Emmanuel Wirekoh ARTHUR 王英姿 綜述 周 洲 審校

(南華大學(xué)病原微生物學(xué)研究所，衡陽 421001)

衣原體(Chlamydia)是一種在全球范圍內(nèi)引起人和動物致病的專性胞內(nèi)菌，其中肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae,Cpn)主要感染呼吸道引起肺炎、支氣管炎等炎癥病理反應(yīng)，與肺癌、動脈粥樣硬化密切相關(guān)[1-3]；鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci,Cps)通過鳥類的糞便傳播至人類呼吸系統(tǒng)，引起肺炎[4-5]；而沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,Ct)是世界范圍內(nèi)引起廣泛性傳播感染的主要病原菌，其感染人體可引起沙眼、盆腔炎、不育癥和異位妊娠等炎性疾病[6-7]。衣原體具有獨特的雙相發(fā)育周期，即在具有感染性的原體(elementary body,EB)和復(fù)制型的網(wǎng)狀體(reticulate body,RB)之間相互轉(zhuǎn)化[8-10]。衣原體感染開始于EB黏附至宿主細(xì)胞，接觸后,其Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)主要通過分泌效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)EB內(nèi)化形成包涵體[11]。衣原體侵入宿主細(xì)胞后，通過轉(zhuǎn)運機(jī)制退出內(nèi)吞途徑并遷移至核周。大多數(shù)衣原體蛋白被分泌至包涵體囊腔和宿主細(xì)胞胞質(zhì)，導(dǎo)致宿主蛋白被募集、衣原體獲取營養(yǎng)物質(zhì)、抗細(xì)胞凋亡通路的維持和調(diào)節(jié)固有免疫[12]。

磷酸化作為最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式，是指由蛋白質(zhì)激酶催化的將ATP磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)上的過程，或在信號作用下結(jié)合GTP，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，也是調(diào)控蛋白質(zhì)活力和功能最普遍的機(jī)制。蛋白質(zhì)磷酸化可通過動態(tài)調(diào)控酶活性、蛋白定位、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白寡聚化在細(xì)菌感染引起致病的過程中發(fā)揮重要作用，如黏附至宿主細(xì)胞或調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13-14]。近年來，原核生物的蛋白磷酸化因能夠通過蛋白激酶和磷酸酶逆化修飾蛋白功能從而調(diào)節(jié)重要的生物學(xué)過程引起廣泛關(guān)注[15]。蛋白質(zhì)磷酸化可調(diào)節(jié)衣原體生理學(xué)多樣性，對衣原體生長和發(fā)育具有重要影響。本文綜述了目前蛋白磷酸化對衣原體生理學(xué)的可能影響，旨在更深入地探討衣原體的致病機(jī)制。

1 蛋白質(zhì)磷酸化的組成

蛋白質(zhì)磷酸化包括蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶、雙組分信號系統(tǒng)(two-component signaling systems,TCSS)及合作-開關(guān)機(jī)制3個部分[16]。蛋白質(zhì)激酶是催化蛋白質(zhì)磷酸化過程的酶，這類酶可以改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性，根據(jù)其底物蛋白被磷酸化的氨基酸殘基種類主要分為絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白質(zhì)激酶、酪氨酸(Tyr)蛋白質(zhì)激酶、色氨酸(Trp)蛋白質(zhì)激酶和天冬氨酰基/谷氨?；?Asn/GIn)蛋白質(zhì)激酶五大類。磷酸酶與蛋白質(zhì)激酶作用相反，是一種能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶，能夠調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的磷酸化過程[17]。TCSS由整合膜傳感器組氨酸激酶(histidine kinase,HK)和胞質(zhì)應(yīng)答調(diào)節(jié)因子(response regulator,RR)兩部分組成，分別由兩個不同的基因編碼，組成1個操縱子[18]。合作開關(guān)機(jī)制(partner switching mechanisms,PSM)是指細(xì)胞在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起開關(guān)作用的蛋白,其能夠在單獨的模型中起作用[19-21]。

2 蛋白質(zhì)磷酸化各組分對衣原體生理學(xué)的影響

2.1蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶對衣原體致病過程的影響 磷酸化蛋白在EB和RB之間分配不同，在EB和RB中分別含有74%和19%。EB磷酸化蛋白質(zhì)主要包含參與中心和次級代謝的蛋白以及假定蛋白和毒力蛋白。雖然EB無代謝活性，但蛋白質(zhì)組研究表明EB含有的參與中心和次級代謝的酶在進(jìn)入宿主細(xì)胞后會發(fā)生代謝[22]。大多數(shù)EB磷酸化的代謝蛋白在RB中未被磷酸化，表明磷酸化作用可快速調(diào)節(jié)代謝酶活性。相反，RB磷酸化蛋白質(zhì)組主要與蛋白質(zhì)合成和折疊功能相關(guān)。

衣原體可通過T3SS和Ⅱ型分泌系統(tǒng)將蛋白注入包涵體囊腔和宿主細(xì)胞質(zhì)[23]。目前已知4種衣原體蛋白可通過宿主激酶引起磷酸化：易位肌動蛋白募集磷酸化蛋白(TarP)、易位早期磷蛋白(TepP)、包涵體膜蛋白A(IncA)和包涵體膜蛋白G(IncG)。TarP 作為一種高分子量Tyr磷酸化蛋白存在于所有衣原體，并在衣原體入侵宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。衣原體黏附于宿主細(xì)胞后，EB內(nèi)的TarP通過T3SS分泌到宿主細(xì)胞質(zhì)。CLIFTON等[24]證明Tarp在侵入位點被Tyr磷酸化并與肌動蛋白的募集相關(guān)，猜測其可能參與調(diào)節(jié)肌動蛋白募集反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而這種募集反應(yīng)將促進(jìn)EB進(jìn)入宿主細(xì)胞致病。TepP 是繼TarP后新發(fā)現(xiàn)的一種T3SS效應(yīng)蛋白，在Ct中被稱為CT875，CHEN等[25]發(fā)現(xiàn)并證明其在衣原體進(jìn)入宿主細(xì)胞早期易位，并被Tyr磷酸化。TepP作用于TarP的下游以募集骨架蛋白，有利于在衣原體進(jìn)入宿主細(xì)胞期間啟動和擴(kuò)增信號級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致感染。衣原體Inc是衣原體基因編碼、表達(dá)定位于包涵體膜上的蛋白質(zhì)，其可介導(dǎo)衣原體與宿主細(xì)胞相互作用從而影響宿主細(xì)胞的生物學(xué)功能。ROCKY等[26]發(fā)現(xiàn)Cps的IncA是一種由宿主細(xì)胞酶磷酸化的Ser/Thr磷蛋白，在釋放至包涵體后被宿主激酶磷酸化，但I(xiàn)ncA在衣原體感染過程中發(fā)揮何種作用有待進(jìn)一步研究。SCIDMORE[27]等證明IncG的表達(dá)在內(nèi)化后2 h內(nèi)可以被檢測到，14-3-3β蛋白是第一個與Ct的IncG相互作用的磷酸Ser結(jié)合蛋白，但I(xiàn)ncG在Ct發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。

近年來，Ser/Thr/Tyr的蛋白質(zhì)磷酸化由于可調(diào)節(jié)細(xì)菌生理學(xué)的多樣性而獲得了廣泛認(rèn)識[14,28]。其中，Ser/Thr磷酸化通常由Hank′s型激酶介導(dǎo)，其與同源蛋白磷酸酶起作用并可能引起全面蛋白磷酸化，Tyr磷酸化通常由細(xì)菌酪氨酸激酶(bacterial tyrosine kinases,BY)介導(dǎo)。這些酶以ATP為磷酸供體，P-Ser/Thr/Tyr殘基形成更穩(wěn)定的酯鍵，需要特定的蛋白磷酸酶與其同源激酶一起發(fā)揮作用[29]。蛋白磷酸酶分為兩個超家族：蛋白Ser/Thr磷酸酶(protein Ser/Thr phosphatases,PSPs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)，PSPs可進(jìn)一步細(xì)分為磷蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases，PPP)和金屬依賴性蛋白磷酸酶(metal-dependent protein phosphatases)[30]。WHITMORE等[31]證明BY激酶和PTP可利用宿主細(xì)胞蛋白作為底物導(dǎo)致細(xì)菌致病。Ct的CTL0511作為一種金屬依賴性蛋白磷酸酶，具有廣泛的底物特異性，證實了沙眼衣原體中存在可逆磷酸化網(wǎng)[32]。CLAYWELL等[32]和GLAYWELL等[33]在Ct的EB和RB中均檢測到磷酸酶活性，這對衣原體代謝和致病至關(guān)重要，并且能夠使色氨酸磷酸化(P-Ser)、蘇氨酸磷酸化(P-Thr)和酪氨酸磷酸化(P-Tyr)去磷酸化。此外，CppA是金屬依賴性蛋白磷酸酶的蛋白磷酸酶2C型(type 2C Ser/Thr protein phosph-atase,PP2C)亞家族成員，這項研究突出了CppA作為未來治療策略的新靶點并支持為衣原體和其他致病細(xì)菌設(shè)計更有效的PP2C磷酸酶抑制劑的可行性。CppA的底物易與Cpn的PknD磷酸化Tyr殘基結(jié)合,此結(jié)合特性支持衣原體中P-Tyr的存在[34]。因此，P-Tyr是否存在于其他衣原體中或是否僅限于Cpn仍有待進(jìn)一步研究。

所有衣原體均編碼2種Hank′s型激酶，即分別存在于衣原體質(zhì)膜的Pkn1、內(nèi)膜的PknD及T3SS分泌的假定激酶Pkn5。JOHNSON等[35]證明Cpn的PknD在Thr/Tyr殘基上自磷酸化并磷酸化T3SS結(jié)構(gòu)蛋白CdsD上的Ser/Tyr殘基，這是對Ser/Thr/Tyr殘基具有氨基酸特異性的細(xì)菌蛋白激酶的首次證明，同時也是第1個預(yù)測Ⅲ型分泌結(jié)構(gòu)蛋白磷酸化的研究。PknD/Pkn1/CppA缺乏無義突變表明這些酶可能是衣原體生長所必需的[36]。抑制PknD顯著影響Cpn生長，進(jìn)一步表明蛋白質(zhì)磷酸化是衣原體生長發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且這些酶可能作為衣原體引起疾病的治療靶標(biāo)發(fā)揮作用[37]。Ct的Pkn1和PknD在Ser/Thr殘基上自磷酸化并相互作用，表明Pkn1和PknD可交叉調(diào)節(jié)[38]。此外，包涵體膜蛋白IncG為Ct的Pkn1底物，CdsD作為Cpn的PknD底物，猜測Pkn1和PknD在宿主和衣原體相互作用中作為潛在介質(zhì)從而影響衣原體發(fā)育和致病過程[35,38]。雖然Pkn1可在體外磷酸化IncG，但I(xiàn)ncG可能在體內(nèi)被宿主激酶磷酸化，類似于IncA。Pkn5因缺乏保守的催化殘基被認(rèn)為是假定激酶，其在含T3SS基因的操縱子中被編碼，并在沙門氏菌替代T3SS測定中作為T3SS底物[39]。Cps在Pkn5的保守Ser殘基上有自由基突變，是宿主蛋白可能的磷酸化結(jié)合位點，從而在鼠肺炎模型中毒性減弱[40]。Cpn的Pkn5定位于包涵體膜，將進(jìn)一步支持其作為效應(yīng)蛋白的作用。

2.2TCSS對衣原體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) TCSS可通過適應(yīng)性應(yīng)答對不斷變化的環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些信號系統(tǒng)主要存在于衣原體和其他專性胞內(nèi)寄生菌中。pH、溫度、滲透壓等條件的改變可導(dǎo)致HK在保守的組氨酸殘基上自磷酸化，隨后磷酸轉(zhuǎn)染至天冬氨酸殘基上同源RR的接收結(jié)構(gòu)域。RR通過其輸出結(jié)構(gòu)域寡聚化并與DNA結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[41]。衣原體含有1個完整的TCSS和1個獨立的RR，其可能調(diào)節(jié)衣原體對環(huán)境的適應(yīng)性應(yīng)答，從而影響發(fā)育過程[42]。TCSS與σ因子通過磷酸化共同參與衣原體發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，并將參與的基因分別命名為CtcB與CtcC。CtcB與CtcC在衣原體發(fā)育晚期表達(dá)，可能與EB和RB的重組相關(guān)，并進(jìn)一步影響衣原體黏附和入侵。而在衣原體EB中，磷酸化位點的CtcB是否影響轉(zhuǎn)錄功能尚不清楚[43]。CtcB與CtcC如何調(diào)節(jié)衣原體生理學(xué)過程有待進(jìn)一步研究。

2.3合作開關(guān)機(jī)制對衣原體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 細(xì)菌除通過雙組分信號系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)外，還可通過合作-開關(guān)機(jī)制(PSM)調(diào)節(jié)。衣原體可編碼σB型PSM的調(diào)控因子(RsB)，其PSM包括1個已確定的傳感器磷酸酶RsbU、1個假定的傳感器磷酸酶CT_589、2個雙抗σ因子、RsbV1和RsbV2及抗σ因子RsbW[20]。σ66作為衣原體調(diào)控管家基因轉(zhuǎn)錄的主要σ因子，主要受PSM調(diào)控。當(dāng)RsbV1在Ct中過表達(dá)，σ66調(diào)控的基因的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)為上調(diào)且細(xì)胞生長數(shù)增加，而當(dāng)RsbW過表達(dá)或當(dāng)RsbV1失活時則恰好相反。RsbW和RsbU能夠控制RsbV1的磷酸化狀態(tài)，但RsbW磷酸化的RsbV2不能被RsbU去磷酸化[44]。因此，RsbV2的作用以及是否存在RsbW和RsbV2的其他靶標(biāo)仍有待探究。

3 結(jié)語

與多數(shù)其他細(xì)菌相反，蛋白質(zhì)激酶、磷酸酶和底物似乎不在衣原體的操縱子內(nèi)編碼，導(dǎo)致磷蛋白網(wǎng)絡(luò)的定位變得復(fù)雜。盡管衣原體蛋白激酶、磷酸酶、TCSS和PSM的存在已經(jīng)得到證實，但其在體內(nèi)發(fā)揮的作用仍不明確。近年來，可用于衣原體的遺傳學(xué)方法迅速增加，用于研究磷酸化蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的方法可使研究者對衣原體生理學(xué)和發(fā)病機(jī)理有更深層次的理解。此外，由于蛋白質(zhì)磷酸化對細(xì)菌生存和致病有重要影響，蛋白磷酸化如何促進(jìn)細(xì)菌和宿主間的動態(tài)相互作用將成為未來研究的重點。