張秋婷,關(guān)如婷,潘俊慧,楊興淼,謝盛達,余都,王學(xué)飛,曹瑞兵

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

流行性乙型腦炎是一種由日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染引起的人畜共患傳染病,主要流行于東亞和南亞地區(qū),我國是該病的高發(fā)區(qū)。JEV是黃病毒科黃病毒屬成員之一,庫蚊是其主要的傳播媒介。豬和野生水禽是JEV主要的自然宿主。豬是JEV在自然界的主要擴增宿主,產(chǎn)生高病毒血癥,影響蚊媒的病毒陽性率,促進JEV在人類感染與傳播[1-2]。不同于人和馬會出現(xiàn)致死的腦炎癥狀,商品豬感染JEV癥狀通常不明顯,懷孕母豬會出現(xiàn)死胎和流產(chǎn),公豬出現(xiàn)睪丸炎等繁殖障礙癥狀[3]。

作為一種嗜神經(jīng)的病毒,JEV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中的易嗜細胞主要是位于大腦皮層和丘腦的椎體神經(jīng)元和脊髓的大神經(jīng)元[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)JEV不僅對CNS具有強烈的趨向性,而且對次級淋巴組織特別是扁桃體具有較強的趨向性[5]。扁桃體可較長時間攜帶JEV,且病毒滴度相對較高。JEV可在豬間無載體接觸(口鼻接觸)傳播[6-8],有人推測豬扁桃體持續(xù)帶毒可能與此相關(guān)[9]。豬扁桃體是一組淋巴上皮組織,能夠參與局部和系統(tǒng)的細胞和體液免疫[10]。扁桃體含有大量的免疫細胞,如T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和M細胞等,這些細胞相互協(xié)同,組成宿主的免疫保護屏障[11]。但也有一些細菌和病毒利用扁桃體作為進入、初次復(fù)制和定殖的場所[12],如豬瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV)感染豬扁桃體隱窩上皮細胞[13]。

扁桃體是JEV感染豬的重要外周器官,但JEV感染豬扁桃體的細胞嗜性至今未知。本試驗探究JEV NJ2008株感染仔豬的病毒血癥和鼻拭子中病毒排出的情況,并鑒定JEV在扁桃體中的細胞嗜性,為進一步探究JEV感染和傳播機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

JEV NJ2008株(GenBank ID:GQ918133)、JEV E鼠源單抗由本課題組保存;JEV NS3兔源單抗購自GeneTEX公司;豬CD11b兔源單抗和豬CD163兔源單抗購自Abcam公司;豬MHC Ⅱ鼠源單抗購自 BIO-RAD 公司;豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒為武漢科前生物公司產(chǎn)品;病毒RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司;RT-PCR試劑盒(HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)購自諾唯贊公司;免疫組化試劑盒(SP R&B HRP KIT)購自康為世紀公司。

1.2 仔豬JEV抗體水平檢測

4頭60日齡健康杜長大三元雜交豬,購自南京某豬場,采集各組仔豬血清樣品,按照ELISA試劑盒的使用說明書檢測JEV抗體水平。反應(yīng)室溫度控制在18～25 ℃,用酶標儀測量樣品D630值。按說明書以如下公式計算S/P值。S/P≥0.21判定為陽性;S/P<0.21判定為陰性。

S/P=(D630樣品平均-D630陰性對照平均)/(D630陽性對照平均-D630陰性對照平均)。

1.3 動物試驗及處理

4只商品仔豬在實驗動物房飼養(yǎng)4周后,經(jīng)采血檢測其JEV抗原、抗體均為陰性,臨床表現(xiàn)健康。將其分為A、B 2組,A組3只為攻毒組,每只仔豬分別頸部皮下及靜脈各注射1×107TCID50·mL-1的JEV NJ2008 株1 mL。B組1只,為空白對照組,注射相同劑量的生理鹽水。試驗豬分欄飼養(yǎng)于實驗動物中心,自由飲水和采食。每天對動物進行體溫、食欲等臨床檢查和觀察,并從4只仔豬采集血液和口、鼻拭子。攻毒后每天測量4只豬直腸體溫,觀察臨床癥狀,分別在攻毒后3、5、7 d解剖感染組1只仔豬,采集扁桃體、腦、淋巴結(jié)等組織樣品,分別進行組織固定和-80 ℃保存?zhèn)溆?。對照組仔豬于攻毒后7 d解剖并做相同處理。

1.4 病毒基因檢測

1.4.1JEV基因檢測引物的設(shè)計為檢測豬血清、鼻拭子和扁桃體等組織樣品中是否存在JEV,參考JEV基因組序列(GenBank ID:GQ918133)設(shè)計qPCR檢測上/下游引物序列:F:5′-GGCAAACGACAAACCAACATT-3′/R:5′-ATCAGCTCGCTTCTCGTTGTG-3′。

1.4.2 病毒RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及qPCR檢測使用病毒RNA提取試劑盒對豬血清、處理后的鼻拭子浸液和組織樣品研磨上清液進行病毒RNA提取。使用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行qPCR。qPCR反應(yīng)體系:SYBR Green Mix 10 μL,上、下游引物即Rox各0.4 μL,cDNA模板2 μL,DEPC水6.8 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,樣品CT≤30判定為JEV基因陽性;同時核對擴增曲線、熔解曲線,并隨機取qPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測

將保存于含4%多聚甲醛的組織固定液中的扁桃體、腦、淋巴結(jié)樣品進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片后再進行免疫組化檢測。免疫組化使用SP R&B HRP試劑盒。試驗中使用抗體為JEV 結(jié)構(gòu)蛋白E和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3單抗。

1.6 組織免疫熒光檢測

將采集并保存于含4%多聚甲醛的組織固定液中的組織樣品進行免疫熒光檢測。組織樣品的處理及切片制作過程參照1.5節(jié)。組織經(jīng)0.1% Triton X-100透膜處理后,分別加兔源CD11b抗體+鼠源JEV E蛋白單抗、兔源CD163抗體+鼠源JEV E蛋白單抗、鼠源豬MHC Ⅱ抗體+兔源JEV NS3蛋白單抗,4 ℃孵育過夜。用對應(yīng)種屬的熒光二抗Alexa Fluor Plus 555(抗鼠二抗)和Alexa Fluor Plus 488(Invitrogen,抗兔二抗)孵育。洗滌后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,凱基生物)染色,洗滌后用激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照,按照從左到右、從上到下、再選中央的原則拍照并統(tǒng)計5個視野各指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬血清JEV抗體水平及臨床癥狀

購入仔豬1周后進行JEV抗體水平的第1次檢測,由于母源抗體影響JEV抗體呈陽性,繼續(xù)對仔豬飼養(yǎng)3周后,第2次檢測時所有仔豬JEV抗體水平均為陰性。試驗時仔豬為90日齡。所有仔豬在7 d的試驗中均未出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象和明顯的臨床癥狀。

2.2 感染仔豬JEV病毒血癥檢測結(jié)果

對攻毒后的仔豬每天采血,應(yīng)用qPCR方法對血清進行JEV檢測。病毒血癥檢測結(jié)果見表1。JEV NJ2008株攻毒(A)組3頭仔豬僅在攻毒后的1～2 d檢測到病毒血癥,3～7 d均為陰性。B1仔豬為陰性對照,未檢測到乙腦病毒血癥。

表1 試驗豬病毒血癥檢測結(jié)果Table 1 Viremia test results of piglets

2.3 試驗豬鼻拭子中JEV基因檢測結(jié)果

仔豬攻毒后,每天采集各組豬的鼻拭子,通過qPCR方法檢測JEV基因,檢測結(jié)果見表2。仔豬在攻毒后的1～7 d都檢測到了JEV的排出,該組所有鼻拭子樣品的中JEV基因為全陽性。B1仔豬為陰性對照,未檢測到病毒基因。結(jié)果表明JEV感染仔豬可以通過口鼻排出病毒,仔豬排出病毒的持續(xù)時間較長。

表2 試驗豬鼻拭子中病毒JEV基因檢測結(jié)果Table 2 JEV genes test results of piglets’ nasal swab

2.4 JEV感染仔豬各組織器官病毒基因檢測結(jié)果

在攻毒后的3、5、7 d,對攻毒(A)組仔豬解剖并采集組織樣品,通過qPCR方法檢測各組織是否含JEV基因。檢測結(jié)果(表3)顯示,不同仔豬病毒陽性組織存在差異,在腦、脊髓、肺和扁桃體檢測到較高水平的病毒基因,表明JEV對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和扁桃體的組織趨向性。陰性對照(B組)仔豬各組織器官未檢測到JEV基因。

表3 JEV感染仔豬組織器官中病毒基因的qPCR檢測結(jié)果Table 3 qPCR test results of various tissues and organs of JEV infection piglets

2.5 JEV感染仔豬扁桃體的組織偏嗜性

從免疫組化結(jié)果(圖1)中可以看出:攻毒仔豬A1的軟腭扁桃體淋巴小結(jié)和彌散的淋巴組織中均有JEV E抗原陽性細胞;JEV E抗原陽性細胞形態(tài)不規(guī)則,細胞核較大、染色較淡,多位于彌散的淋巴組織和淋巴小結(jié)的周邊,推測為樹突狀細胞或巨噬細胞。A2仔豬軟腭扁桃體中也存在JEV E抗原陽性細胞,A3仔豬軟腭扁桃體中未發(fā)現(xiàn)JEV E抗原陽性細胞,與qPCR檢測結(jié)果吻合。

3頭攻毒仔豬咽扁桃體、咽鼓管扁桃體、會厭扁桃體的免疫組化檢測中均未發(fā)現(xiàn)JEV E抗原陽性細胞(圖1)。而在qPCR檢測中,A1仔豬的咽扁桃體和A2、A3仔豬的會厭扁桃體均呈JEV基因陽性,推測是由于JEV在這幾個扁桃體樣本中含量較低,免疫組化方法未檢出。因此,本試驗結(jié)果顯示JEV陽性細胞主要集中于豬軟腭扁桃體中。

圖1 攻毒仔豬扁桃體組織(JEV E蛋白)免疫組化結(jié)果Fig.1 Immunohistochemistry results of piglet tonsils with JEV E protein A. A1軟腭扁桃體;B. A1軟腭扁桃體圖A局部放大;C. 陰性對照,B1仔豬軟腭扁桃體;D. 陰性對照,B1仔豬軟腭扁桃體圖C局部放大;E. A1咽扁桃體;F. A3咽鼓管扁桃體;G. A3會厭扁桃體;H. A1軟腭扁桃體。A. A1 soft palate tonsil;B. A1 soft palate tonsil in figure A enlarged partly;C. Negative control,B1 piglet soft palate tonsil;D. Negative control,B1 piglets soft palate tonsil in figure C enlarged partly;E. A1 pharyngeal tonsil;F. A3 tubal tonsil;G. A3 epiglottic tonsils;H. A1 soft palate tonsil.

2.6 JEV感染仔豬軟腭扁桃體組織中的細胞偏嗜性

為了進一步鑒定仔豬扁桃體中JEV E抗原陽性細胞,本試驗應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察JEV E抗原陽性細胞CD11b和CD163的表達情況。JEV感染仔豬軟腭扁桃體彌散淋巴組織和淋巴濾泡中可見散在分布的CD11b陽性(CD11b+)細胞,這些CD11b+細胞幾乎都呈JEV E抗原陽性,但JEV E抗原陽性細胞還有部分為CD11b陰性細胞(圖2-A—D)。在單視野中(×200),JEV E抗原陽性細胞數(shù)平均為150,雙抗原陽性細胞數(shù)平均為49。CD11b+細胞在未攻毒對照仔豬的扁桃體中主要分布于仔豬軟腭扁桃體彌散淋巴組織,淋巴濾泡中分布的數(shù)量很少(圖2-E)。

圖2 CD11b、CD163和MHC Ⅱ與JEV E在A2仔豬軟腭扁桃體中的共定位Fig.2 Colocalization of CD11b,CD163,MHC Ⅱ and JEV E in A2 piglet soft palate tonsil A. DAPI著色細胞核(藍色);B. 軟腭扁桃體內(nèi)的CD11b+細胞的分布(綠色,anti-CD11b);C. 軟腭扁桃體JEV E抗原陽性細胞的分布(紅色,anti-JEV E);D. JEV感染的CD11b+細胞(黃色,CD11b類分子與JEV E共染);E. B1軟腭扁桃體內(nèi)的CD11b+細胞的分布(綠色,anti-CD11b);F. DAPI著色細胞核(藍色);G. 軟腭扁桃體內(nèi)的CD163+細胞的分布(綠色,anti-CD163);H. 軟腭扁桃體JEV E抗原陽性細胞的分布(紅色,anti-JEV E);I. JEV感染的CD163+細胞(黃色,CD163類分子與JEV E共染);J. B1軟腭扁桃體內(nèi)的CD163+細胞的分布(綠色,anti-CD163);K. DAPI著色細胞核(藍色);L. 軟腭扁桃體MHC Ⅱ+細胞的分布(紅色,anti-MHC Ⅱ);M. 軟腭扁桃體JEV E抗原陽性細胞的分布(綠色,anti-JEV NS3);N. JEV感染的MHC Ⅱ+細胞(黃色,MHC Ⅱ類分子與JEV NS3共染);O. B1軟腭扁桃體MHC Ⅱ+類分子陽性細胞的分布(紅色,anti-MHC Ⅱ)。E、J、O各陰性扁桃體中無JEV抗原陽性細胞分布。A. DAPI stained nuclei(blue);B. Distribution of CD11b+ cells in soft palate tonsils(green,anti-CD11b);C. Distribution of JEV E antigen positive cells in soft palate tonsils(red,anti-JEV E);D. JEV infected CD11b+cells(yellow,CD11b co-stained with JEV E);E. Distribution of CD11b+ cells in B1 soft palate tonsils(green,anti-CD11b);F. DAPI stained nuclei(blue);G. Distribution of CD163+ cells in soft palate tonsils(green,anti-CD163);H. Distribution of JEV E antigen positive cells in soft palate tonsils(red,anti-JEV E);I. JEV infected CD163+cells(yellow,CD163 co-stained with JEV E);J. Distribution CD163+ cells in B1 soft palate tonsil(green,anti-CD163);K. DAPI stained nuclei(blue);L. Distribution of MHC Ⅱ+ cells in soft palate tonsils(red,anti-MHC Ⅱ);M. Distribution of JEV E antigen positive cells in soft palate tonsils(green,anti-JEV NS3);N. JEV Infected MHC Ⅱ+ cells(yellow,MHC Ⅱ co-stained with JEV NS3);O. Distribution MHC Ⅱ+ cells in B1 soft palate tonsil(red,anti-MHC Ⅱ). No distribution of JEV antigen positive cell in each negative tonsil in figure E,J and O.

CD163和JEV E抗原雙陽性細胞主要分布于軟腭扁桃體彌散淋巴組織內(nèi)和淋巴濾泡周圍,在隱窩內(nèi)皮細胞內(nèi)的CD163+細胞多數(shù)呈JEV E抗原陰性(圖2-F—I)。在單視野中(×200),JEV E抗原陽性細胞數(shù)平均為126,雙抗原陽性細胞數(shù)平均為42。CD163+細胞在未攻毒對照仔豬扁桃體分布與攻毒組仔豬并無差異(圖2-J)。CD11b+細胞主要有樹突狀細胞、巨噬細胞、粒細胞和NK細胞,CD163+細胞主要有單核細胞和巨噬細胞,結(jié)合扁桃體中這些雙抗原陽性細胞的分布和免疫組化中陽性細胞的形態(tài)特征分析,豬軟腭扁桃體中的JEV抗原陽性細胞主要為樹突狀細胞和巨噬細胞。

鑒于樹突狀細胞和巨噬細胞均為抗原提呈細胞,細胞中JEV E抗原陽性有兩種可能,一是吞噬獲得的外源病毒,二是感染并增殖的病毒。因此,本試驗進一步鑒定了豬扁桃體組織中JEV NS3和MHC Ⅱ雙抗原陽性細胞的情況,在單視野(×200)中,JEV NS3抗原陽性細胞數(shù)為160±5,雙抗原陽性細胞數(shù)為151±5。組織免疫熒光檢測結(jié)果顯示:MHC Ⅱ+細胞與JEV NS3抗原陽性細胞多在軟腭扁桃體彌散淋巴和扁桃體淋巴濾泡的周邊部分,扁桃體淋巴濾泡也有少量雙陽性細胞分布(圖2-K—N)。與未攻毒對照組相比,攻毒組仔豬扁桃體淋巴濾泡內(nèi)MHCⅡ+細胞減少(圖2-O)。這表明JEV 可以在豬扁桃體的兩種抗原提呈細胞——樹突狀細胞和巨噬細胞中復(fù)制。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn),JEV可以在豬之間發(fā)生非載體傳播,且可以在豬扁桃體長達25 d的持續(xù)感染[6],但JEV在豬扁桃體中的易感細胞類型至今未見報道。本試驗通過人工接種的方法建立了仔豬乙型腦炎感染模型,通過免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)豬扁桃體中JEV陽性細胞主要為樹突狀細胞和巨噬細胞等抗原提呈細胞,細胞中JEV NS3蛋白陽性驗證了病毒的感染和增殖,表明JEV可以在豬扁桃體中定殖。

本試驗中3頭接毒仔豬持續(xù)7 d的口鼻拭子中均檢測到病毒基因,2頭仔豬的軟腭扁桃體可檢測到病毒基因和病毒抗原,這與近期國內(nèi)外JEV可以通過口鼻排毒、偏嗜感染扁桃體的研究報道一致[6-8]。JEV強毒株攻毒仔豬可產(chǎn)生3～5 d的病毒血癥[5]。本試驗中攻毒仔豬未見明顯臨床癥狀,且3頭仔豬只在接毒后2 d檢測到病毒血癥,這可能與JEV毒株的毒力不夠強或仔豬日齡偏大有關(guān),也不排除血液中的病毒為靜脈注射來源。由于本文主要聚焦JEV感染后的組織學(xué)特征,所以并未進行病毒基因的定量檢測。

本試驗中通過肌肉注射和靜脈注射接種JEV的2頭仔豬，可檢測到其軟腭扁桃體病毒基因和病毒抗原,但3只仔豬的會厭扁桃體、咽扁桃體和咽鼓管扁桃體在免疫組化檢測中均未發(fā)現(xiàn)病毒抗原陽性細胞,這可能與仔豬的接毒方法有關(guān)。如果從水平傳播的角度推測,咽扁桃體和咽鼓管扁桃體應(yīng)是病毒入侵的理想靶標,而且豬咽扁桃體上皮細胞的組織結(jié)構(gòu)比軟腭扁桃體更具感染JEV的可能性。

從免疫組化檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬軟腭扁桃體中JEV 抗原陽性細胞形態(tài)不規(guī)則,細胞核較大、染色較淡。進一步通過熒光抗體標記鑒定到JEV 抗原陽性細胞多數(shù)為CD11b+或CD163+,且大多數(shù)JEV 抗原陽性細胞均表達MHC Ⅱ抗原,因此,豬軟腭扁桃體中的JEV陽性細胞多數(shù)為樹突狀細胞和巨噬細胞。這與報道的人和小鼠的JEV外周感染細胞主要為單核巨噬細胞一致[8]。與此類似,豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)也可在扁桃體組織中定殖,在扁桃體實質(zhì)內(nèi)抗原陽性細胞分散或聚集成小團,主要為巨噬細胞[12]。而豬瘟病毒(CSFV)則在豬扁桃體隱窩的淋巴上皮內(nèi)定殖,且可持續(xù)帶毒數(shù)月之久,帶毒動物幾乎沒有臨床癥狀[14]。

本試驗的目的是獲得病毒陽性組織樣品,鑒定JEV感染扁桃體的細胞嗜性,因此在接毒3、5和7 d后對仔豬剖檢取樣。JEV在豬扁桃體免疫逃逸或免疫耐受機制是學(xué)術(shù)界關(guān)注的問題,本試驗雖不能證明扁桃體長期持續(xù)帶毒，但已有文獻報道JEV感染豬的扁桃體持續(xù)帶毒[4]。本試驗結(jié)果顯示JEV在豬軟腭扁桃體中的易嗜細胞為巨噬細胞或樹突狀細胞等抗原提呈細胞,為探究JEV在豬扁桃體中的持續(xù)感染機制提供了關(guān)鍵的參考依據(jù)。