王雅軒，朱曉雁，蘇建榮

CRISPR/Cas系統(tǒng)存在于細菌和古細菌中，它們的主要作用是保護生物體免受如質(zhì)粒和噬菌體等外源DNA的入侵。1987年, Ishino等[1]于E.coli編碼堿性磷酸酶的iap基因附近首次發(fā)現(xiàn)了一種特殊的重復序列。由于這個新穎的重復DNA序列家族的特征是具有21～37 bp的直接重復序列，并由大小相似的非重復序列分隔，故Jansen等[2]于2002年將其命名為簇狀規(guī)律間隔的短回文序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，即CRISPR。2005年，Bolotin等[3]發(fā)現(xiàn)，CRISPR表觀出穩(wěn)定性和廣泛存在性可能是由于它們具有抵抗外源DNA入侵的保護作用。2007年,研究表明原核生物內(nèi)可能存在一種基于核酸的免疫系統(tǒng)，其特異性由CRISPR間隔區(qū)決定，而抗性由Cas酶決定，并說明CRISPR是一種可以保護嗜熱鏈球菌免受外來噬菌體侵襲的適應性免疫系統(tǒng)[4]。2011年，通過對化膿性鏈球菌進行分析發(fā)現(xiàn)了一種反式編碼小RNA，即tracrRNA。tracrRNA通過廣泛保守的內(nèi)源性RNase III和CRISPR相關(guān)的Csn1蛋白的活性來指導crRNA的成熟。所有這些成分對于保護該菌免受原噬菌體衍生的DNA侵襲至關(guān)重要[5]。2012年，研究人員揭示了一個通過反式激活tracrRNA與配對的成熟crRNA形成的雙RNA進行位點特異性DNA切割的核酸內(nèi)切酶家族，并指出了該家族進行基因編輯的潛力[6]。近幾年，Doudna研究組和張鋒研究團隊等相繼將CRISPR/Cas系統(tǒng)應用于核酸檢測領域，并且通過將重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等等溫擴增反應與其結(jié)合，實現(xiàn)了單個核酸分子的檢測。本文將主要對CRISPR/Cas中的Cas9、Cas12、Cas13以及Cas14在病原體檢測方面的最新進展進行闡述。

1 Cas9在病原體檢測中的應用

Cas9是Ⅱ型 CRISPR / Cas 系統(tǒng)中被廣泛應用的標志性核酸酶,在由tracrRNA 與成熟 crRNA 形成的tracrRNA / crRNA的引導下,特異性切割靶標雙鏈 DNA(double strands DNA, dsDNA)。由于 tracrRNA / crRNA 的設計較復雜,研究者將二者整合為單一向?qū)NA(single-guide RNA, sgRNA),大大簡化了操作步驟。Cas9介導的位點特異性切割依賴于sgRNA對靶序列dsDNA上原型間隔序列毗鄰基(protospacer adjacent motif, PAM)序列的特異性識別,不同來源的 Cas9 識別的 PAM 序列不同。其中,應用最廣泛的化膿性鏈球菌 Cas9切割靶標時所識別的PAM序列為NGG。

Pardee等[7]發(fā)明了一種將等溫RNA擴增反應與RNA傳感器相結(jié)合用于檢測寨卡病毒的紙基傳感器，可以在7 h內(nèi)組裝并測試48個寨卡病毒株。當與一種基于CRISPR/Cas9的模塊結(jié)合使用時，可以區(qū)分具有單堿基差異的病毒株。研究人員成功展示了一種簡單且可以現(xiàn)場使用的樣本處理流程，并從一只患有病毒血癥的獼猴血漿中檢測到了寨卡病毒?；贑RISPR/Cas9和切口核酸內(nèi)切酶(Nicking Endonuclease, NEase)介導的核酸擴增，Huang 等[8]建立了一種由CRISPR/Cas9引發(fā)的等溫指數(shù)擴增反應(CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction,CAS-EXPAR)策略，用于進行快速且位點特異性的核酸檢測。該策略的引物由Cas9/sgRNA指導的靶點特異性切割產(chǎn)生，并在反應過程中積累。該方法可以檢測DNA甲基化和單核細胞增生李斯特菌總RNA，檢測限可達0.82 aM，且在區(qū)分單堿基錯配方面具有良好的特異性。CRISPR-dCas9是一種由RNA引導的蛋白質(zhì)系統(tǒng)，能夠特異性地與目標DNA序列結(jié)合。在Yang等[9]進行的檢測CRISPR-dCas9的納米孔實驗中，該蛋白表現(xiàn)出了明顯的阻斷信號，這將有助于目標序列的鑒定。即使在納米孔實驗所需的高鹽條件下，dCas9蛋白仍能穩(wěn)定結(jié)合，靶序列的結(jié)合位置可以從DNA信號峰值的位置讀出。Wang等[10]將CRISPR/Cas系統(tǒng)與側(cè)向流動核酸檢測(lateral flow nucleic acid assay，LFA)相結(jié)合形成了CASLFA檢測系統(tǒng)，用于鑒定單核李斯特菌、轉(zhuǎn)基因生物和非洲豬瘟病毒，可在1 h內(nèi)檢測數(shù)百份樣本。在非實驗室環(huán)境下檢測樣本時，與實時PCR相比，其準確性可達100%。除此之外，研究人員開發(fā)了一種基于Cas9切口酶的擴增方法(Cas9 nickase-based amplification reaction，Cas9nAR)，該方法將具有精確的靶點識別和單鏈切割能力的RNA引導的Cas9n與具有鏈置換能力的外Klenow聚合酶相結(jié)合，并將其用于從基因組DNA中擴增目的片段。該方法可在60 min內(nèi)達到10～21摩爾的檢測限[11]。Wang等[12]將Cas9nAR與側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l相結(jié)合，開發(fā)了一種可以鑒定鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌的雙重檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用sgRNA和針對目標基因設計的引物，對基因組DNA的檢測限可達100拷貝。

2 Cas12在病原體檢測中的應用

Cas12,又稱為Cpf1，是屬于V型CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸內(nèi)切酶。crRNA-Cas12復合物可切割在非目標鏈5′端具有富含T堿基的短PAM序列的dsDNA。Cas12也因此成為了一種強大的基因編輯工具[13-14]。2018年，Chen等[15]檢測了毛螺旋菌科細菌(Lb)ND2006 Cas12a(LbCas12a)的由RNA引導的單鏈DNA(single strand DNA, ssDNA)切割能力。結(jié)果表明，與crRNA互補的ssDNA或dsDNA都能夠觸發(fā)LbCas12a非特異性切割ssDNA-FQ報告底物，證實了LbCas12a具有DNase活性。研究人員通過將RPA反應與LbCas12a結(jié)合，建立了名為DETECTR的檢測方法，能夠于1 h內(nèi)在含有不同亞型人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的樣品中準確地識別HPV16和HPV18，靈敏度可達aM。2019年，Li 等[16]利用來自V-B型 CRISPR/Cas系統(tǒng)、由嗜熱RNA引導的內(nèi)切酶Cas12b(以前稱為C2c1)，建立了一種名為HOLMESv2的檢測方法。在HOLMESv2中，LAMP反應和Cas12b被集成到一個體系中，并且通過使用依賴RNA的DNA聚合酶省略了額外的逆轉(zhuǎn)錄步驟，使檢測過程更加便利。隨后，Teng等[17]開發(fā)了一種由Cas12b介導的DNA檢測策略(Cas12b-mediated DNA detection, CDetection), 該方法的靈敏度可達1 aM。近期，一種基于超靈敏探針的側(cè)向流動傳感器被開發(fā)出來，該傳感器結(jié)合了CRISPR/Cas系統(tǒng)和LAMP反應，可檢測到單拷貝的銅綠假單胞菌?；D(zhuǎn)移酶基因以及1 cfu/mL包含大腸桿菌DH5α 純培養(yǎng)物的質(zhì)粒[18]。研究表明，Cas12a能夠檢測EB病毒以及碳青霉烯酶抗性基因(如KPC、NDM和OXA)。同時，通過增加一個逆轉(zhuǎn)錄步驟，還能夠?qū)Φ歉锊《?、寨卡病毒和漢坦病毒進行檢測，證明Cas12a能夠同時檢測DNA和RNA靶標[19]。除此之外，Cas12能夠通過與其他材料結(jié)合被用于病原體診斷。CRISPR相關(guān)核酸酶的可編程性能夠激活含有DNA的水凝膠，當被輸入序列激活后，Cas12a在凝膠中裂解DNA，從而將生物信息轉(zhuǎn)化為材料性質(zhì)的變化[20]。Peng等[21]首次將CRISPR/Cas12a與生物分子邏輯門相結(jié)合，構(gòu)建了3個2-輸入的“與”“或”“抑制”邏輯門。其中，“與”門對金黃色葡萄球菌等外部病原菌具有較高的靈敏度和特異性。進行靶序列擴增后，應用該方法進行細菌檢測，總的采樣-應答時間為2 h，檢出限為103cfu/mL，動態(tài)范圍為103～107cfu/mL。該研究驗證了利用CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建生物計算設備的可能性。細胞相關(guān)的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV) DNA是證明HIV在感染細胞中持續(xù)存在的最常使用的標志物。通過將Cas12a與玻璃納米孔傳感器結(jié)合形成電子傳感平臺，并使用ssDNA作為報告基因，Nouri等[22]成功地在1 h內(nèi)檢測到10 nmol/L以上的目標DNA,并發(fā)現(xiàn)報告子的切割速率與目標分子濃度成正比。

2019年年底以來，新冠肺炎出現(xiàn)并迅速傳播，亟需建立可以快速檢測SARS-CoV-2的方法。2020年5月，Huang等[23]報告了一種基于RT-PCR與CRISPR/ Cas12的用于檢測鼻拭子中SARS-CoV-2的側(cè)向流動方法。該方法可在未配備q-PCR檢測系統(tǒng)的現(xiàn)場進行使用，并且可檢測到包含2拷貝靶標RNA的樣本。除此之外，Ding等[24]提出了一種一體化雙重CRISPR/ Cas12a(All-In-One Dual CRISPR-Cas12a，AIOD-CRISPR)檢測方法，該反應引入了兩個靶向SARS-CoV-2 N基因的crRNA，并與RPA反應相結(jié)合，高效啟動了基于CRISPR的檢測系統(tǒng)。通過低成本的暖手器作為反應孵育器，可在20 min內(nèi)實現(xiàn)對臨床樣本的檢測。Lucia等[25]也針對SARS-CoV-2的ORF1ab區(qū)設計了結(jié)合RPA反應與CRISPR/ Cas12a進行檢測的系統(tǒng)，檢測限可達10拷貝/μL，且能夠與側(cè)向?qū)游雎?lián)用。

3 Cas 13在病原體檢測中的應用

2016年，張鋒團隊[26]通過純化的LshC2c2蛋白證明了C2c2(現(xiàn)稱為Cas13a)和crRNA在體外足以實現(xiàn)由RNA引導的RNA切割。這種切割優(yōu)先發(fā)生在ssRNA區(qū)域的尿嘧啶殘基上，并依賴于兩個高等真核生物和原核生物結(jié)合核苷酸(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding, HEPN)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守催化殘基。C2c2一旦被同源靶標啟動，就可以在體外切割其他(非互補的)RNA分子，并在體內(nèi)抑制細胞生長。同年，Doudna課題組[27]證實，在VI型系統(tǒng)中，C2c2蛋白是RNA引導的RNA內(nèi)切酶，并且具有一種獨特的核糖核酸酶活性，能夠負責crRNA的成熟，這與它的ssRNA降解活性不同。

2017年，Gootenberg等[28]建立了一種由RPA反應、T7 RNA聚合酶和Cas13a組合檢測靶標RNA/dsDNA的系統(tǒng)，稱為SHERLOCK。結(jié)果表明，SHERLOCK在檢測時發(fā)生的變異小于ddPCR、qPCR和RPA。此外，該系統(tǒng)具有aM的敏感性和識別單堿基錯配的特異性，能夠檢測特定的寨卡病毒和登革病毒株、區(qū)分病原菌、對人類DNA進行基因分型，并可以鑒定細胞游離腫瘤的DNA突變。此外，SHERLOCK的反應試劑可以進行冷凍干燥，便于儲存和現(xiàn)場應用。2018年，Gootenberg等[29]建立了SHERLOCK v2系統(tǒng)。為了放大檢測信號，研究者利用了CRISPR III類效應器核酸酶Csm6，它能夠被環(huán)腺苷酸分子或以2′，3′-環(huán)磷酸為末端的直線型腺嘌呤均聚物激活。LwaCas13a和PsmCas13b附屬切割產(chǎn)生帶有羥基化的5′末端和2′，3′-環(huán)磷酸端的切割產(chǎn)物，表明Cas13的附屬切割可以產(chǎn)生Csm6激活物，這將使其可以在SHERLOCK中進行放大的信號檢測。除此之外，研究者建立了一個基于FAM-生物素報告系統(tǒng)的、可以在側(cè)向流動試紙條上進行檢測的方法。基于這種設計對寨卡病毒或登革病毒ssRNA進行檢測，可以在90 min內(nèi)得到信號，且靈敏度達2 aM。2019年，Qin等[30]報道了一種利用Cas13a檢測埃博拉病毒RNA的自動化POC系統(tǒng)。在進行混合和雜交后，可在5 min內(nèi)檢測出20 pfu/mL(5.45×107copy/mL)的純化埃博拉RNA。同年，Myhrvold等[31]開發(fā)了能夠與SHERLOCK組合使用，進而從體液中直接進行病毒檢測的HUDSON系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以通過加熱和化學還原裂解病毒顆粒，并滅活體液中高水平的核糖核酸酶，使其在2 h內(nèi)直接從患者樣本中檢測到登革病毒。除此之外，基于SHERLOCK和HUDSON系統(tǒng)，實現(xiàn)了對與病毒性出血熱相關(guān)的埃博拉病毒和拉沙病毒的檢測，每個樣本的檢測成本不足1美元[32]。近期，一個可用于多重核酸檢測的組合陣列反應(CARMEN)平臺被開發(fā)出來。在該平臺上，含有基于CRISPR的核酸檢測試劑的納米液滴在微孔陣列中與擴增樣品的液滴進行配對，測試每個樣本與crRNA的反應情況。CARMEN-Cas13可以在單個陣列上對超過4 500個crRNA-目標序列對進行準確的檢測。該平臺能夠通過至少10個已發(fā)表的基因組序列同時區(qū)分169種人類相關(guān)病毒，并且可以對COVID-19的病原體進行檢測。該平臺還實現(xiàn)了對A型流感病毒多種亞型毒株的區(qū)分和對數(shù)十種HIV耐藥突變的鑒定[33]。Kaminski等[34]將RPA反應與Cas13結(jié)合用于從患者的血液和尿液等樣本中準確檢測出BK多瘤病毒DNA和巨細胞病毒DNA，這兩種常見的機會性病毒與腎移植患者以及其他免疫功能低下的患者密切相關(guān)。

2020年8月，我國研究者Hou等[35]將RPA反應與Cas13a相結(jié)合用于檢測SARS-CoV-2，具有高度特異性，且可以在40 min內(nèi)完成檢測。9月，F(xiàn)ozouni等[36]在medRxiv網(wǎng)站上預先發(fā)表了最新研究成果，她們基于CRISPR/Cas13a實現(xiàn)了對SARS-CoV-2的直接檢測，并與移動電話相結(jié)合實現(xiàn)了病毒RNA的定量。該方法無需預先擴增病毒基因，將多個crRNA進行組合來增加Cas13a的激活。通過檢測反應過程中熒光值的變化，可以在30 min內(nèi)實現(xiàn)對低至100 copy/μL SARS-CoV-2 RNA的檢測，還可以在5 min內(nèi)檢測出所有受試的陽性患者樣本。該方法為SARS-CoV-2的篩查提供了快速和便攜的新選擇。

4 Cas 14在病原體檢測中的應用

2018年，Harrington等[37]在未經(jīng)培養(yǎng)的古生菌中發(fā)現(xiàn)了一套包含Cas14的CRISPR/Cas系統(tǒng)。這是一個非常緊湊的由RNA引導的核酸酶家族，長度為400～700個氨基酸。它能夠在無需限制性序列的條件下靶向切割ssDNA，且會引發(fā)對ssDNA分子的非特異性切割，因此它有望被用于檢測重要的ssDNA病毒。然而，它能否被用于除診斷以外的其他用途，如研究新病毒的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及與其他病原體的流行病學關(guān)系等仍未知。

5 CRISPR/Cas系統(tǒng)在多重病原體檢測中的應用

SHERLOCKv2可以通過側(cè)向流動試紙檢測登革病毒或寨卡病毒以及患者體液活檢樣本中的變異，突出了其用于多重檢測的潛力。研究者進一步將檢測擴展到4個靶標，分別在FAM、TEX、Cy5和HEX通道中使用LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a，成功區(qū)分了所有靶標的組合。當與RPA結(jié)合時，能夠在aM的濃度下檢測到兩個DNA靶標(銅綠假單胞菌?；D(zhuǎn)移酶基因和金黃色葡萄球菌熱核酸酶基因)。同樣，由PsmCas13b和LwaCas13a組成的多重SHERLOCK實現(xiàn)了aM濃度寨卡病毒和登革病毒RNA的檢測以及人類唾液樣本的等位基因特異性基因分型[29]。除此之外，Yuan等[38]提出了一種基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的比色基因傳感平臺。在該平臺中，Cas12a/crRNA對DNA和Cas13a/crRNA對RNA的識別通過互補序列激活反式ssDNA或ssRNA切割，進而觸發(fā)設計的AuNPs DNA探針對發(fā)生聚集行為的改變，在1 h內(nèi)完成基因檢測，同時，這個平臺也有望利用16S rDNA或16S rRNA進行細菌的鑒定。近期，Xu等[39]開發(fā)出一種由于靶標信號誘導表面信號探針(含電化學標記)發(fā)生構(gòu)象變化，從而導致電化學標記的電子轉(zhuǎn)移速率發(fā)生變化的CRISPR/Cas系統(tǒng)增強型電化學DNA傳感器，可在無需酶催化的條件下達到fM的檢測限。

6 總結(jié)與展望

本文對CRISPR/Cas中的Cas9、Cas12、Cas13以及Cas14在病原體檢測方面的應用進行了詳細的闡述，它們不但可以對病原體進行鑒別診斷，如區(qū)分寨卡病毒和登革病毒、HPV16和HPV18等，還可以用于檢測生物酶、生物標志物和區(qū)分人類SNP位點等?；贑RISPR/Cas系統(tǒng)的檢測方法可達aM的靈敏度，且能夠?qū)崿F(xiàn)區(qū)分單堿基差異的特異性(如SHERLOCK和DETECTR)。在成本方面，基于SHERLOCK和HUDSON的檢測成本低至1美元，其他幾種相關(guān)的檢測方法也成功實現(xiàn)了低成本。此外，為了增加使用的便捷性，研究人員開發(fā)了多種不同形式的檢測系統(tǒng)，包括將其與側(cè)向?qū)游鲈嚰埾嘟Y(jié)合、省略核酸擴增步驟直接進行檢測、將等溫擴增反應與Cas蛋白結(jié)合進行一步法反應等。未來，我們應該開發(fā)一種集病原體核酸擴增、Cas蛋白檢測與反應信號讀取于一體的設備，這將更適用于進行現(xiàn)場檢測。雖然越來越多利用CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測方法被開發(fā)出來，但它們對大規(guī)模臨床樣本檢測的準確性仍有待驗證。此外，目前大多數(shù)反應需要先進行核酸擴增，再利用CRISPR/Cas系統(tǒng)檢測，但擴增步驟大大增加了檢測時間，故我們可以嘗試通過在體系中加入多條針對目標序列不同位點的crRNA，進而達到提高靈敏度的目的，相關(guān)研究還有待進一步實施。隨著研究的不斷深入，CRISPR/Cas系統(tǒng)在病原體檢測方面的應用將更加廣泛，并可能成為新一代病原體檢測的有力工具。