34-35]。老年人常合并基礎(chǔ)疾病、既往抗菌藥物史、自身免疫力和抵抗力降低等，故抵抗 CDI 的能力也明顯下降。年齡大于65歲的老年人，尤其是既往長期住院或長期處于療養(yǎng)院等醫(yī)療機(jī)構(gòu)的老年人應(yīng)該高度警惕CDI的發(fā)生。

3.3 質(zhì)子泵抑制劑 使用藥物(質(zhì)子泵抑制劑，PPIs)抑制胃酸的產(chǎn)生也會(huì)增加艱難梭菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。PPIs可以抑制胃酸的分泌，導(dǎo)致胃內(nèi)pH升高、胃酸保護(hù)屏障破壞，引起胃腸道系統(tǒng)的各類不良反應(yīng)，更加有利于艱難梭菌的定植。多系統(tǒng)評(píng)價(jià)表明,PPI的大量使用可以引起腸道微生態(tài)紊亂，誘發(fā)艱難梭菌感染[27, 36-37]。并且研究表明CDI的風(fēng)險(xiǎn)具有劑量依賴性[37]。因此，臨床上應(yīng)該注意PPIs的適應(yīng)癥和使用劑量，以降低CDI風(fēng)險(xiǎn)。

4 腸道微生態(tài)的定植抗性

腸道微生態(tài)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體抵抗艱難梭菌感染的屏障被破壞，同時(shí)艱難梭菌感染也會(huì)導(dǎo)致腸道微生態(tài)紊亂，進(jìn)而使腸道屏障功能下降甚至喪失，在腸道菌群被抑制的人群中細(xì)菌很容易定居并繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群。腸道菌群主要分為4個(gè)菌門:厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，健康的腸道微生物群主要以厚壁菌門及擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。艱難梭菌感染等因素可以破壞宿主腸道屏障和腸道菌群結(jié)構(gòu)，尤其是降低厚壁菌門和擬桿菌門的豐度。基因組分析顯示，艱難梭菌感染后腸道微生態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為物種多樣性和豐富度顯著下降，主要是擬桿菌門的擬桿菌科和厚壁菌門(Firmicutes)的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)減少[38]。腸道中可用于艱難梭菌萌發(fā)和生長的代謝物，主要受到厚壁菌門和擬桿菌門兩個(gè)優(yōu)勢(shì)門的強(qiáng)烈影響[22]。

腸道微生態(tài)的平衡和穩(wěn)態(tài)有助于宿主抵抗細(xì)菌、病毒和真菌感染，即定植抗性。腸道微生態(tài)定植抗性的機(jī)制主要包括以下4個(gè)方面。一是腸道菌群與病原體營養(yǎng)和空間競爭：細(xì)菌等病原體為了在腸道中定居，必須與高度適應(yīng)腸道環(huán)境的腸道微生物群爭奪相同的營養(yǎng)源。腸道微生物競爭性消耗和利用某些單糖等營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制艱難梭菌等病原體的繁殖。二是腸道微生物分泌抑菌或殺菌的小分子從而抑制致病菌定植：腸道微生物群某些菌株可以產(chǎn)生和分泌具有抑菌或殺菌活性的小分子，如內(nèi)源性抗菌肽類物質(zhì)、細(xì)菌素和溶菌酶等[39]。當(dāng)艱難梭菌進(jìn)入人體后，腸道內(nèi)的抗菌肽類物質(zhì)發(fā)揮抗菌作用。但同時(shí)，一些病原菌也可以通過此種方式影響腸道菌群從而在腸道內(nèi)定植。三是腸道微生物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物抑制病原體的生長：如次級(jí)膽汁酸、SCFAs、氨基酸等代謝產(chǎn)物[40-42]。SCFAs可以通過影響細(xì)胞內(nèi)的pH和代謝功能來抵抗病原菌的生長，且短鏈脂肪酸的濃度與腸道pH值呈負(fù)相關(guān)，另外，SCFAs等代謝副產(chǎn)物激活免疫反應(yīng)，從而影響全身免疫應(yīng)答[9]。琥珀酸是腸道微生物碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸，是腸道中的一種重要中間代謝物，可促進(jìn)體內(nèi)艱難梭菌的感染[43-44]。在健康的腸道微生態(tài)中，初級(jí)膽汁酸鵝脫氧膽酸、次級(jí)膽汁酸脫氧膽酸和石膽酸能抑制艱難梭菌在大腸內(nèi)的孢子萌發(fā)和生長。然而，抗生素的使用會(huì)改變微生物的結(jié)構(gòu)和膽汁酸的代謝。一項(xiàng)在小鼠腸道進(jìn)行抗生素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)表明，抗生素誘導(dǎo)后引起小鼠腸道微生物群和代謝組的改變，腸道內(nèi)初級(jí)膽汁酸在腸道微生物產(chǎn)物作用下脫羥基轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸[45]，從而有利于艱難梭菌的生長，同時(shí)促進(jìn)艱難梭菌孢子的萌發(fā)，增加了CDI的易感性。甘氨酸與某些膽汁酸結(jié)合可促進(jìn)艱難梭菌的萌發(fā)。組氨酸含量的增加與艱難梭菌陽性的患者樣本有關(guān)，此外，抗生素敏感小鼠盲腸內(nèi)容物中N-乙?；琢虬彼?、亮氨酸和異亮氨酸增加，而N-乙?；於彼釡p少[46]。四是腸道微生物可增強(qiáng)免疫應(yīng)答抵抗病原菌定植：腸道微生物對(duì)于多種免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能是必不可少的，腸道微生物群可以對(duì)腸道免疫細(xì)胞群產(chǎn)生局部和全身性影響，包括影響固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells,ILCs)和Th17(T helper 17 cells)產(chǎn)生細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的分化、激活中性粒細(xì)胞、誘導(dǎo)IgG反應(yīng)等[10, 47-48]。Chen等實(shí)驗(yàn)展示了由γδT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17A在抵抗艱難梭菌感染的宿主防御中的重要作用[49]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)給小鼠直腸注射純化蛋白SlpA可引起全身性和局部性體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生IgG和IgA抗體，能減少艱難梭菌在小鼠腸道中定植[50]。

5 艱難梭菌感染的治療

大多數(shù)的艱難梭菌感染是由使用抗菌藥物后健康的腸道菌群紊亂引起的，CDI 治療的首要原則是盡早停止目前正在使用的的抗菌藥物，其次是口服有效治療藥物。目前臨床上用于治療 CDI 的藥物主要包括甲硝唑、萬古霉素、非達(dá)霉素等。CDI治療的基石最近由甲硝唑和萬古霉素改為萬古霉素和非達(dá)霉素。

有研究表明益生菌在預(yù)防原發(fā)性CDI方面有積極作用。然而，這些研究在益生菌的劑量和類型、艱難梭菌菌株、抗生素的劑量和類型以及治療的時(shí)機(jī)方面有很大的不同。

歐洲[51]和美國[52]的CDI防治指南均建議對(duì)于復(fù)發(fā)性和難治性CDI，經(jīng)常規(guī)治療無效后可以考慮糞便菌群移植(Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)治療，以恢復(fù)患者腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減少艱難梭菌定植。發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上的一篇文章報(bào)道了與接受萬古霉素治療相比，經(jīng)十二指腸FMT治療復(fù)發(fā)性CDI的成功率為80%[53]。FMT是治療CDI的一種高效方法[54]，已被證明能誘導(dǎo)微生物區(qū)系恢復(fù)。移植的正常的腸道菌群可以競爭性抑制艱難梭菌的生長，同時(shí)產(chǎn)生氨基酸、SCFAs、次級(jí)膽汁酸等代謝物，從而抑制艱難梭菌的定植和生長。研究證明FMT后丁酸、乙酸和丙酸等短鏈脂肪酸的水平持續(xù)升高，脫氧膽酸和石膽酸等次級(jí)膽汁酸隨時(shí)間變化有不同的恢復(fù)。這些增加的代謝物與毛螺菌科、瘤胃菌科和未分類的梭菌屬的細(xì)菌有關(guān)，而初級(jí)膽汁酸與這些菌群呈負(fù)相關(guān)[55]。Weingarden等描述了糞便膽汁酸成分調(diào)節(jié)CDI的有力證據(jù)，患者進(jìn)行FMT前的樣本中缺乏石膽酸、脫氧膽酸等次級(jí)膽汁酸，而進(jìn)行FMT后捐贈(zèng)者的樣本中膽酸和鵝脫氧膽酸等初級(jí)膽汁酸顯著減少[56]。類似地，Allegretti等研究發(fā)現(xiàn)，與來自健康對(duì)照組的樣本相比，初發(fā)和復(fù)發(fā)CDI患者的樣本中初級(jí)膽汁酸水平顯著升高，次級(jí)膽汁酸水平顯著降低。他們還指出，與初發(fā)CDI患者的樣本相比，復(fù)發(fā)病例的樣本中初級(jí)膽汁酸顯著升高[57]。FMT已被證明是治療復(fù)發(fā)性CDI最有效的方法。然而，由于受實(shí)際情況及道德倫理影響并不是所有的患者都可以進(jìn)行FMT治療。

6 艱難梭菌感染的預(yù)防

艱難梭菌通過糞-口途徑傳播，通常住院患者艱難梭菌的攜帶率為7%～11%。許多艱難梭菌感染患者在治療成功后成為無癥狀攜帶者，并通過孢子在宿主之間傳播[58]，預(yù)防CDI最重要的是合理的使用抗生素和控制感染途徑[59]。特別是在艱難梭菌感染暴發(fā)期間，減少艱難梭菌的傳播需要嚴(yán)格遵守接觸預(yù)防措施，原因不明的腹瀉患者需要進(jìn)行隔離。醫(yī)護(hù)人員都應(yīng)采取手部衛(wèi)生和物理防護(hù)措施，包括戴手套和穿防護(hù)服。艱難梭菌芽孢對(duì)消毒劑如乙醇、高溫、紫外線等有較強(qiáng)的抵抗性，酒精不能殺死艱難梭菌的孢子[60]，可以在物體表面存在數(shù)月到數(shù)年，從而在人群中傳播。用肥皂水洗手比使用酒精擦手更有效地清除艱難梭菌。因此，建議先用肥皂和水洗手，然后用含酒精的洗手液消毒，使用具有滅孢子功能的產(chǎn)品進(jìn)行環(huán)境消毒，例如稀釋次氯酸鈉(家用漂白劑)[52]。

一些研究提出益生菌可作為艱難梭菌高危人群預(yù)防性治療[61-62]，但目前的研究仍存在爭議，沒有足夠的數(shù)據(jù)，建議在臨床實(shí)驗(yàn)之外使用益生菌作為CDI的預(yù)防。在益生菌被納入預(yù)防措施之前，迫切需要專門研究確定益生菌是否有效，以及確定哪種類型的細(xì)菌、劑量和服藥時(shí)間可以降低CDI的風(fēng)險(xiǎn)。因此，關(guān)于艱難梭菌的防治指南中并未明確將益生菌作為預(yù)防感染的方法。益生元可以被腸道微生物選擇性利用，產(chǎn)生對(duì)人體有益的物質(zhì)，降低艱難梭菌在腸道的定植。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)水蘇糖能夠改善腸道微生物豐富度，多形擬桿菌回復(fù)部分膽汁酸水平，兩者選擇性地改變了某些菌種的相對(duì)豐度[63]。隨著人們對(duì)腸道微生態(tài)研究的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，未來腸道微生態(tài)及其代謝物和免疫因子可能會(huì)成為預(yù)防CDI的突破口。

7 結(jié) 語

艱難梭菌感染與腸道微生態(tài)紊亂互為因果，正常的腸道菌群是機(jī)體抵抗艱難梭菌的主要保護(hù)屏障。艱難梭菌感染嚴(yán)重威脅患者健康，臨床上控制艱難梭菌感染途徑和合理應(yīng)用藥物對(duì)于防治艱難梭菌感染至關(guān)重要。