賈 雯，郭瑞林，2

1陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院，陜西咸陽 712000 2陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，陜西咸陽 712000

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KPN)是一種醫(yī)院內(nèi)常見感染菌，現(xiàn)也可引起嚴重的社區(qū)感染，因KPN高產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶，2017年WHO已經(jīng)將KPN列為具有“危急威脅”的細菌[1- 2]。研究表明60%～80%的細菌感染，尤其是設備相關感染和慢性感染是由細菌形成生物膜引起的，生物膜形成使細菌對宿主防御機制的抵抗力增強，臨床常規(guī)抗菌治療無效[3- 4]。此外，生物膜可促進細菌間基因水平傳播，主要的機制有：生物膜形成使細菌密度增加并降低了菌間的空間距離，為基因水平轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供有利條件；生物膜中細菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄增加，其形成增高了細菌基因水平轉(zhuǎn)移頻率；同時，也有研究顯示生物膜引起的嚴格反應可上調(diào)細菌整合子的表達，整合子介導細菌抗生素耐藥基因的傳播[5- 7]。對KPN的研究顯示生物膜形成與耐碳青霉烯的分離株之間存在顯著相關性，碳青霉烯類抗生素被稱為“最后的抗生素”，而耐碳青霉烯KPN(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)除了對多種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥外，這些菌株的耐藥基因還可以通過水平轉(zhuǎn)移在不同的細菌物種之間傳播，生物膜的形成使傳播變的更頻繁[3，8]。因此，對KPN生物膜形成因素及調(diào)控機制的相關研究是臨床迫切需要解決的問題，也可為臨床抗生物膜感染治療以及新藥研發(fā)提供新的方向。本文就KPN生物膜形成的因素及調(diào)控機制的最新研究進展進行綜述。

生物膜的形成

生物膜是細菌附著在生物或非生物表面的微生物群落，細菌從浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬顟B(tài)是一個受到環(huán)境與遺傳因素高度調(diào)控的過程。生物膜形成的過程主要包括：可逆附著階段、細菌黏附聚集階段、增殖階段、生物膜成熟階段、擴散/分離階段。浮游細菌受環(huán)境刺激對各種環(huán)境信號做出應答，附著在物體表面形成菌落；在菌落群體感應系統(tǒng)的作用下持續(xù)產(chǎn)生由多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等組成的水合基質(zhì)成熟為大菌落；隨著時間的推移細菌可以從成熟的生物膜中分離，回到浮游狀態(tài)，在新的表面形成生物膜。KPN生物膜的形成主要受菌毛、多糖、群體感應系統(tǒng)、外排泵等因素的影響，菌毛和多糖主要發(fā)揮黏附和組成生物膜結(jié)構的作用，其中菌毛的黏附作用主要受c-di-GMP分子調(diào)控，莢膜多糖與脂多糖是生物膜形成中多糖黏附的主要成分，其調(diào)控受到環(huán)境中碳源的影響，群體感應系統(tǒng)則通過細菌分泌的信號分子協(xié)調(diào)菌群密度，促進生物膜成熟，外排泵的高表達在成熟生物膜中發(fā)揮作用[9]。

KPN生物膜形成的影響因素及調(diào)控機制

菌毛在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機制菌毛是腸桿菌的外部結(jié)構，主要促進細菌附著介質(zhì)表面、細菌聚集和生物膜的形成。KPN主要產(chǎn)生Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛參與生物膜的形成[10]。Ⅰ型菌毛由Fim基因簇編碼，其中FimA基因編碼的蛋白構成菌毛主要亞基，F(xiàn)imH蛋白是位于菌毛尖端的黏附素，主要黏附表面含有甘露糖成分的物質(zhì)如泌尿生殖道上皮細胞，促進生物膜形成，導致難治性尿路感染發(fā)生；由mrkABCDF操縱子編碼的Ⅲ型菌毛，主要由菌毛亞單位MrkA和小分子黏附素MrkD組成，在人體內(nèi)外均介導生物膜的形成。MrkD促進KPN黏附不同類型的細胞如氣管上皮細胞、腎小管細胞等，在人體內(nèi)形成生物膜；MrkA則主要黏附于非生物材料表面，啟動KPN在留置的導管和氣管內(nèi)管上形成生物膜[11]。研究顯示KPN產(chǎn)生的KPF菌毛和ECP菌毛可能也參與生物膜的形成，其調(diào)控機制是否與鐵吸收相關蛋白Fur蛋白相關還需進一步研究[12- 13]。而KPN菌毛除了在生物膜形成初始階段發(fā)揮作用外，也可維持莢膜多糖結(jié)構流動性，這種流動性有利于KPN之間高效黏附以形成成熟穩(wěn)定的生物膜[14- 15]。

對KPN菌毛的形成進行調(diào)控以抑制菌毛表達或破壞菌毛結(jié)構，可防止細菌發(fā)揮黏附作用，影響生物膜形成，有效控制疾病感染[16]。目前發(fā)現(xiàn)介導KPN發(fā)揮黏附與侵襲作用的膜蛋白的缺失會下調(diào)Ⅰ型菌毛的表達，進而減弱細菌的黏附定植能力。研究顯示三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運家族的Sap(sensitivity to antimicrobial peptides，Sap)轉(zhuǎn)運蛋白是KPN黏附人肝細胞和各種上皮細胞(如腸、肺和膀胱上皮細胞)的必需蛋白，SapA蛋白缺失的KPN可顯著下調(diào)Ⅰ型菌毛FimA蛋白的表達，明顯降低KPN腸道定植能力[17]。同時，有研究表明細胞內(nèi)增殖F(intracellular multiplication F，IcmF)家族蛋白是組成Ⅳ型分泌系統(tǒng)T6SS的保守內(nèi)膜蛋白，促進KPN在宿主體內(nèi)的黏附與侵襲，而IcmF1/IcmF2蛋白缺失的突變株下調(diào)Ⅰ型菌毛轉(zhuǎn)錄表達，降低KPN定植能力，但具體調(diào)控機制還需進一步研究[18]。脂蛋白BamB是錨定在革蘭陰性菌外膜蛋白周質(zhì)面的輔助結(jié)構蛋白，其表達缺失使KPN的Fim基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，Ⅰ型菌毛產(chǎn)生降低32倍，但因脂蛋白BamB缺失表達影響外膜結(jié)構的完整性，對Ⅰ型菌毛的調(diào)控還需進一步研究[19]。除了Ⅰ型菌毛，大量研究表明Ⅲ型菌毛是KPN生物膜形成的主要影響因子，對它表達的調(diào)控可顯著下調(diào)生物膜的形成。c-di-GMP是一種受體廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可協(xié)調(diào)細菌多種生理過程以利于細菌適應環(huán)境變化。研究表明c-di-GMP通過調(diào)節(jié)與Ⅲ型菌毛基因簇相鄰的操縱子mrkHIJ影響菌毛的合成，其中MrkI是LuxR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可激活其自身的操縱子并調(diào)節(jié)Ⅲ型菌毛表達，MrkH是Ⅲ型菌毛基因簇的核心轉(zhuǎn)錄激活因子，與c-di-GMP結(jié)合正反饋激活Ⅲ型菌毛表達，是引發(fā)生物膜形成的主要機制，這使其成為防止生物膜形成的理想靶標，而MrkJ通過編碼磷酸二酯酶降解c-di-GMP，從而影響MrkH轉(zhuǎn)錄激活因子的活性，抑制Ⅲ型菌毛表達[20]。組蛋白樣核苷結(jié)構蛋白H-NS是Ⅲ型菌毛基因表達的正調(diào)節(jié)劑，在H-NS缺失的情況下，mrkA基因表達被抑制，KPN生物膜形成減少了10倍[21]。不同的環(huán)境刺激菌毛的調(diào)控機制也不同，如可感應滲透信號OmpR/EnvZ雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)和含F(xiàn)e-S簇的轉(zhuǎn)錄因子IscR分別在高滲環(huán)境下和含鐵的環(huán)境下通過直接或者間接影響c-di-GMP水平調(diào)控Ⅲ型菌毛的形成[22- 23]；人體內(nèi)的肺表面活性劑磷脂酰膽堿和膽固醇也可誘導mrkA啟動子的轉(zhuǎn)錄提高Ⅲ型菌毛的表達介導KPN生物膜形成[24]。第二信使環(huán)狀單磷酸腺苷cAMP-cAMP受體蛋白(cyclic AMP receptor protein，CRP)也是全局調(diào)節(jié)蛋白之一，主要參與細菌的碳代謝物抑制過程，近期研究表明，其也可作用于Ⅰ型和Ⅲ型菌毛調(diào)控機制介導菌毛表達[25]，并且在Ⅲ型菌毛的mrk操縱子上游區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了潛在的CRP結(jié)合位點，可正調(diào)控該操縱子的表達，促進Ⅲ型菌毛的合成[26]。菌毛起源于細菌膜內(nèi)側(cè)基粒上，目前已發(fā)現(xiàn)KPN膜蛋白表達的完整性對菌毛表達和結(jié)構的穩(wěn)定性起至關重要的作用，但具體的作用蛋白和調(diào)控靶點還需進一步地探索。同時，高效轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子c-di-GMP和cAMP-CRP均促進菌毛形成，二者之間是否有相互作用也可作為未來研究方向以促進深入了解菌毛的調(diào)控過程，為有效阻止生物膜形成打下基礎。

多糖在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機制細菌生長產(chǎn)生的多糖主要起保護、黏附和組成生物膜結(jié)構的作用。多糖不僅能包裹在細菌表面形成多孔支架結(jié)構阻止或限制有害分子的滲透，還可以與抗菌肽相互作用，阻止其殺傷細菌；聚集的多糖促進細菌間和細菌與介質(zhì)間黏附，有利于細菌定殖；而且多糖還可以與蛋白質(zhì)等大分子形成網(wǎng)絡為生物膜提供穩(wěn)定結(jié)構，使細菌群落分層并建立濃度梯度[27]。參與KPN生物膜形成與成熟的多糖主要為莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。

CPS在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機制：部分臨床分離的KPN會產(chǎn)生一種黏液樣的基質(zhì)包裹在細菌細胞壁外層被稱為莢膜。除含有大量的水分外，其組成大多為多糖類物質(zhì)，是K抗原的主要成分。CPS主要通過穩(wěn)定KPN在基質(zhì)上的黏附性于生物膜的初始形成過程中發(fā)揮作用，并且通過調(diào)整細菌的空間分布規(guī)則進一步調(diào)節(jié)細菌聚集，促進KPN形成具有典型三維結(jié)構的成熟生物膜[27- 28]。同時，CPS還可通過降低炎性因子抑制或損傷宿主細胞的吞噬作用，有效保護生物膜內(nèi)菌體免受或少受如溶菌酶、補體、抗菌肽等多種殺菌/抑菌物質(zhì)的損傷，使細菌高效的適應環(huán)境變化[29]。多糖分子組成和構型的多樣性，使莢膜結(jié)構極為復雜，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有79種類型的莢膜[30]，其中K1、K2、K20、K57莢膜血清型常與高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，HvKP)相關[31]。HvKP主要常見于亞洲地區(qū)，因能產(chǎn)生大量CPS，致病性較強，可在健康人群中形成如化膿性肝膿腫、眼內(nèi)炎等嚴重感染，是社區(qū)醫(yī)院的嚴重危害菌[2]。研究顯示HvKP與生物膜形成顯著相關，且K1型HvKP中參與CPS鏈接形成的聚合酶magA基因的高表達導致HvKP在氣液界面處形成生物膜[32]。同時,高毒力CRKP的產(chǎn)生無疑可能會成為下一個“超級細菌”，生物膜的形成將加重其危害程度，應引起臨床高度重視[33- 34]。

對KPN CPS進行分析顯示[30]，cps基因簇負責編碼KPN CPS，在cps基因簇的5’端有6個高度保守的基因組(galF、cpsACP、wzi、wza、wzb、wzc)，主要編碼CPS合成轉(zhuǎn)運和加工的蛋白質(zhì)；在3’端發(fā)現(xiàn)編碼葡萄糖- 6-磷酸脫氫酶和UDP-葡萄糖脫氫酶的保守基因，是合成CPS的基礎；而中間區(qū)域(可變區(qū)域)主要包含編碼 CPS 亞基聚合和組裝的基因，如編碼糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)位酶、聚合酶和修飾酶(乙酰基轉(zhuǎn)移酶、丙酮酰基轉(zhuǎn)移酶等)的基因，因其表達差異性，導致CPS結(jié)構多樣，豐富了K抗原類型[35]。研究顯示莢膜的K抗原血清型的特異性與wzi/wzy基因座的序列高度相關，對這些基因座進行測序可對KPN的K抗原血清型進行分型[30，36]，為臨床早期發(fā)現(xiàn)嚴重致病菌提供依據(jù)，及時進行早期治療。

KPN CPS的調(diào)控機制較為復雜，目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子主要有：CsrB碳源利用系統(tǒng)、RcsAB雙組份系統(tǒng)、rmpA/rmpA2蛋白、KvrB、KvrA、KvgA、KvhA、KvhR和Fur蛋白。其中較為主要的是CsrB碳源利用系統(tǒng)和RcsAB雙組份系統(tǒng)，這些系統(tǒng)本身都受多個基因的調(diào)控：CsrB是碳儲存調(diào)控小RNA，它整合了來自UvrY-Bara二組分系統(tǒng)和各種碳代謝基因的信號，被DksA激活后，促進cps基因轉(zhuǎn)錄，提高CPS的產(chǎn)生，可被CsrD靶向降解[37]；RcsAB是一種非典型的兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在galF基因啟動子區(qū)域存在RcsAB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特定DNA序列，正向調(diào)節(jié)CPS的產(chǎn)生，rcsAB基因敲除菌株的CPS產(chǎn)生水平和生物膜形成能力均降低。同時，RcsB對CPS合成的調(diào)控也取決于rmpA蛋白的輔助作用[38]。rmpA/rmpA2蛋白通過與cps基因啟動子區(qū)域的靶位結(jié)合正向調(diào)控cps基因的轉(zhuǎn)錄使KPN高表達CPS，且rmpA/rmpA2蛋白與HvKP菌株高度相關[39]。在KPN中發(fā)現(xiàn)KvrA和KvrB(與大腸桿菌的SlyA和MprA同源)屬于MarR調(diào)節(jié)蛋白家族，MarR調(diào)節(jié)蛋白家族主要影響細菌抗生素抗性和莢膜調(diào)節(jié)因子的表達。對大腸桿菌研究顯示，SlyA是H-NS的拮抗劑，H-NS可抑制KPN中RcsA表達，SlyA解除H-NS介導的轉(zhuǎn)錄沉默促進莢膜合成；MprA是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，影響莢膜的合成[40]。而KPN中KvrA基因和KvrB基因缺失的突變菌株表現(xiàn)出CPS產(chǎn)量的減少，但其是否通過驅(qū)動cps基因的啟動子調(diào)節(jié)莢膜表達還有待研究[41]。環(huán)境因素也影響莢膜的表達，研究顯示感應環(huán)境中的自由基壓力和缺鐵環(huán)境的KvgA/KvgS雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在壓力環(huán)境下，反應調(diào)節(jié)因子KvgA通過作用于orf基因激活cps基因的表達，且KvgA 是 KvhA和KvhR表達的自動調(diào)節(jié)子和激活子，即：這3個同源應答調(diào)節(jié)劑相互協(xié)調(diào)控制莢膜的表達[42]。當KPN生活在富含鐵的環(huán)境中時，莢膜多糖的表達被降低，這主要是因為Fur蛋白抑制了基因rmpA和RcsA的轉(zhuǎn)錄[43]。碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)可轉(zhuǎn)運和磷酸化環(huán)境中存在的各種糖以供細菌生長。在KPN中發(fā)現(xiàn)碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)CPS大量形成導致生物膜形成增加[44]。CPS的高表達不僅在KPN的免疫殺傷及生物膜形成和成熟過程中發(fā)揮作用，也是HvKP的重要毒力因子可引起嚴重感染。CPS的調(diào)控除受到環(huán)境中碳源的影響外，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用也是未來需要進一步研究的方向。

LPS在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機制：LPS是革蘭陰性菌細胞膜的主要成分，由脂質(zhì)A、核心多糖和O抗原組成。KPN生物膜形成過程中LPS參與KPN與非生物表面的初始黏附，研究表明O抗原除作為一個重要的毒力因子可保護細菌免受宿主損傷，利于細菌定植感染，且當KPN處在模仿體內(nèi)血液循環(huán)系統(tǒng)的環(huán)境時，CPS和O抗原是生物膜初始聚集體形成的基本物質(zhì)[45]。KPN中LPS和CPS并非完全獨立地產(chǎn)生，在LPS生物合成中起重要作用的酶也影響KPN CPS的數(shù)量和結(jié)構[46]。KPN LPS生物合成和輸出涉及4個不同的基因簇：lpx、waa、rfb、lpt，其中編碼脂多糖O抗原合成的核心基因簇為rfb基因組，主要由wzm、wzt、wbbM、glf、wbbN、wbbO等6個編碼基因組成[47]，其合成由3種類型的酶完成：核苷酸激活糖的生物合成、多糖重復單元的合成以及重復單元的組裝和跨膜運輸(脂肪酶)，主要依賴于三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白途徑調(diào)控[48- 49]。將LPS的合成機制作為靶點進行攻擊，不僅影響莢膜與生物膜的形成，也可延緩疾病的惡化發(fā)展[47，49]。

脂質(zhì)A作為模式識別受體TLR4的有效配體可被宿主免疫系統(tǒng)識別清除，但KPN通過修飾脂質(zhì)A的結(jié)構可逃避免疫系統(tǒng)的殺傷。KPN脂質(zhì)A的生物合成主要由lpx基因編碼產(chǎn)物參與、PhoPQ兩組分系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)。脂質(zhì)A在PhoPQ調(diào)節(jié)的加氧酶lpxO和lpxL基因編碼的脂質(zhì)A修飾酶的作用下，可介導KPN對吞噬作用的抵抗性、逃避宿主的先天免疫、保護KPN免受多黏菌素的侵害[50- 51]。有研究顯示MgrB是一種小的(47個氨基酸)膜結(jié)合肽，是PhoPQ兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的負反饋調(diào)節(jié)劑，mgrB基因突變使PhoPQ調(diào)控脂質(zhì)A重塑，賦予KPN對多黏菌素和哺乳動物抗菌肽的抗性[52]。另外，lpxL2酶為lpxL基因編碼產(chǎn)物的主要成分，lpxO介導的lpxL2轉(zhuǎn)移肉豆蔻酸酯的羥化作用，主要參與脂質(zhì)A酰化作用，由于lpxL2和lpxO基因的突變，使KPN易受抗菌肽的影響[51]。多黏菌素是治療CRKP感染的有效藥物之一，脂質(zhì)A修飾功能導致KPN對多黏菌素產(chǎn)生耐藥性，因此，對脂質(zhì)A修飾機制的研究可作為KPN藥物開發(fā)的候選靶標。

群體感應系統(tǒng)在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機制因生物膜形成的動態(tài)性和環(huán)境刺激的變異性，細菌必須具有快速、廣泛協(xié)調(diào)微生物群體中基因表達信號的能力，這一過程主要受群體感應(quorum sensing，QS)系統(tǒng)調(diào)控，QS系統(tǒng)是細菌群體密度信號的感受系統(tǒng)，細菌自身通過分泌自誘導信號分子相互溝通，響應種群密度的變化調(diào)節(jié)生物學功能，以適應環(huán)境變化，QS系統(tǒng)在生物膜形成全程發(fā)揮作用[53]。KPN的QS系統(tǒng)主要包括 Ⅰ 型和 Ⅱ 型，分別分泌AI- 1和 AI- 2自誘導信號分子。Ⅰ型QS系統(tǒng)是細菌種內(nèi)交流的高度特異性系統(tǒng)，其AI- 1信號分子由LuxI基因編碼的酶催化合成，LuxR蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控AI- 1信號分子組成，而Ⅱ型QS系統(tǒng)與Ⅰ型QS系統(tǒng)不同，Ⅱ型QS系統(tǒng)還具有種間交流的功能，即它不僅能使細菌響應自身產(chǎn)生的AI- 2，還可以響應其他物種產(chǎn)生的AI- 2[54- 55]。AI- 2信號分子在KPN生物膜形成中起主要作用，不僅促進KPN生物膜的形成與成熟，對生物膜結(jié)構穩(wěn)定性也造成一定的影響，其產(chǎn)生依賴于luxS基因。研究顯示KPN協(xié)調(diào)單個細菌間分泌的AI- 2濃度達到閾值時，可觸發(fā)信號傳導的級聯(lián)反應，誘導CPS、LPS、菌毛等多種基因(如wzm、wbbM、mrkA等)的表達，啟動生物膜的形成，誘導生物膜成熟；此外，另一研究表明KPN的luxS基因缺失突變株，與野生菌相比，突變株產(chǎn)生的生物膜結(jié)構疏松，大菌落的形成減少[55- 56]。同時，QS信號分子也可直接或間接地作用于第二信使如c-di-GMP 和cAMP，將復雜的環(huán)境信息信號轉(zhuǎn)換為一般細胞內(nèi)信號，促進生物膜形成。對群體淬滅劑和QS抑制劑的研究顯示，通過抑制QS系統(tǒng)的信號分子的表達，可顯著下調(diào)生物膜的形成與成熟[57- 58]。基于KPN對臨床抗菌藥物的高度耐藥以及生物膜的形成使耐藥情況加劇發(fā)展的現(xiàn)狀，QS在生物膜形成過程中的調(diào)控功能使群體淬滅劑和QS抑制劑被認為是開發(fā)新的抗感染藥物有前景的靶標。同時，細菌往往在非理想生存條件下與多個物種混合生長，QS介導的細菌行為在細菌適應環(huán)境變化中起中心作用。未來，應模擬細菌自然生態(tài)位，集中研究在細菌生物膜空間結(jié)構和/或非理想條件下細菌之間的通訊是如何運作的，以阻止有害細菌的群體感應，促進有益細菌的群體感應。

外排泵在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機制細菌細胞膜中介導主動和被動轉(zhuǎn)運的外排泵和孔蛋白可用于溝通菌體內(nèi)外的信息，利于細菌適應環(huán)境變化。有證據(jù)表明外排泵的產(chǎn)生與生物膜形成有關，可能的機制為：外排泵可外排形成多糖和QS系統(tǒng)所需分子；可間接調(diào)控參與生物膜形成的轉(zhuǎn)錄因子；通過影響細菌和其他表面的黏附促進聚集[59]。對外排泵抑制劑的研究顯示，外排泵抑制劑與抗菌藥協(xié)同作用顯著降低KPN生物膜形成[60]。研究顯示多重耐藥KPN外排泵編碼基因的上調(diào)表達使其生物膜形成能力較敏感株強[61]。同時僅在產(chǎn)生生物膜的泛耐藥KPN中發(fā)現(xiàn)AcrAB外排泵的上調(diào)表達，外排泵導致的KPN耐藥性與生物膜形成能力顯著正相關[9]。在CRKP菌株中發(fā)現(xiàn)，VIM- 1與IMP- 1耐藥基因與生物膜形成存在顯著相關性，但具體的機制還需進一步研究[62]。而KPN生物膜的形成會上調(diào)acrA、emrB、oqxA、qacEΔ1等外排泵基因的表達，進一步增加細菌的耐藥性，利于細菌在抗菌素條件下存活[63]。即，KPN外排泵的表達與生物膜的形成是相輔相成的，對于抑制細菌外排泵表達的因素也會影響生物膜的形成。但對外排泵確切在生物膜形成中的作用的研究較少，沒有直接的證據(jù)表明抑制特定的外排泵會如何影響生物膜的形成。因此，研究高效的外排泵抑制劑與質(zhì)譜法和代謝組學研究相結(jié)合，確定受抑制影響的同源外排泵底物，可能是發(fā)現(xiàn)外排泵確切作用的一個有效手段。

KPN易形成生物膜，且對臨床分離的CRKP菌株研究顯示其不僅形成生物膜能力較強，且形成生物膜后導致CRKP感染死亡率升高[8，64- 65]，但也有部分研究表明CRKP菌株形成生物膜的能力較弱，可能是因為CRKP菌株缺失了與生物膜形成相關重要基因的表達，如調(diào)控菌毛形成的MrkH基因；也發(fā)現(xiàn)CRKP菌株中高黏液型形成生物膜能力較不產(chǎn)黏液型形成生物膜的能力弱，可能是CPS的高表達覆蓋了菌毛，導致細菌無法黏附于生物表面，從而生物膜形成減弱[64，66]。在KPN生物膜的形成過程中，細菌菌毛的表達直接影響生物膜的初始黏附與形成，同時菌毛可維持CPS流動性使多糖發(fā)揮保護細菌免受宿主與環(huán)境作用的殺傷、促進細菌黏附聚集、穩(wěn)定生物膜初始形成的作用，從而形成穩(wěn)固的空間結(jié)構促進生物膜成熟。細菌形成初始黏附與聚集后，群落密集系統(tǒng)信號分子通過協(xié)調(diào)菌毛與多糖的表達，募集空間環(huán)境中細菌以形成成熟的生物膜。而外排泵與生物膜形成是相輔相成的，在生物膜初始形成中外排泵主要負責生物膜形成物質(zhì)的外排，生物膜成熟后則進一步促進外排泵的表達利于菌株生存。因此，菌毛的表達在生物膜形成中發(fā)揮較為重要的作用。

展 望

KPN在全球范圍的流行，尤其CRKP菌株的產(chǎn)生及其耐藥基因的廣泛傳播，對人類健康造成嚴重威脅。高毒力型KPN和多重耐藥型KPN與生物膜形成顯著的相關性更是醫(yī)院內(nèi)感染控制的首要目標。KPN生物膜的形成過程中菌毛和多糖發(fā)揮初始生物膜形成作用，群落感應系統(tǒng)則協(xié)調(diào)二者的表達以形成成熟生物膜，外排泵的高表達與生物膜形成相輔相成。目前對KPN生物膜形成及調(diào)控機制的研究發(fā)現(xiàn)通過抑制菌毛表達、破壞菌毛結(jié)構、攻擊多糖形成及修飾靶點可顯著抑制生物膜的形成，有效控制感染，如MrkH表達抑制劑、高親和力單價和多價FimH拮抗劑以及作為抗生素研發(fā)靶標的脂質(zhì)A合成酶(LpxA、LpxB、LpxC、LpxD)和CPS、LPS合成基因wzm、wzt被廣泛研究，同時還有CPS和LPS疫苗的研發(fā)正在進行。但是，KPN多糖成分的異質(zhì)性、糖苷鍵、立體異構形式以及參與生物合成和運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)的伴隨變異可能是設計對抗多種克雷伯菌屬的抗生素和疫苗的一大挑戰(zhàn)。通過抗生素基因測序技術結(jié)合宏基因組學方法對KPN臨床菌株進行研究將有助于設計多價疫苗以控制感染。同時發(fā)現(xiàn)群體感應系統(tǒng)可直接或者間接地調(diào)節(jié)c-di-GMP和cAMP-CRP影響菌毛和CPS生成，有大量研究表明c-di-GMP在生物膜形成中的作用，未來可著重研究cAMP-CRP如何影響生物膜形成及與c-di-GMP之間有無相互作用。對群體淬滅劑和QS抑制劑的研究顯示，它們可通過抑制LuxS基因的表達以減弱AI- 2分子的合成影響生物膜形成與成熟，未來也可將這些物質(zhì)作為抗生物膜形成和預防控制細菌感染的新藥進行研發(fā)，但這些物質(zhì)對生物膜形成具體的作用機制以及對人體的影響仍需進一步探索，而通過將質(zhì)譜法和代謝組學研究方法相結(jié)合，可能是一個有效的研發(fā)手段。