郗蒙雪,戴鵬遠(yuǎn),沈丹,李春梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)家畜環(huán)境控制與智慧生產(chǎn)研究中心,江蘇 南京 210095)

集約化畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中可產(chǎn)生大量的顆粒物(particulate matter,PM)、氨氣(NH3)、硫化氫(H2S)等空氣污染物,它們能夠通過呼吸進(jìn)入肺泡,增加患呼吸系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn),危害畜禽健康[1]。柏仕均等[2]研究報(bào)道,雞舍空氣粉塵污染致雞出現(xiàn)呼吸道黏膜干燥、萎縮等癥狀。申慧敏等[3]發(fā)現(xiàn),雞舍中NH3、H2S等有害氣體容易通過鼻腔進(jìn)入呼吸道,造成呼吸困難、氣管炎和支氣管炎、肺水腫、呼吸機(jī)能紊亂等現(xiàn)象,嚴(yán)重危害雞的機(jī)體健康和生產(chǎn)性能。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells,AECⅡ)是肺泡內(nèi)重要的功能和結(jié)構(gòu)細(xì)胞[4]。AECⅡ細(xì)胞能夠分化為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞,具有無限增殖能力,促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞再生與修復(fù),維持上皮細(xì)胞的完整性[5]。AECⅡ細(xì)胞還具有肺水轉(zhuǎn)運(yùn)功能,可消除肺水腫[6]。AECⅡ細(xì)胞還可以分泌表面活性物質(zhì),抵御病原體的入侵[7]。除此之外,它還能夠分泌一些抗炎、抗菌物質(zhì),提高免疫功能[8-9]。因此,AECⅡ細(xì)胞是多種肺部疾病發(fā)病的攻擊靶點(diǎn)[10-11],已有大量研究表明,許多肺部疾病的發(fā)生與發(fā)展伴有AECⅡ細(xì)胞的損傷,甚至是死亡[12-13]。因此,在有關(guān)雞舍空氣污染物對(duì)雞肺泡功能及肺部炎癥損傷的研究中,雞的AECⅡ細(xì)胞是非常重要的體外細(xì)胞模型。盡管目前國內(nèi)外已有大量對(duì)大鼠、小鼠、牛等[14]的AECⅡ細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的相關(guān)報(bào)道,但是在禽類的研究較少。有試驗(yàn)表明,AECⅡ細(xì)胞在培養(yǎng)過程中貼壁速度慢,不易增殖分裂,不易傳代[15],而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞形態(tài)和功能逐步喪失[16],因此目前尚未有雞AECⅡ細(xì)胞株,這也限制了開展有關(guān)雞AECⅡ細(xì)胞的相關(guān)研究[17]。鑒于此,建立一套穩(wěn)定的雞AECⅡ細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法十分重要。本試驗(yàn)擬采用16日齡的雞胚,用Ⅰ型膠原酶對(duì)其進(jìn)行消化,經(jīng)差速離心、差速貼壁以及免疫吸附,以建立一套穩(wěn)定的雞胚原代AECⅡ細(xì)胞分離、純化和培養(yǎng)技術(shù),為進(jìn)一步研究雞AECⅡ細(xì)胞的生物學(xué)特性及雞舍空氣環(huán)境應(yīng)激因素對(duì)雞肺泡功能及肺部炎癥損傷研究提供體外細(xì)胞研究模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物16日齡SPF雞胚,購自江蘇省南京市特有機(jī)有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自BI公司;D-Hank’s液、雞免疫球蛋白G(IgG)、堿性磷酸酶染色試劑(偶氮偶聯(lián)法)盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司;Ⅰ型膠原酶購自鼎思生物科技有限公司;細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK19)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞AECⅡ細(xì)胞的分離取16日齡SPF雞胚,用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒。在無菌條件下,用眼科鑷子鈍端輕輕擊碎胚蛋氣室,剝開殼膜,將雞胚取出放入超凈臺(tái)。斬首剖胸后,輕輕將雙肺移至裝有 D-Hank’s液的青霉素瓶中,用無菌眼科剪將其剪成約1 mm3的小塊并剔除氣管、支氣管以及血管等非肺組織,不斷清洗直至液體清亮。去除洗液后,加入經(jīng)37 ℃預(yù)溫、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Ⅰ型膠原酶(每只雞胚約0.1～0.12 mL),轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫振蕩水浴鍋中,振蕩消化15～25 min。待消化液顏色清亮,用等量含10% FBS的DMEM終止消化,依次用150 μm、76 μm篩網(wǎng)過濾后,1 000 r·min-1低溫離心5 min,收集細(xì)胞沉淀。

1.2.2 雞AECⅡ細(xì)胞的純化與培養(yǎng)1)雞IgG包被培養(yǎng)皿。用D-Hank’s液配制1 mg·mL-1雞IgG溶液,將其按照0.15～0.20 mg·cm-2鋪于培養(yǎng)皿中,輕輕搖晃,使其完全覆蓋培養(yǎng)皿底部;將培養(yǎng)皿移至37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育5～6 h,吸棄雞IgG溶液,用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗培養(yǎng)皿2～3次,備用。2)純化細(xì)胞。用含10% FBS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀,將其接種于不經(jīng)特殊處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h,大部分成纖維細(xì)胞將會(huì)貼壁,輕輕吸取培養(yǎng)液于離心管中,800 r·min-1低溫離心10 min。離心后,棄上清液,用含10% FBS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,重復(fù)2～3次,去除成纖維細(xì)胞。吸出未貼壁的細(xì)胞,將其接種于用雞IgG包被的培養(yǎng)皿中,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h,以去除巨噬細(xì)胞。收集培養(yǎng)液于離心管中,800 r·min-1低溫離心10 min,棄上清液,用含20% FBS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀,用38 μm篩網(wǎng)過濾,去除Ⅰ型上皮細(xì)胞。將分離純化的細(xì)胞密度調(diào)整為(1.5～2.0)×106mL-1,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育15～18 h后,棄去培養(yǎng)液,用含20% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液,注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。3)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力。制備體積分?jǐn)?shù)為0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液,取100 μL純化后的細(xì)胞懸液與等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液混合,取10 μL滴入到紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板上。鏡下觀察,死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色,活細(xì)胞不被染色,呈無色透明狀,在3 min內(nèi)分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.3 雞AECⅡ細(xì)胞的鑒定1)免疫熒光染色鑒定。將細(xì)胞接種于放有蓋玻片的六孔板中,培養(yǎng)36～48 h后,每孔加入1 mL含4%的多聚甲醛,室溫固定1 h后,在0.5%TritonX-100中通透10 min,PBS清洗3次后,用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS室溫封閉1 h,CK19一抗1∶100稀釋,37 ℃避光孵育1 h,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照染色。用Alexa Fluox488標(biāo)記的二抗(1∶200)37 ℃避光孵育1 h,PBS清洗3次后加入3 μg·mL-14′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育10 min,滴加抗淬滅劑,封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。2)堿性磷酸酶染色鑒定。制作細(xì)胞爬片,24 h后用固定液固定3 min左右,按照堿性磷酸酶染液試劑盒提供的方法配制底物應(yīng)用液,將底物應(yīng)用液滴加到細(xì)胞爬片上,37 ℃避光孵育15 min。同時(shí),用PBS代替底物應(yīng)用液制作陰性對(duì)照。孵育完成后,水洗2 min,用復(fù)染液復(fù)染30 s,蒸餾水洗1 min左右,甩干,鏡檢。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 雞AECⅡ細(xì)胞的產(chǎn)量、純度和活力

本研究將16日齡雞胚肺組織消化分離,得到的細(xì)胞懸液再經(jīng)過差速離心、差速貼壁、免疫吸附純化細(xì)胞后,最終每個(gè)雞胚獲得的雞AECⅡ細(xì)胞數(shù)可達(dá)(1.75±0.25)×107,細(xì)胞純度在90%以上,細(xì)胞活力為92%左右(表1)。

表1 雞AECⅡ細(xì)胞的產(chǎn)量、純度和活力(n=5)Table 1 Yield,purity and viability of chicken AECⅡ cells

2.2 雞AECⅡ細(xì)胞的培養(yǎng)特性

如圖1所示:16日齡的雞胚經(jīng)過細(xì)胞提取、純化培養(yǎng)后,約18～24 h時(shí)細(xì)胞伸展貼壁,呈多邊形或立方形,胞內(nèi)有大量細(xì)小顆粒,胞間緊密連接,形成島嶼狀;培養(yǎng)24～72 h,細(xì)胞增殖代謝旺盛,胞核明顯,胞漿豐富,細(xì)胞之間逐漸連接形成單層;培養(yǎng)72 h后,細(xì)胞內(nèi)細(xì)小顆粒有所減少,細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄健?/p>

圖1 倒置顯微鏡下原代培養(yǎng)不同時(shí)間的雞AECⅡ細(xì)胞(×100)Fig.1 Morphology of primary cultured chicken AECⅡ cells at different time under an inverted microscope(× 100)

2.3 雞AECⅡ細(xì)胞的免疫熒光鑒定

如圖2所示:CK19是上皮細(xì)胞特有的標(biāo)志蛋白,在CK19+(陽性)染色組中,細(xì)胞胞漿呈綠色熒光,即CK19染色呈陽性,細(xì)胞核被DAPI復(fù)染后呈現(xiàn)為藍(lán)色,且大部分細(xì)胞為CK19+DAPI+雙陽性細(xì)胞,也有個(gè)別未呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞;而CK19-(陰性)染色組中,細(xì)胞胞漿無著色,細(xì)胞核被DAPI復(fù)染后呈現(xiàn)為藍(lán)色。

圖2 免疫熒光檢測(cè)原代培養(yǎng)的雞AECⅡ細(xì)胞Fig.2 Chicken AECⅡ cells detected in primary culture by immunofluorescence detection

2.4 雞AECⅡ細(xì)胞的堿性磷酸酶染色鑒定

如圖3所示:細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶染色后,在倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞核被染成深紫色,堿性磷酸酶活性部位呈彌散的紅色或紅棕色顆粒,定位于細(xì)胞漿,也有個(gè)別細(xì)胞胞漿未被染色;而在陰性對(duì)照組中,細(xì)胞核呈深紫色,胞漿未見著色。

圖3 原代培養(yǎng)雞AECⅡ細(xì)胞的堿性磷酸酶染色結(jié)果Fig.3 Chicken AECⅡ cells stained by alkaline phosphatase in primary culture

3 討論

目前,肺臟AECⅡ細(xì)胞分離的方法主要包括全肺灌注消化法和肺組織塊消化法[18]。由于雞肺比較小,不適宜采用全肺灌注消化法[19],因此本試驗(yàn)采用肺組織塊消化法。AECⅡ細(xì)胞分離時(shí)可選用多種消化酶,一般包括胰蛋白酶、彈性蛋白酶以及膠原酶[20-21]。胰蛋白酶價(jià)格便宜,適用范圍廣,但是易受pH值、溫度、酶濃度等因素的影響,對(duì)細(xì)胞的損傷較大。彈性蛋白酶能夠消化結(jié)締組織中的彈性蛋白,消化效果好,幾乎對(duì)細(xì)胞形態(tài)、活力、功能等無影響,但是其價(jià)格昂貴,不易獲得[22]。膠原酶能夠很好地消化細(xì)胞間質(zhì),對(duì)細(xì)胞的損傷小,消化效果好[19]。Ⅳ型膠原酶對(duì)哺乳動(dòng)物組織具有廣譜消化作用,而Ⅰ型膠原酶主要用于消化肺、上皮等。本試驗(yàn)選用Ⅰ型膠原酶,在37 ℃條件下消化雞胚肺組織20 min左右可達(dá)到理想消化效果,與侯海燕等[19]采用Ⅳ型膠原酶和胰酶相比,對(duì)細(xì)胞損傷小,消化效果好,步驟簡單,易操作。

雞胚肺組織消化后所得的細(xì)胞懸液中有多種不同類型的細(xì)胞,因此需要進(jìn)一步純化。細(xì)胞純化時(shí)常用的方法有差速離心、差速貼壁、流式細(xì)胞儀分選、密度梯度離心、免疫吸附等[23-25],這些方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。本試驗(yàn)選用差速離心、差速貼壁以及免疫吸附相結(jié)合的方法進(jìn)行細(xì)胞純化,所得細(xì)胞純度高、活力強(qiáng)。800～1 000 r·min-1離心時(shí),部分成纖維細(xì)胞因無法沉淀而滯留在上清液中,所以吸棄上清液可以去除部分成纖維細(xì)胞。因?yàn)槌衫w維細(xì)胞和AECⅡ細(xì)胞貼壁時(shí)間不同,成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間約 30～40 min,AECⅡ細(xì)胞貼壁時(shí)間約10～20 h,經(jīng)過2次貼壁,可有效去除成纖維細(xì)胞。細(xì)胞懸液中還有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等,這些細(xì)胞表面有IgG的Fc受體,雞IgG能夠與之結(jié)合,利用此特點(diǎn)進(jìn)行免疫吸附純化細(xì)胞[26]。此時(shí),所得細(xì)胞為雞肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞(AECⅠ)和雞AECⅡ細(xì)胞,AECⅠ大小為50～100 μm,經(jīng)過38 μm篩網(wǎng)過濾后,即為純化后的雞AECⅡ細(xì)胞。

細(xì)胞骨架蛋白CK19是上皮組織來源的特異性標(biāo)志物,說明細(xì)胞具有上皮細(xì)胞的特質(zhì)[27-28]。但是,肺泡上皮細(xì)胞分為Ⅰ型上皮細(xì)胞和Ⅱ型上皮細(xì)胞[29-30]。為了進(jìn)一步鑒定這些細(xì)胞為雞AECⅡ細(xì)胞,本試驗(yàn)選擇堿性磷酸酶染色法。堿性磷酸酶可作為AECⅡ細(xì)胞分化的標(biāo)志,主要存在于細(xì)胞膜。采用堿性磷酸酶法染色后,成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞均為陰性,AECⅡ細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈陽性,但是,中性粒細(xì)胞體積小,細(xì)胞核呈分葉狀,明顯區(qū)別于AECⅡ細(xì)胞[19,31]。因此,免疫熒光檢測(cè)和堿性磷酸酶染色相結(jié)合的方法,操作簡單易行,并且確保鑒定的準(zhǔn)確性。

綜上所述,本試驗(yàn)利用16日齡雞胚的肺組織,采用Ⅰ型膠原酶進(jìn)行消化,差速離心、差速貼壁和免疫吸附方法純化細(xì)胞,并利用免疫熒光檢測(cè)和堿性磷酸酶染色相結(jié)合的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定,最終獲得穩(wěn)定、純化的雞AECⅡ細(xì)胞。建立的雞AECⅡ細(xì)胞分離、純化和培養(yǎng)體系,操作簡單,易于推廣,可滿足一般試驗(yàn)需求。