李鵬飛 張國偉 曹宇 陳曉娟 王瑩 管懷進

白內(nèi)障是世界首位致盲性眼病，其中年齡相關性白內(nèi)障(ARC)是最常見的類型。目前，通過手術摘出混濁的晶狀體并植入人工晶狀體是治療ARC的唯一有效方法[1]。迄今為止，ARC的病因和發(fā)病機制仍不明確，而年齡、性別、吸煙、紫外線輻射、遺傳易感和環(huán)境因素均可影響ARC的疾病進展[2-3]。氧化損傷主要引起DNA損傷，是目前較為公認的ARC發(fā)病機制，晶狀體上皮細胞(LECs)DNA氧化損傷修復能力的不足對ARC發(fā)生發(fā)展具有重要作用[4]。因此，研究DNA氧化損傷修復基因的上游調(diào)控機制至關重要。近幾年來表觀遺傳學研究發(fā)展迅速，許多研究聚焦ARC形成過程中氧化損傷修復基因的表觀遺傳改變[5-7]。本文通過回顧氧化損傷修復基因的表觀遺傳修飾在ARC的研究進展，同時揭示表觀遺傳學在ARC發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為ARC的機制研究提供新思路，為ARC患者創(chuàng)造更大的受益價值。

表觀遺傳學指在DNA核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達發(fā)生了可遺傳的改變,進而導致表型變異的遺傳現(xiàn)象及本質(zhì)。其研究內(nèi)容主要包含DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等多種修飾方式，是通過不同的修飾組合共同調(diào)控基因的特異性表達，從而影響其功能和特性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學與許多眼部疾病密切相關，如青光眼[9-10]、年齡相關性黃斑變性[11]和視網(wǎng)膜母細胞瘤[12]等眼科疾病，同樣也參與了ARC的形成過程。

1 DNA甲基化與氧化損傷修復基因

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，以S腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位和該甲基基團共價結(jié)合的過程。CpG二核苷酸是DNA甲基化的主要位點，人類的CpG以2種形式存在，一種是分散于DNA重復序列區(qū)域中的CpG，這些CpG位點在健康人基因組中通常是甲基化的，以維持染色體的穩(wěn)定性；另一種是成簇聚集在基因啟動子區(qū)域的CpG，稱為CpG島。人類基因組中約60%的啟動子區(qū)含有CpG島。正常情況下，CpG島中的CpG位點常處于非甲基化狀態(tài)，以維持轉(zhuǎn)錄活性，確?；虻恼１磉_。因此，CpG島的高甲基化狀態(tài)與基因沉默有關，而去甲基化則與基因活化有關[13-14]。

本課題組前期利用DNA氧化損傷修復基因芯片板檢測了92個DNA氧化損傷修復基因在ARC及對照晶狀體前囊膜上皮細胞中的表達[6]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在這92個基因中，有11個基因在2組間存在明顯的差異性表達，其中10個基因在ARC中表達較低，1個基因表達較高。為了深入探討差異表達基因調(diào)控的確切機制，我們對這11個基因的啟動子區(qū)進行DNA甲基化分析，發(fā)現(xiàn)在ARC中，O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O-6-methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)基因啟動子呈高度甲基化，并且與該基因在ARC中的低表達有相關性。擴大患者樣本驗證后，MGMT的啟動子區(qū)仍呈高甲基化，猜測MGMT的高甲基化通過影響該基因的表達，而促進ARC的發(fā)生[6]。其他差異表達的DNA修復基因如X射線修復交叉互補蛋白6(X-Ray repair cross complementing 6，XRCC6)等，在2組間的甲基化率無顯著差異。我們前期只是在部分氧化損傷修復基因中篩選表達與DNA甲基化相關聯(lián)的基因，并未進一步研究其調(diào)控機制。

作者所在團隊還發(fā)現(xiàn)氧化損傷修復基因切除修復交叉互補組6(excision repair cross-complementation group 6，ERCC6)基因在ARC患者LECs中的表達明顯下調(diào)，并且在ERCC6啟動子區(qū)存在一個長度為207 bp的CpG島(-603 ～ -396，轉(zhuǎn)錄起始位點+1:chr10:49540952)，而該區(qū)域也是轉(zhuǎn)錄因子Sp1的預測結(jié)合位點。隨后，我們在60個樣本(30個對照和30個ARC患者)中進行驗證，證實了位于ERCC6啟動子區(qū)的12個CpG位點發(fā)生高度甲基化。研究發(fā)現(xiàn)ERCC6在2組(對照組和ARC組)中的表達減少與啟動子區(qū)CpG位點8 (-441)的高甲基化狀態(tài)相關。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UVB照射后，DNMT3b與ERCC6啟動子區(qū)的結(jié)合變強，使此位點的CpG高甲基化。同時，CHIP實驗證明在ARC中，轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過其特異性結(jié)合位點與ERCC6啟動子區(qū)結(jié)合減弱。該研究表明，ERCC6的轉(zhuǎn)錄在ARC中可能受表觀遺傳學的調(diào)控，從而導致DNA氧化損傷修復過程受阻[7]。

此外，本課題組通過DNA修復基因芯片板研究了健康人和ARC患者的晶狀體皮質(zhì)中DNA氧化損傷修復基因的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因表達改變模式不同于LECs，其中OGGl基因表達在ARC患者晶狀體皮質(zhì)中明顯下調(diào)[5]。在該基因的第1外顯子中，存在1個CpG島的15個CpG位點明顯高甲基化，這與OGG1的低表達顯著相關；使用去甲基化藥物5-氮雜-2脫氧胞苷(5-aza-2’deoxycytidine，5-aza-dC)處理LECs細胞株(HLEB3)后，該基因表達恢復；使用小干擾RNA技術沉默該基因表達后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UVB照射后的HLEB3凋亡明顯增加。以上實驗證明OGGl基因表達受DNA甲基化調(diào)控，并與ARC的發(fā)生有一定的相關性。

作者所在團隊后期研究發(fā)現(xiàn)，DNA氧化損傷修復基因沃納解旋酶基因(Werner helicase genes，WRN)在皮質(zhì)性、核性和后囊下白內(nèi)障前囊膜和皮質(zhì)中均低表達。此外，在ARC患者前囊膜組織晶狀體上皮細胞中，該基因啟動子區(qū)甲基化明顯高于正常對照，其主要原因是由于在該基因組蛋白H3-K9(組蛋白H3中的第9位賴氨酸)出現(xiàn)高甲基化，而在晶狀體皮質(zhì)中卻沒有差異[15]。

2 組蛋白乙?；揎椗c氧化損傷修復基因

組蛋白是指在所有真核生物的細胞核中,協(xié)助DNA包裝形成核小體的一類堿性蛋白質(zhì)的總稱。組蛋白有2個活性末端：羧基端與氨基端。其中由核心組蛋白的氨基酸殘基組成的N端尾突出于核小體之外，是組蛋白修飾的主要區(qū)域。常見的組蛋白翻譯后修飾包括：乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化和類泛素化等[16]。乙酰化是最重要的組蛋白修飾。乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)催化的乙?；徒M蛋白去乙酰化酶( histone deacety1ase，HDAC)催化的去乙?；餐S持了組蛋白乙?；降膭討B(tài)平衡。HAT對核心組蛋白H3和H4的乙?；揎椏梢韵嚢彼釟埢恼姾?，直接影響核小體的結(jié)構，并為其他蛋白提供了DNA結(jié)合位點，從而降低染色質(zhì)的穩(wěn)定性，活化基因轉(zhuǎn)錄[17]；相反，去乙酰化是通過HDAC抑制基因的轉(zhuǎn)錄，使得兩者維持可逆的動態(tài)平衡[18]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3(glutathione S-transferase Mu 3，GSTM3)是谷胱甘肽結(jié)合反應的關鍵酶，具有較強的抗氧化功能。我們通過在2種晶狀體上皮細胞株中進行驗證發(fā)現(xiàn)：GSTM3表達水平在HLEB3細胞中較SRA01/04細胞低，其啟動子甲基化改變不明顯。進一步研究發(fā)現(xiàn)其在HLEB3細胞的H3乙?；捷^低，而H3-K9處的甲基化水平較高。使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或組蛋白去乙?；敢种苿┖?，HLEB3細胞中的GSTM3表達均增加，因此GSTM3的表達可能受晶狀體組織中表觀遺傳改變的調(diào)控。GSTM3啟動子的高甲基化和組蛋白修飾的改變可能參與了ARC的形成[19]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在UVB照射后，ERCC6啟動子區(qū)附近的HDAC1顯著增加，導致該區(qū)域組蛋白H3-K9的去乙?；鰪姡瑥亩种艵RCC6的轉(zhuǎn)錄[7]。本課題組的研究結(jié)果為控制ARC表觀遺傳變化提供了一種潛在的治療策略。這些結(jié)論除了證明晶狀體DNA損傷修復能力的改變與ARC發(fā)病機制有關之外，也將表觀遺傳改變與目標基因表達聯(lián)系在一起，并且與當前的表觀遺傳學對人類基因組影響的知識相一致。遺憾的是，我們目前的研究均局限于體外細胞株，進一步探索還需要大量的動物體內(nèi)實驗進行驗證。關于去甲基化藥物和HDAC抑制劑在動物體內(nèi)實驗中具體給藥方式(如前房給藥或局部藥物滴眼)以及這些藥物對眼內(nèi)其他正常細胞的毒性作用等仍待解決。

3 ncRNA與氧化損傷修復基因

非編碼RNA(ncRNA)是一類內(nèi)源性、不編碼蛋白的RNA。非編碼RNA主要包括微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)以及與以上線性結(jié)構不同的環(huán)狀RNA(circRNA)等。雖然ncRNAs不能翻譯成蛋白質(zhì)，但越來越多的證據(jù)表明，miRNA、lncRNA和circRNA參與基因的表達調(diào)控。 MiRNA的作用機制是與其靶基因信使RNA(mRNA)的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合后，介導mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默[17]。lncRNA廣泛存在于生物體內(nèi)，可以通過調(diào)控基因的表達方式影響細胞增殖、凋亡、活力、免疫反應和氧化應激[20]。circRNA是一類新型的非編碼RNA，由剪接小體通過反向剪接產(chǎn)生，再將外顯子的3’端與上游外顯子的5’端共價連接[21-22]。大多數(shù)circRNA來源于蛋白質(zhì)編碼基因，包含完整的外顯子。circRNA主要通過miRNA海綿作用或RNA結(jié)合蛋白調(diào)控靶基因[23]。

lncRNA、circRNA和miRNA之間的相關性提示在多種疾病中存在復雜的表觀遺傳調(diào)控機制[24]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，DNA氧化損傷修復基因的表達可以通過ncRNA進行調(diào)控[4,24]。本課題組分別提取了6例ARC患者晶狀體前囊膜和6例年齡匹配的透明晶狀體前囊膜中的總RNA，使用高通量測序分析lncRNA表達譜[24]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ARC組有182個lncRNA下調(diào)和49個lncRNA上調(diào)。經(jīng)PCR驗證，我們選擇了顯著上調(diào)的lncRNA H19。實驗檢測發(fā)現(xiàn)其靶基因胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine DNA glycosylase,TDG)在ARC患者中表達顯著降低。該基因在DNA氧化損傷堿基切除修復(base excision repair，BER)途徑中起重要作用。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，TDG能夠保護DNA免受氧化、脫氨以及構象改變的影響，并參與Wnt信號通路調(diào)控細胞的凋亡和增殖[25-26]。沉默lncRNA H19發(fā)現(xiàn)加重了SRA01/04細胞的氧化損傷，而過表達lncRNA H19則減輕了SRA01/04細胞的氧化損傷。深入研究發(fā)現(xiàn)，在LECs中l(wèi)ncRNA H19通過與miR-29a競爭性結(jié)合來上調(diào)TDG的表達[24]。這些數(shù)據(jù)表明，lncRNA H19在ARC早期通過協(xié)同miRNA一起調(diào)節(jié)氧化損傷修復通路。所以lncRNA H19/miR-29a/TDG軸的氧化損傷修復途徑可能是治療ARC的潛在靶點。

已有文獻報道磷脂酶C(phospholipase C,PLC)在心肌氧化損傷中起保護作用[27]。我們研究發(fā)現(xiàn)，PLCD3的lncRNA(PLCD3-OT1)在ARC的LECs中變化最為明顯，并且后期實驗證實了PLCD3在LECs的氧化損傷中的保護作用。PLCD3-OT1作為一種內(nèi)源性競爭性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，在ARC中發(fā)揮海綿效應，通過吸附miR-224-5p來調(diào)控PLCD3的表達[4]。此外，lncRNA GPX3-as通過直接促進谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPX3)的表達而減少了LECs的凋亡[28]。lncRNA和miRNA之間的相互聯(lián)系提示在ARC中存在復雜的調(diào)控機制。

一些學者研究發(fā)現(xiàn)，有幾種miRNA在晶狀體中特異表達，這對于影響調(diào)節(jié)ARC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如let - 7b、miR - 34a、miRNA -125b、hsa-miR-3912-5p、miR-421、miR-24-p53和miR-193a[29-30]。此外，也有學者將circRNA與miRNA之間的協(xié)同調(diào)控機制進行了拓展。Liu等[31]通過circRNA測序發(fā)現(xiàn)，在透明晶狀體和ARC晶狀體中，有101個circRNAs存在差異表達，其中75個circRNAs表達下調(diào)，26個circRNAs表達上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3在ARC不同分型(皮質(zhì)型、核型和后囊下型)的晶狀體組織中均顯著下調(diào)。沉默circHIPK3可以明顯加速氧化應激后的細胞凋亡，這表明ARC患者circHIPK3水平的降低促進了氧化應激下LECs的凋亡，導致ARC的形成和發(fā)展。進一步研究表明，對于維持晶狀體透明起重要作用的α-晶狀體蛋白(alpha A crystallin，CRYAA)是miR-193a的直接靶標，低表達的circHIPK3吸附miR-193a能力減弱使得CRYAA表達減少，因此減弱了CRYAA作為分子伴侶的保護作用，促進LECs凋亡[28]。該研究表明了晶狀體中重要的結(jié)構蛋白CRYAA存在circRNA和miRNA復雜的協(xié)同調(diào)控機制，但未能研究其在ARC氧化損傷修復修復基因中的作用機制。綜上所述，ncRNAs參與ARC中表觀遺傳修飾的建立，并提示ncRNA在細胞水平和個體水平表觀遺傳信息的傳遞過程中可能起重要作用。

4 總結(jié)與展望

表觀遺傳調(diào)控作為基因特異性表達的重要調(diào)控機制，在ARC中對調(diào)控DNA氧化損傷修復基因的表達發(fā)揮重要作用。表觀遺傳中3種主要機制：DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA。三者均參與了DNA氧化損傷修復基因的調(diào)節(jié)。盡管近年來表觀遺傳學參與ARC發(fā)病機制的研究逐漸增多，但其復雜多樣性以及進展迅速讓各種研究進展舉步維艱，也是亟須解決的重大問題。如近期較為熱門的RNA甲基化，亦屬表觀遺傳學的一個分支，其也可能參與ARC的疾病進展。這為表觀遺傳學與ARC的研究提供一個新的方向。由于表觀遺傳的改變是可逆的，應用表觀遺傳學的手段，如DNA甲基化抑制劑、HDAC抑制劑以及調(diào)控miRNAs表達水平的靶向抑制劑等可能會成為未來ARC治療的新方向，為ARC患者帶來福音。