李非凡 張尤歷 閔靜宇 徐 岷

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,鎮(zhèn)江 212000)

外泌體是一種由磷脂雙分子層包裹的微囊泡，含有核酸分子、蛋白質(zhì)、抗原成分等多種生物活性物質(zhì)。腫瘤源性外泌體將信息從腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至鄰近細(xì)胞甚至是遠(yuǎn)處組織或器官,在腫瘤的侵襲、遷移、血管生成及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。外泌體可作用于大部分免疫細(xì)胞，對免疫細(xì)胞起雙向調(diào)節(jié)作用，但在腫瘤微環(huán)境中主要發(fā)揮免疫抑制作用。研究證明，外泌體參與惡性黑色素瘤、腎癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤抑制性免疫微環(huán)境形成，但關(guān)于消化道腫瘤的研究較少。消化道腫瘤作為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，受到越來越多的關(guān)注。本文主要綜述外泌體在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤微環(huán)境中對免疫功能的影響及可能機(jī)制，以期為新型免疫治療藥物研發(fā)提供參考。

1 外泌體的生物學(xué)特征及其與靶細(xì)胞的相互作用

外泌體最早被發(fā)現(xiàn)于成熟哺乳動物的網(wǎng)織紅細(xì)胞，1981年,TRAMS等[1]首次將此納米級囊泡命名為外泌體。其是一種直徑為40～100 nm的由磷脂雙分子層包裹的圓形或橢圓形微囊泡，CD9、CD63、CD81分子常被作為其表面標(biāo)志物[2-3]。外泌體中含有核酸分子、蛋白質(zhì)、抗原成分等多種物質(zhì)，是細(xì)胞間通訊的重要方式[4]。其磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)可保證其中的生物活性物質(zhì)更有效地發(fā)揮作用。多種哺乳動物細(xì)胞可分泌外泌體,包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)、腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞等。因此，外泌體存在于多種體液中，包括血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、羊水、附睪液等[5]。外泌體可通過以下1種或多種機(jī)制與靶細(xì)胞相互作用:①通過表面分子直接激活細(xì)胞內(nèi)信號通路；②通過與靶細(xì)胞膜融合轉(zhuǎn)移細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或基因；③吞噬及內(nèi)化作用；④受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[6]。吞噬作用或內(nèi)吞作用所攜帶的外泌體可被導(dǎo)向溶酶體降解和清除，也可直接進(jìn)入細(xì)胞啟動再編程過程。

2 外泌體的免疫調(diào)節(jié)作用

根據(jù)外泌體中內(nèi)含物及靶細(xì)胞上受體的不同，外泌體可發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用，同時具有免疫刺激作用和免疫抑制作用。

2.1外泌體的免疫刺激作用 外泌體的免疫刺激作用可表現(xiàn)在以下方面。腫瘤源性外泌體上存在MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子、腫瘤相關(guān)抗原、共刺激分子等，可激發(fā)免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)[7]。此外，外泌體還可通過增加單核細(xì)胞數(shù)量、招募自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)細(xì)胞、引起巨噬細(xì)胞的吞噬作用等機(jī)制促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答[8]。最新研究報道，外泌體作為乙肝疫苗佐劑可增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)[9]。

2.2外泌體的免疫抑制作用 雖然外泌體具有免疫刺激作用，但在腫瘤微環(huán)境中，外泌體通常發(fā)揮免疫抑制作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤源性外泌體富含免疫抑制性蛋白，包括死亡受體配體，如Fas配體(Fas ligand,FasL)或腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)，檢查點(diǎn)受體配體，如程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)，抑制性細(xì)胞因子，如IL-10和β轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、前列腺素E2 (prostaglandin E2,PGE2)及腺苷酸通路的胞外酶(CD39CD73)[10-11]。外泌體上的免疫抑制性蛋白與靶細(xì)胞結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用可:①抑制T細(xì)胞增殖和CD8+效應(yīng)T細(xì)胞溶解;②抑制NK細(xì)胞抗腫瘤功能;③髓源性抑制細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分化向抑制表型傾斜，包括骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)。

3 外泌體與消化道惡性腫瘤

研究表明，外泌體可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子活性，形成抑制性免疫微環(huán)境，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。隨著消化道腫瘤全球發(fā)病率升高，人們開始關(guān)注外泌體在消化道惡性腫瘤中的免疫調(diào)控作用。

3.1外泌體與結(jié)直腸癌 腫瘤免疫與結(jié)直腸癌進(jìn)展的關(guān)系一直都是結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題，近年研究認(rèn)為外泌體可通過調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的生物學(xué)活性促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展。HWANG等[12]用熒光素酶標(biāo)記結(jié)直腸癌干細(xì)胞源性外泌體，進(jìn)一步闡明了結(jié)直腸癌干細(xì)胞源性的外泌體調(diào)節(jié)髓源性中性粒細(xì)胞免疫活性的機(jī)制，即結(jié)直腸癌干細(xì)胞源性的外泌體通過三磷酸核糖核酸誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表達(dá)IL-1β，延長中性粒細(xì)胞存活時間，從而賦予中性粒細(xì)胞生長優(yōu)勢及誘導(dǎo)腫瘤前表型。在患有腫瘤的小鼠中，腫瘤相關(guān)性中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils,TANs)類似于粒樣MDSCs(G-MDSCs)，均為多形核Ly6G+/Lv6Clow免疫抑制性細(xì)胞，而腫瘤中浸潤的中性粒細(xì)胞數(shù)增加與實體腫瘤患者的惡性表型相關(guān)[13]。結(jié)直腸癌細(xì)胞源性外泌體還可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞極化過程。研究表明，單核細(xì)胞與外泌體的早期接觸(從體外培養(yǎng)的第1天開始)引起IL-10、TNF分泌增加[14]。早期接觸或延長接觸時間可減少活性氧中間產(chǎn)物分泌，減弱對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。YAMADA等[15]研究表明，外泌體與T細(xì)胞存在相互作用，外泌體孵化Jurkat細(xì)胞數(shù)減少，并發(fā)現(xiàn)Treg相關(guān)基因FoxP3、CTLA-4、LAG3、IL-10、PRF1、GZMB表達(dá)上調(diào)，并證實結(jié)直腸癌細(xì)胞源性外泌體通過干擾MAPK、AKT、TGF-β/Smad等信號通路抑制T細(xì)胞增殖，引起T細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變,從而具備Treg特征，顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展。POGGIO等[16]首次報道了外泌體上的PD-L1與T細(xì)胞上的PD-1受體結(jié)合可抑制引流淋巴結(jié)中T細(xì)胞腫瘤殺傷效應(yīng)，并揭示了外泌體PD-L1對結(jié)直腸癌進(jìn)展的作用，課題組先是在MC38細(xì)胞中敲除Pd-11和Rab27a基因，結(jié)果顯示無PD-L1分泌，證實PD-L1在外泌體中被包裝。敲除Rab27a或PD-1基因的MC38細(xì)胞增殖能力無變化，將以上細(xì)胞和未經(jīng)處理的細(xì)胞分別注入小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，注入未經(jīng)處理細(xì)胞的小鼠體內(nèi)腫瘤迅速生長，而敲除Rab27a或PD-11可減緩腫瘤生長、延長小鼠生存期。

3.2外泌體與胃癌 胃癌細(xì)胞外泌體同樣可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞生物學(xué)活性形成局部免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)胃癌進(jìn)展。WU等[17]認(rèn)為，胃癌源性外泌體通過激活NF-κB信號通路上調(diào)巨噬細(xì)胞源性IL-6、TNF-α表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長、遷移、侵襲。另有研究報道，中性粒細(xì)胞也具有潛在的免疫抑制活性，表現(xiàn)為通過抑制固有免疫和適應(yīng)性免疫數(shù)促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，如其直接分泌促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的蛋白酶和炎癥因子，如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastas，NE)、PGE2和IL-1β，或通過抑制T細(xì)胞免疫間接促進(jìn)腫瘤生長，如誘導(dǎo)一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和精氨酸酶1 (arginase 1,ARG1)抑制T細(xì)胞功能、釋放趨化因子17 (CCL17)招募Treg[18-19]。WANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的GM-CSF活化janus通路或轉(zhuǎn)錄因子3通路誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表達(dá)PD-L1，隨后與T細(xì)胞上的PD-1受體結(jié)合，降低T細(xì)胞的殺傷能力，最終導(dǎo)致腫瘤體積增大。采用PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1通路，結(jié)果出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，提示中性粒細(xì)胞通過PD-1/PD-L1通路抑制T細(xì)胞免疫功能促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長。ZHANG等[21]證明外泌體使中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镹2表型，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移，課題組取胃癌源性外泌體與人血中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，熒光激活細(xì)胞分選結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞凋亡受抑制，CD11b、MMP9、VEGF表達(dá)上升。Transwell實驗結(jié)果提示胃癌細(xì)胞遷移、增殖能力增強(qiáng)，具體機(jī)制是外泌體運(yùn)輸高遷移率蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)與Toll樣受體(toll like receptor,TLR4)相互作用活化下游NF-KB通路，引起中性粒細(xì)胞自噬，最終促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

3.3外泌體與肝癌 肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，免疫抑制是重要機(jī)制，研究表明，外泌體參與免疫抑制過程。LIU等[22]探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下肝細(xì)胞源性外泌體與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、ATF6、PERK、IRE1α)在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與肝癌患者的生存率和臨床分期呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)而招募CD68+巨噬細(xì)胞，上調(diào)巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)，進(jìn)而減少CD8+T細(xì)胞數(shù)、降低IL-2表達(dá)，并通過miR-23a/PTEN/AKT信號通路抑制T細(xì)胞殺傷作用。另外，HepG2細(xì)胞分泌的外泌體中含有可溶性免疫調(diào)節(jié)分子，顯著抑制淋巴細(xì)胞增殖[23]。

肝炎病毒的持續(xù)感染是肝癌發(fā)生的另一個重要機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，肝炎病毒可被組裝進(jìn)外泌體，由外泌體介導(dǎo)肝炎病毒免疫逃逸。FENG等[24]發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)甲型肝炎病毒逃避抗體的中和作用。被丙肝病毒感染的Huh7.5.1肝癌細(xì)胞通過外泌體運(yùn)輸丙肝病毒，進(jìn)而感染完好的Huh7.5.1細(xì)胞，以此逃避免疫系統(tǒng)的清除作用[25]。DENG等[26]以丙肝病毒為模型，揭示了外泌體在介導(dǎo)丙肝病毒逃避抗體中和過程中的作用，發(fā)現(xiàn)病毒膜蛋白可通過外泌體途徑釋放至細(xì)胞外，受syntenin蛋白調(diào)控。沉默syntenin對丙肝病毒的復(fù)制和產(chǎn)量幾乎沒有影響，但生理量syntenin的異位表達(dá)降低了細(xì)胞內(nèi)E2的數(shù)量，同時增加了E2包裹的外泌體分泌量。肝癌細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞內(nèi)一旦表達(dá)syntenin蛋白，所釋放的丙肝病毒傳染性增強(qiáng)，對E2特異性抗體中和作用的敏感性降低。血清中E2/syntenin水平越高，血清抗體中和能力越低[27]。 CHEN等[28]認(rèn)為，外泌體介導(dǎo)了自噬引起的持續(xù)性丙肝病毒感染，而Rab27a表達(dá)降低也會降低被感染細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。

3.4外泌體與胰腺癌 胰腺癌發(fā)展過程中，外泌體通過免疫抑制和營造有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境促進(jìn)胰腺癌發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞較多出現(xiàn)在腫瘤侵襲邊界，且其數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[29]。巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變與外泌體相關(guān)。巨噬細(xì)胞有2種表型，分別是M1型和M2型，M1型促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而M2型則抑制炎癥反應(yīng)。WANG等[30]認(rèn)為，缺氧狀態(tài)下胰腺癌細(xì)胞及其所分泌的外泌體高表達(dá)miR-301a-3p，外周血中miR-301a-3p表達(dá)與侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-301a-3p通過激活PTEN/PI3Kγ通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2表型,促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)和體外實驗都得到了驗證。SU等[31]發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-155或miR-125b-2可重新編碼胰腺癌腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞表型，使其由M2型轉(zhuǎn)化為M1型。而大多數(shù)包括胰腺癌在內(nèi)的實體腫瘤患者中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要為M2表型，將其重新編程至M1表型將有助于胰腺癌治療[32]。

此外，DCs在胰腺癌腫瘤微環(huán)境中的數(shù)量較少，且位于腫瘤邊界[33]。而循環(huán)MDSCs水平在胰腺癌中升高[34]。CD11b+DCs通過促進(jìn)MDSCs增殖、抑制CD8+T細(xì)胞增殖促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[35]。BASSO等[36]取胰腺癌細(xì)胞源性外泌體與人外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CD4+、CD25+T細(xì)胞數(shù)增加，CD8+T細(xì)胞數(shù)減少。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，外泌體通過轉(zhuǎn)移與SMAD4相關(guān)的差異表達(dá)的miRNA和蛋白增加mMDSCs和gMDSCs細(xì)胞數(shù)，減少DCs數(shù)及TNF釋放。胰腺癌中DCs失去抗原呈遞能力和活化T細(xì)胞的能力，導(dǎo)致適應(yīng)性免疫應(yīng)答受抑制[37]。因此，胰腺癌細(xì)胞外泌體通過調(diào)節(jié)DCs分化與功能在抑制性免疫微環(huán)境形成中起重要作用[38]。

4 展望

外泌體在腫瘤免疫微環(huán)境形成過程中發(fā)揮重要作用。一方面，其參與腫瘤免疫逃逸，另一方面，其被抗原提呈細(xì)胞識別，成為腫瘤抗原的天然來源，因此，可用于制備腫瘤疫苗。但還需解決以下問題：①外泌體分泌的機(jī)制尚未闡明。外泌體在手術(shù)、放療、化療時的分泌增加，控制外泌體釋放可能改善治療效果；②外泌體產(chǎn)生何種效應(yīng)取決于其內(nèi)容物，因此，分析其內(nèi)容物對于其臨床應(yīng)用具有重要意義；③如何調(diào)節(jié)外泌體促癌作用和抗癌作用平衡是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)[39]。因此,以外泌體為基礎(chǔ)的治療策略尚需進(jìn)一步研究。