劉丹,周倩,孔祥雨,胡春梅*,侯喜林,王建軍,2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用教育部工程研究中心,江蘇 南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)連云港新農(nóng)村發(fā)展研究院,江蘇 連云港 222002)

不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)富含對(duì)人體有利的維生素C、粗纖維和花青苷,紫色不結(jié)球白菜中的花青苷含量尤為豐富?；ㄇ嘬帐翘腔亩喾宇惢衔?易溶于水,是蔬菜和水果重要的呈色物質(zhì)?；ㄇ嘬漳軌虮Ｗo(hù)植物抵抗各種生物和非生物脅迫[1],花青苷在人體中還具有抗氧化[2]、抗癌[3],降低血壓[4]和血脂[5],減緩阿爾茲海默癥[6]等功效。

EGL3(EnhancerofGlabra3)基因?qū)儆冖骹亞類bHLH轉(zhuǎn)錄因子,可以通過(guò)調(diào)控花青苷合成途徑中某個(gè)結(jié)構(gòu)基因,實(shí)現(xiàn)對(duì)植物體內(nèi)花青苷含量的調(diào)控作用。EGL3蛋白具有典型堿性螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域,bHLH結(jié)構(gòu)域具有2個(gè)不同的功能區(qū)域:HLH和BASIC[7],其中HLH可以促進(jìn)蛋白互作,形成同源二聚體或異源二聚體[8];BASIC位于bHLH結(jié)構(gòu)域的N末端,與DNA順式元件E-box(5′-CANNTG-3′)和G-box(5′-CACGTG-3′)結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)[9]。DFR基因是花青苷合成途徑中結(jié)構(gòu)基因。二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydrofavonol 4-reductase,DFR)是花青苷生物合成代謝中的關(guān)鍵酶,影響花青苷的組成和色素沉著,是植物呈色的關(guān)鍵酶,也是花色形成的重要調(diào)控點(diǎn)。Danilo等[10]對(duì)缺失DFR基因的番茄純合子的胚軸和愈傷組織進(jìn)行體外培養(yǎng),之后對(duì)再生綠色小植株的胚軸和愈傷組織靶向插入DFR基因,結(jié)果再生小植株由綠色轉(zhuǎn)為紫色。于婷婷[11]在龍膽試驗(yàn)中檢測(cè)發(fā)現(xiàn),DFR基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因橙花龍膽與野生型相比紅色更深,花青苷含量更高。Nesi等[12]發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)EGL3的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中,DFR的表達(dá)量增加,葉片由綠色轉(zhuǎn)為紫色,證明EGL3通過(guò)調(diào)控花青苷合成途徑中DFR基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)花青苷的調(diào)控。EGL3基因還可與其他調(diào)控因子PAP1/2、TTG1一起形成復(fù)合體,共同調(diào)控DFR基因的表達(dá)調(diào)控[13]。

本研究采用同源克隆方式以不結(jié)球白菜紫色自交系NJZX1-3及其綠色突變體NJZX1-0為材料克隆獲得BcEGL3基因,利用生物信息學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)及保守域,并預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu);構(gòu)建pRI101-BcEGL3載體,對(duì)BcEGL3進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;構(gòu)建pTY-BcEGL3沉默載體,對(duì)BcEGL3基因進(jìn)行功能驗(yàn)證;對(duì)NJZX1-3進(jìn)行遮光處理,檢測(cè)葉片花青苷含量以及BcEGL3基因的轉(zhuǎn)錄水平,旨在為紫色不結(jié)球白菜中花青苷合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為不結(jié)球白菜紫色材料NJZX1-3及其經(jīng)過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)所產(chǎn)生的非加倍綠色突變體NJZX1-0(圖1),由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。將不結(jié)球白菜種子先用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇?xì)⒕竞?再用超凈水沖洗,室溫催芽2 d左右,移至穴盤(pán),放置在氣候室(光/暗時(shí)間為16 h/8 h,光/暗溫度為22 ℃/18 ℃)。另外,取7葉期健壯NJZX1-3材料用遮陽(yáng)網(wǎng)進(jìn)行遮光處理,分別在處理后0、3、7、11和14 d時(shí)取樣,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。以同期自然條件下生長(zhǎng)的健壯幼苗為對(duì)照組。

圖1 不結(jié)球白菜的表型Fig.1 The phenotype of non-heading Chinese cabbage

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g試驗(yàn)材料7葉期的葉片,置于加入鋯珠的2 mL磨樣管中,液氮速凍。用磨樣機(jī)(程序?yàn)?5 Hz 90 s)磨樣完成后,用RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取RNA。使用Prime Script RT Reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA,用于BcEGL3基因的克隆。

1.3 BcEGL3基因的克隆

在大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)(BRAD,http://brassicadb.org/brad/index.php)中,查詢BcEGL3同源基因BraEGL3(Bra027796)設(shè)計(jì)特異引物(表1),并以反轉(zhuǎn)錄得到的第1鏈cDNA為模板,進(jìn)行cDNA克隆。PCR總體系為20 μL:模板1 μL,正、反引物各1 μL,I-5TtMn 2×High-Fidelity Master Mix酶(南京擎科生物科技有限公司)10 μL,ddH2O 7 μL。設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,59.6 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g·L-1凝膠電泳檢測(cè)后,回收目的片段,經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后,挑取單菌落送南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本文所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.4 EGL3基因序列及其蛋白的生物信息學(xué)分析

利用BioXM 2.6對(duì)EGL3進(jìn)行ORF查找、翻譯;利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的分析工具對(duì)EGL3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用DNAMAN 7程序進(jìn)行多重序列比對(duì);利用TMpred在線軟件(https://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)EGL3的跨膜結(jié)構(gòu);利用MEGA 5程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);利用在線的SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析;利用WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)在線程序分析EGL3轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域的保守位點(diǎn)。

1.5 BcEGL3的亞細(xì)胞定位檢測(cè)

設(shè)計(jì)2條特異性引物BcEGL3.1-R和BcEGL3.1-F,以pEASY-BcEGL3.1載體質(zhì)粒為模板,采用高保真酶擴(kuò)增目標(biāo)片段,電泳檢測(cè)后切膠回收。用限制性內(nèi)切酶對(duì)表達(dá)載體pRI101進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)凝膠(15 g·L-1)電泳檢測(cè)后,膠回收酶切目的片段。用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)同源重組上述膠回收片段,經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后,挑取單菌落送南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,返樣后提取質(zhì)粒,于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述提取的質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中,均勻涂在含有卡那霉素(50 mg·L-1)和利福平(50 mg·L-1)的LB固體培養(yǎng)基上,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。2 d后挑取單菌落于400 μL含卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基的滅菌管中;在28 ℃過(guò)夜搖菌,將搖好的菌液轉(zhuǎn)移到50 mL管中搖至菌液D600=1.0;6 000 r·min-1離心5 min,棄上清液,用含10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2和150 mol·L-1的乙酰丁香酮注射緩沖液重懸菌液;將菌液調(diào)至D600=0.8,室溫靜置 4 h;將P19、RFP、EGL3基因按0.5∶1∶1的體積比混勻,用1 mL滅菌的去掉針頭的注射器,注射種植時(shí)間為1個(gè)月的煙草葉片背面。將注射后的煙草置于氣候室,氣候室條件為:光/暗時(shí)間為16 h/8 h,光/暗溫度為22 ℃/18 ℃。3 d后利用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.6 病毒誘導(dǎo)的基因沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

pTY-BcEGL3的載體構(gòu)建主要采用楊學(xué)東等[14]的方法。BcEGL3選取的40 bp序列為:5′-TAAAGAAACACCTCGCAGTTTCAGTTCGAAACATTCAATG-3′,在南京金斯瑞生物科技有限公司分別合成反向互補(bǔ)序列80 bp。pTY載體用NdeⅠ酶切后,用T4連接酶與合成好的DNA片段過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取陽(yáng)性單克隆,測(cè)序驗(yàn)證。提取pTY-BcEGL3質(zhì)粒,用金粉包埋后,用基因槍(1 000 psi)導(dǎo)入到7葉期的NJZX1-3中,以pTY空載質(zhì)粒的NJZX1-3(pTY-S)作為對(duì)照,20 d后,觀察植株表型變化。選取pTY載體中的CP(coat protein)基因片段設(shè)計(jì)特異引物(CP-F:5′-TCCACCCTCACCACCTTC-3′和CP-R:5′-GGGACAGACCTCGCTAACT-3′),PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株[15]。

1.7 不結(jié)球白菜總花青苷含量的測(cè)定

采用董慧杰[2]的方法并稍加改動(dòng)。取冷凍干燥葉片 0.1 g,用液氮研磨后,加入1.5 mL酸化乙醇(用體積分?jǐn)?shù)為5%的HCl進(jìn)行酸化),在適當(dāng)搖晃、避光條件下浸提24 h。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

根據(jù)克隆所得EGL3基因的cDNA全長(zhǎng)序列,采用在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)正、反引物(表1),Actin基因作為內(nèi)參。試驗(yàn)步驟及用量參考SYBRPremixExTaqTMNJZX1-0Ⅱ(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)總體系20 μL:模板1 μL,正、反引物各0.5 μL,SYBRPremixExTaq10 μL,ddH2O 8 μL。采用2-ΔΔCT法[16]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。程序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的兩步法,在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)AppliedBiosystems)上進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不結(jié)球白菜EGL3基因的克隆及序列分析

分別從NJZX1-3和NJZX1-0中分離出2個(gè)cDNA克隆片段,測(cè)序結(jié)果(圖2)顯示,這2個(gè)片段的基因序列完全一致,長(zhǎng)1 821 bp,將其命名為BcEGL3。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,BcEGL3含有1個(gè)長(zhǎng)為1 818 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼606個(gè)氨基酸,其中含酸性氨基酸63個(gè),堿性氨基酸84個(gè)。

圖2 不結(jié)球白菜EGL3基因的核苷酸序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and deduced amino acids sequence of EGL3 gene in Brassica campestris ssp. chinensis

2.2 BcEGL3蛋白的特征分析

對(duì)BcEGL3蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示,該蛋白的等電點(diǎn)為4.98,分子結(jié)構(gòu)式為C5469H9119N1821O2289S354,相對(duì)分子質(zhì)量為6.795×104,為親水性蛋白。氨基酸組成中Ala(a)丙氨酸所占比例最大。保守域分析結(jié)果表明,EGL3蛋白屬于bHLH-MYC-N超家族。利用在線軟件SOPMA預(yù)測(cè)EGL3編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明(圖3),EGL3含有α-螺旋236個(gè)(38.94%),無(wú)規(guī)則卷曲281個(gè)(46.37%),含有β-轉(zhuǎn)角23個(gè)(3.80%)和延伸鏈66個(gè)(10.89%)。EGL3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本相符。

圖3 BcEGL3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 The predicted secondary structure of BcEGL3 protein圖中藍(lán)色為α-螺旋,紅色為β-折疊,綠色為β-轉(zhuǎn)角,紫色為無(wú)規(guī)則卷曲。In figure,blue represents alpha helix,red represents beta folding,green represents beta corner and purple represents irregular curling.

圖4 BcEGL3蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 The predicted tertiary structure of BcEGL3 proteina. α-螺旋α-helix;b.延伸鏈 Extended strand;c.隨機(jī)卷曲 Random coils.

2.3 BcEGL3蛋白的同源性比較及進(jìn)化樹(shù)分析

利用BLASTp對(duì)BcEGL3蛋白序列進(jìn)行同源檢索,并進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果(圖5)顯示:在7個(gè)物種的EGL3蛋白序列中,BcEGL3蛋白與大白菜中的EGL3同源性高達(dá)99.90%,其次是油菜和甘藍(lán),同源性分別為98.68%和98.46%。

圖5 BcEGL3蛋白和其他物種EGL3蛋白的同源性比較Fig.5 Homologous alignment of amino acid sequences of BcEGL3 and EGL3 in other species 1.不結(jié)球白菜Brassica campestris ssp. chinensis;2.大白菜Brassica rapa ssp. pekinensis(XM_009114683.2);3.甘藍(lán)Brassica oleracea(XM_013751484.1);4.蘿卜Raphanus sativus(XM_018597840.1);5.琴葉擬南芥Arabidopsis lyrata subsp. lyrata(XM_021010124.1);6.亞麻芥Camelina sativa(XM_010475309.2);7.擬南芥Arabidopsis thaliana(NM_001198373.2).

根據(jù)蛋白質(zhì)的序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù),結(jié)果(圖6)表明,EGL3蛋白的進(jìn)化關(guān)系與植物學(xué)分類一致,不同物種之間有明顯的種屬關(guān)系。十字花科植物歸為一大類,包括蕓薹屬這一小支,屬于其他科屬的植物也各自分別歸類。BcEGL3蛋白與歐洲油菜、大白菜、甘藍(lán)和蘿卜中的EGL3蛋白聚為同一組,彼此親緣關(guān)系較近,表明BcEGL3蛋白可能具有相似的編碼和調(diào)控功能。

圖6 BcEGL3蛋白與其他物種中EGL3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of BcEGL3 protein and EGL3 proteins in other species

2.4 BcEGL3亞細(xì)胞定位分析

由圖7可見(jiàn):pRI101-BcEGL3熒光表達(dá)載體在GFP通道下可以被激發(fā),發(fā)出明顯的綠色熒光信號(hào)。細(xì)胞核marker用來(lái)標(biāo)識(shí)細(xì)胞核的位置,在RFP通道下發(fā)出明顯的紅色熒光信號(hào)。利用激光共聚焦顯微鏡觀察注射3 d后的煙草葉片,發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)和紅色熒光信號(hào)在細(xì)胞核位置重疊。表明BcEGL3蛋白定位于細(xì)胞核中。

圖7 BcEGL3在本氏煙葉片細(xì)胞中的定位Fig.7 Subcellular localization of BcEGL3 in leaves of Nicotiana benthamiana

2.5 BcEGL3基因沉默后不結(jié)球白菜紫色材料的表型變化

由圖8可見(jiàn):與NJZX1-3植株相比,轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3或轉(zhuǎn)pTY-S的植株葉片表現(xiàn)為紫色變淺,并伴有斑駁的癥狀;同時(shí)轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3與轉(zhuǎn)pTY-S植株相比葉片顏色由紫色轉(zhuǎn)為綠色。表明BcEGL3基因會(huì)影響紫色材料葉片顏色變化。

圖8 BcEGL3基因沉默后不結(jié)球白菜植株表型對(duì)比Fig.8 Phenotypic comparison of plants after BcEGL3 gene silencing in Brassica campestris ssp. chinensispTY-S和 pTY-BcEGL3分別表示轉(zhuǎn)pTY-S和pTY-BcEGL3的植株。下同。pTY-S and pTY-BcEGL3 indicate transgenic pTY-S and pTY-BcEGL3 plants,respectively. The same as follows.

2.6 BcEGL3基因沉默對(duì)不結(jié)球白菜紫色材料中色素含量變化的影響

由圖9可知:在病毒侵染20 d后,不同植株中總花青苷含量從大到小依次為NJZX1-3、轉(zhuǎn)pTY-S植株、轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3植株、NJZX1-0,且轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3與轉(zhuǎn)pTY-S植株相比總花青苷含量降低77.83%。NJZX1-0植株總?cè)~綠素含量最高;與NJZX1-3植株相比,轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3和轉(zhuǎn)pTY-S植株葉片的總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量分別降低21.10%、28.44%和18.44%、25.84%,轉(zhuǎn)pTY-S植株和轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3植株相比總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量無(wú)明顯變化。

圖9 BcEGL3基因沉默后不結(jié)球白菜葉片中色素含量的變化Fig.9 The changes of pigment content after BcEGL3 gene silencing in Brassica campestris ssp. chinensis

2.7 BcEGL3基因沉默后不結(jié)球白菜BcEGL3和BcDFR基因的表達(dá)分析

由圖10可見(jiàn):轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3植株中BcEGL3基因的相對(duì)表達(dá)量比轉(zhuǎn)pTY-S降低75.64%,且與NJZX1-0植株中表達(dá)量相接近,表明BcEGL3基因已被沉默,且會(huì)對(duì)葉片顏色產(chǎn)生影響。

圖10 BcEGL3基因沉默后不結(jié)球白菜BcEGL3和BcDFR基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Relative expression level of BcEGL3 and BcDFR genes in Brassica campestris ssp. chinensis after BcEGL3 gene silencing

BcDFR基因相對(duì)表達(dá)量由大到小依次為:NJZX1-3、轉(zhuǎn)pTY-S植株、轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3植株、NJZX1-0,其中轉(zhuǎn)pTY-BcEGL3植株比轉(zhuǎn)pTY-S植株降低61.62%,說(shuō)明BcEGL3基因的沉默會(huì)使BcDFR基因表達(dá)量下降,進(jìn)而影響不結(jié)球白菜花青苷的含量及葉片的顏色變化。

2.8 遮光后不結(jié)球白菜花青苷含量及BcEGL3基因表達(dá)分析

由圖11可見(jiàn):遮光3 d后不結(jié)球白菜葉片中花青苷含量開(kāi)始下降,5 d時(shí)比對(duì)照降低68.39%;在11 d時(shí)葉片中花青苷含量下降幅度最大,比對(duì)照降低76.04%。另外,遮光后BcEGL3基因相對(duì)表達(dá)量呈下降—上升—下降的變化趨勢(shì),與對(duì)照相比在3和14 d時(shí)下降幅度最為明顯,分別下降75.62%和79.24%。

圖11 不結(jié)球白菜花青苷含量和BcEGL3基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.11 The anthocyanin content and relative expression level of BcEGL3 gene in Brassica campestris ssp. chinensis

3 討論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中存在最廣泛的一大類轉(zhuǎn)錄因子[17],在植物激素響應(yīng)、光形態(tài)發(fā)生和花器官發(fā)育等多種生理過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用[18]。它可以與MYB轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白形成三元復(fù)合體,協(xié)同調(diào)控花青苷生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控花青苷的積累[19]。在擬南芥中bHLH類轉(zhuǎn)錄因子EGL3、GL3、TT8通過(guò)和TTG1以及MYB類轉(zhuǎn)錄因子TT2或PAP1互作來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)花青苷結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控[20]。本研究中在NJZX1-3和NJZX1-0中克隆獲得序列一致的BcEGL3基因,序列長(zhǎng)1 821 bp,編碼606個(gè)氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明,EGL3蛋白屬于bHLH-MYC-N超家族。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明,BcEGL3蛋白與大白菜BraEGL3關(guān)系最近,同源性高達(dá)99.9%。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,BcEGL3蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi),說(shuō)明該蛋白在細(xì)胞核中發(fā)揮功能。據(jù)報(bào)道,花青苷的生物合成易受光照條件的影響,在光照條件下MS培養(yǎng)基上的擬南芥幼苗中花青苷的合成增加[2]。在本研究中,遮光處理5 d后的NJZX1-3葉片中花青苷含量明顯低于對(duì)照,而B(niǎo)cEGL3基因在遮光處理后表達(dá)量都低于對(duì)照組。由此推斷,遮光在一定程度上抑制BcEGL3基因的表達(dá)從而抑制花青苷的合成。

調(diào)節(jié)花青苷生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子大多屬于Ⅲf亞類,通過(guò)抑制或者過(guò)表達(dá)花青苷合成相關(guān)的bHLH基因來(lái)影響植物體內(nèi)花青苷的積累[21-22]。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)是轉(zhuǎn)錄后的基因沉默方法,常用作對(duì)特定基因功能的研究,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于反向遺傳學(xué)研究[23]。目前VIGS技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到許多植物中,例如用VIGS技術(shù)沉默小麥淀粉合成的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因WSR1后,籽粒內(nèi)支鏈淀粉、總淀粉和抗性淀粉含量顯著增加,表明WSR1基因負(fù)向調(diào)控小麥的淀粉合成[24]。用VIGS技術(shù)對(duì)‘澳洲青蘋(píng)’果實(shí)Homeobox 1轉(zhuǎn)錄因子基因MdHB-1沉默后,果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放速率受到顯著抑制,果實(shí)硬度、可溶性固形物和可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降延緩,證明MdHB-1基因參與果實(shí)的成熟衰老過(guò)程[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在沉默轉(zhuǎn)基因植株中BcEGL3基因表達(dá)量較轉(zhuǎn)pTY-S植株降低75.64%,沉默效果與楊學(xué)東等[14]沉默白菜八氫番茄紅素脫氫酶基因(BcPDS)的效果基本一致。這表明在NJZX1-3材料中BcEGL3基因的表達(dá)得到有效抑制,沉默轉(zhuǎn)基因植株中花青苷的積累降低,葉片顏色由紫色變?yōu)榫G色。與NJZX1-3相比，轉(zhuǎn)pTY-S植株花青苷含量降低 38.11%,由此推斷,病毒會(huì)使天然色素發(fā)生少量降解;葉片顏色可能與花青苷和葉綠素含量的比值有關(guān);BcEGL3基因能正向調(diào)控總花青苷的積累,但對(duì)總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的積累無(wú)影響。本研究還發(fā)現(xiàn),在沉默轉(zhuǎn)基因植株中BcDFR基因表達(dá)量與BcEGL3基因的表達(dá)量正相關(guān),表明BcEGL3可能是通過(guò)調(diào)控BcDFR基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響花青苷的積累。

綜上所述,本試驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR、亞細(xì)胞定位、遮光處理及基因沉默等方法對(duì)BcEGL3基因的功能進(jìn)行探索和驗(yàn)證,結(jié)果表明BcEGL3位于細(xì)胞核,遮光會(huì)抑制BcEGL3基因的轉(zhuǎn)錄水平。另外,BcEGL3基因沉默可以降低BcDFR基因的表達(dá),進(jìn)而影響不結(jié)球白菜紫色材料中花青苷的積累及植株葉片紫色的呈現(xiàn)。下一步我們將從分子水平進(jìn)一步解析花青苷的合成機(jī)制,為改善紫色不結(jié)球白菜優(yōu)良性狀,提高其品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。