蘇明偉，張 蕾，陳語炘

(湖北第二師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430205)

巴戟天屬于茜草科植物，其根莖為我國傳統(tǒng)名貴南藥，亦可作為保健品食用，具有抗衰老、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)記憶及增強(qiáng)免疫力等多種功效[1-2]，其炮制方法有巴戟肉、鹽巴戟天、藥汁制巴戟天和酒制巴戟天[3]?，F(xiàn)代研究表明巴戟天含有糖類、蒽醌類、環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、氨基酸和甾醇類等多種成分[4-6]，其中多糖被認(rèn)為是促進(jìn)免疫功能、抗骨質(zhì)疏松的活性物質(zhì)[7-8]，是巴戟天檢測的重要指標(biāo)之一。巴戟天多糖的測定，目前尚未見國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法，文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要有苯酚硫酸分光光度法[9-11]和蒽酮硫酸分光光度法[12-13]，其中樣品的制備通常采用烘干后粉碎的方式，預(yù)處理采用兩步加熱回流的方式提取多糖，操作繁瑣、時(shí)間較長，不利于基層的推廣。本文以鹽巴戟天為研究對象，提出以液氮粉碎為制備方法，以超聲提取為預(yù)處理手段，開發(fā)了一套快速測定巴戟天中多糖含量的方法，為企業(yè)監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量、篩選優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

共10個(gè)批次鹽巴戟天樣品，其中4個(gè)批次由無限極中國有限公司(廣東)提供，5個(gè)批次分別購置于安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司(廣東)、廣西仙茱中藥科技有限公司、康美藥業(yè)股份有限公司(廣東)、蘇州市天靈中藥飲片有限公司和四川新荷花中藥飲片股份有限公司，1個(gè)批次由本課題組用巴戟天為原料自制，均為2017～2018年生產(chǎn)，分別編號為1～10號。

1.2 儀器及設(shè)備

TU-1950紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；KX-100高速粉碎機(jī)：武漢鼎藏日用金屬制品廠；ME104E分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市新航儀器廠；QYZH-20A超純水儀：重慶前沿水處理設(shè)備有限公司。

1.3 試劑與溶液的配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁工業(yè)公司(上海)；無水乙醇、苯酚、濃硫酸：均為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.000mg·mL-1)：精密稱取干燥后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g，溶于少量水中并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加入0.5mL濃鹽酸防止微生物生長，加水定容至刻度；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.1000 mg·mL-1)：將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋10倍，使用當(dāng)天配制；苯酚溶液(5%)：將苯酚瓶置于60℃水浴中熔化，然后移取5.00g于燒杯中，加水溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容搖勻。

1.4 樣品的制備

取一定量(約50g)鹽巴戟天樣品于高速粉碎機(jī)中，加入30mL液氮，立即快速封蓋并高速粉碎30s，打開拌勻后，重復(fù)加液氮再粉碎一次，裝入具塞寬口瓶中備用。

1.5 多糖的提取

超聲提取(本法)：精密稱取0.50g樣品粉末置于100mL錐形瓶中，加入70mL 80%乙醇溶液，60℃下超聲提取30min，趁熱過濾，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，每次8mL，棄去濾液。濾渣連同濾膜置于錐形瓶中，再加70mL純水60℃超聲提取30min，濾紙抽濾過濾，濾渣用熱水洗滌3次，每次8mL，收集水提液并冷卻定容至100mL，即得待測溶液。

加熱回流提取(對照法)：精密稱取0.50g樣品粉末置于250 mL圓底燒瓶中，加入150mL 80%乙醇溶液，于90℃水浴中回流1h，趁熱過濾，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，每次10mL，棄去濾液。濾渣連同濾膜放回圓底燒瓶中，再加150mL純水于90℃水浴中回流1h，濾紙抽濾過濾，濾渣用熱水洗滌3次，每次10mL，收集水提液并冷卻定容至250mL用來測定多糖含量。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液于25mL比色管中，各加水至2.00mL，再各加5%苯酚溶液1.00mL，搖勻，再垂直快速加入濃硫酸5.00 mL，搖勻并放置5min，置40℃水浴中20min，取出冷卻至室溫，以試劑空白為參比，于490nm波長處測量吸光度。以葡萄糖濃度c(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。

1.7 樣品測定與結(jié)果計(jì)算

分別取上述1.5超聲提取或加熱回流提取的水提液1.00mL于25mL具塞比色管中，按1.6步驟測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計(jì)算出樣品中的多糖含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)(單位mg·g-1)，其中葡萄糖換算為多糖的換算因子為0.9。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的確定

吸取一定量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液于具塞比色管中，按照1.6步驟顯色，以試劑空白為參比于紫外可見分光光度計(jì)上掃描吸收曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，顯色生成物的最大吸收波長為490nm，因此確定以490nm為最佳測定波長。

圖1 苯酚硫酸法測定葡萄糖的吸收曲線

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

按照1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制步驟進(jìn)行操作，以試劑空白為參比于490nm波長處測量吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傻帽椒恿蛩岱y定葡萄糖的回歸方程為A=63.183c+0.0062，R=0.9998，可見在0～0.0125 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 樣品的制備研究

常規(guī)的樣品制備程序一般是先將巴戟天樣品烘干 (限定60℃[14]) 后，再粉碎過篩(60目)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該過程不僅非常費(fèi)時(shí)，且樣品粉末在過篩時(shí)非常容易吸收空氣中的水分，會導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)。而中藥企業(yè)在藥材成品的常規(guī)檢測過程中一般可以對藥材中微量水分的影響忽略不計(jì)的，但若樣品不經(jīng)烘干直接粉碎，部分樣品在粉碎時(shí)會因溫度急劇升高而粘連在一起難以過篩，因此本研究擬不對樣品進(jìn)行烘干處理，嘗試直接對原樣進(jìn)行加液氮粉碎處理并比較粉碎次數(shù)對多糖測定結(jié)果的影響。

具體操作參見1.4樣品的制備，結(jié)果表明，加入液氮后樣品的粉碎效果比較理想，粉碎后顆粒較均勻分散，溫度較低不易粘連在一起，粉碎次數(shù)越多，顆粒越小越均勻。不同粉碎次數(shù)對多糖含量(超聲提取檢測)及水提液過濾時(shí)間的影響見圖2所示，隨著粉碎次數(shù)的增加，多糖測定值逐漸減小，但粉碎3次與2次的結(jié)果相差不大，而3次時(shí)顆粒很細(xì)導(dǎo)致后續(xù)水提液過濾比較困難，綜合考慮最終確定樣品加液氮粉碎2次30s為最佳制備方案。

圖2 粉碎次數(shù)對多糖含量及水提液過濾時(shí)間的影響

2.4 超聲提取條件的優(yōu)化

超聲萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù)，具有快速、安全、高效等特點(diǎn)，被廣泛用于中藥材提取的研究[15]。但目前超聲用于巴戟天中多糖含量測定的研究鮮有報(bào)道，因此本研究嘗試用超聲提取進(jìn)行巴戟天樣品的預(yù)處理。

實(shí)驗(yàn)首先比較了超聲提取溫度對多糖測定結(jié)果的影響，因超聲儀水槽的最高設(shè)定水溫為60℃，因此比較了20℃、40℃與60℃的影響，發(fā)現(xiàn)溫度越高，多糖測定值越低，而60℃的結(jié)果更接近加熱回流提取(對照法)的數(shù)值，其原因可能是較高溫度下醇提更易去除單糖和低聚糖的干擾，因此確定超聲提取的最佳溫度為60℃.

在最佳溫度下比較了兩步(醇提+水提，參見1.5)超聲提取時(shí)間對結(jié)果的影響，結(jié)果表明兩步提取時(shí)間均為30 min或60min 時(shí)樣品中多糖的檢測結(jié)果沒有明顯差異，說明超聲提取多糖的主要影響因素是溫度而非提取時(shí)間，因此確定兩步超聲提取的最佳時(shí)間均為30 min。

2.5 超聲提取與加熱回流提取的比較

因巴戟天中多糖的測定(含預(yù)處理)沒有國家標(biāo)準(zhǔn)方法可供參考，因此本研究采用文獻(xiàn)報(bào)道較多的加熱回流提取法作為對照法與超聲提取法進(jìn)行比較，試圖找出超聲提取與對照法的關(guān)聯(lián)。

對10個(gè)樣品進(jìn)行液氮粉碎制備后分別采用上述最優(yōu)超聲提取法和加熱回流提取法進(jìn)行樣品預(yù)處理并均用苯酚硫酸法測定多糖含量，重復(fù)測定三次，計(jì)算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1所示?？梢?，總體上超聲提取與加熱回流提取的精密度之間差異不大，但相同樣品的超聲提取法測定結(jié)果明顯高于加熱回流法，這可能與兩個(gè)方法的溫度差異有關(guān)，也可能與超聲的空化效應(yīng)能快速破碎細(xì)胞壁有關(guān)。同一提取方法測得不同廠家樣品的多糖含量高低不同，其中5號樣品多糖含量遠(yuǎn)高于其它樣品，具體原因不詳。

表1 超聲提取與加熱回流提取巴戟天中多糖的比較

續(xù)表1

將兩種提取方法的多糖測定均值進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見圖3所示，擬合公式為y=0.3321x+5.7767，x代表超聲提取測定結(jié)果，y代表加熱回流提取結(jié)果，R2=0.6797，線性相關(guān)系數(shù)R=0.8244，說明兩種提取方法之間有比較明顯的相關(guān)性。

圖3 超聲提取結(jié)果與加熱回流提取結(jié)果的擬合

若將超聲提取測定值用擬合公式換算成加熱回流對應(yīng)值，并以加熱回流提取的實(shí)驗(yàn)值為標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算相對誤差，具體結(jié)果見表2。由表2可知，10個(gè)不同樣品的超聲提取測定值經(jīng)換算后，與加熱回流法測定值的相對誤差均小于10%，準(zhǔn)確度上滿足快速檢測的要求。

3 結(jié)論

本文以鹽巴戟天為研究對象，建立了一套快速測定巴戟天中多糖的方法，首次將液氮粉碎和超聲提取用于巴戟天的檢測過程，實(shí)現(xiàn)了從制備到提取到檢測過程的快速化。本法操作簡便、快速，單個(gè)樣品測定時(shí)間約為3h，相對于傳統(tǒng)的樣品烘干粉碎-加熱回流提取-苯酚硫酸法檢測過程(約需12h)，時(shí)間上縮減了約3/4，且一臺超聲儀可以同時(shí)提取6個(gè)樣品，大大提高了工作效率，適用于企業(yè)大批量檢測篩選優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。本法精密度好，結(jié)果可靠，其多糖測定結(jié)果可以直接作為企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量依據(jù)，也可以通過擬合公式換算為傳統(tǒng)的加熱回流提取法的對應(yīng)結(jié)果。

表2 超聲提取換算結(jié)果與加熱回流提取結(jié)果的比較