于 航 朝魯門其其格

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)室,呼和浩特 010020)

膿毒癥是由感染導(dǎo)致的一種全身失控性炎癥和多器官功能障礙綜合征，重癥患者常因缺血缺氧和組織灌注不足引發(fā)膿毒性休克[1]。膿毒癥起病急且患者預(yù)后不良，嚴(yán)重可危及生命，若并發(fā)急性肺損傷死亡率可高達(dá)60%以上。及早對膿毒癥患者病情程度及預(yù)后進(jìn)行有效評估并進(jìn)行針對性治療可有效改善患者預(yù)后，提高患者生存率[2]。膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程涉及炎癥反應(yīng)、感染、免疫及組織損傷等生理病理改變，主要機(jī)制是機(jī)體感染及免疫抑制導(dǎo)致機(jī)體免疫功能障礙[3]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)屬于抗原呈遞細(xì)胞，具有激活免疫細(xì)胞和活化初始T細(xì)胞的作用，可啟動免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受，但膿毒癥患者是否存在 DCs異常分化以及是否影響T細(xì)胞功能需進(jìn)一步研究[4]。調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞(regulatory B lymphocytes，Breg)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)作為與免疫應(yīng)答顯著相關(guān)的淋巴細(xì)胞可調(diào)控機(jī)體免疫活性[5-6]。兩者在免疫相關(guān)性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)均異常表達(dá)，推測其可能與膿毒癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究檢測并比較不同病情嚴(yán)重程度的膿毒癥患者Treg、Breg、DCs PD-L1表達(dá)水平，并探討其與患者預(yù)后生存率的關(guān)系，旨在為膿毒癥診斷、治療及預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取60例膿毒血癥入院患者及同期108例健康體檢者作為研究對象，依據(jù)急性生理和慢性健康狀況評分系統(tǒng)(A-PACHEⅡ)按照膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度分為中輕度膿毒癥組38例(A-PACHEⅡ評分≤20分)和嚴(yán)重膿毒癥組(A-PACHEⅡ評分>20分)22例[7]。男性35例，女性25例，年齡7～15歲，平均年齡(11.28±1.41)歲。原發(fā)疾病主要包括：肺部感染25例、急性胰腺炎9例、急性腹膜炎8例、多發(fā)損傷11例、心肺復(fù)蘇綜合征7例；所有患者治療7 d后根據(jù)患者生存情況分為存活組46例和死亡組14例。健康對照組男性62例，女性46例，年齡8～14歲，平均年齡(11.19±1.25)歲。兩組研究對象性別、年齡、BMI指數(shù)等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合美國胸科醫(yī)師協(xié)會/危重病醫(yī)學(xué)會(ACCP/SCCM)關(guān)于膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②所有研究對象入組前均未接受免疫抑制劑、抗感染藥物、糖皮質(zhì)激素等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有病毒性肝炎、HIV病毒感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤或免疫缺陷者；②近期使用過免疫抑制劑、抗感染藥物、糖皮質(zhì)激素等治療者；③臨床資料不完整或隨訪失訪者。

1.1.2儀器與試劑 流式細(xì)胞儀(型號：Attune NxT，賽默飛世爾)；Lin-1-FITC、CD33-PE、PD-L1-APC 抗體、抗人CD38(APC標(biāo)記)、抗人CD20(FITC標(biāo)記)、抗人CD24(PE標(biāo)記)(Abcam中國)。

1.2方法

1.2.1Treg、Breg、DCs PD-L1表達(dá)水平檢測 分別取健康志愿者及膿毒癥患者靜脈血5 ml于肝素抗凝管，流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg及DCs比例，以及血清Treg、Breg、DCs PD-L1表達(dá)。DCs表型測定時依次加入Lin-1-FITC、CD33-PE、PD-L1-APC 抗體3 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，離心，洗滌，采用設(shè)門法標(biāo)記Lin-CD33+PD-L1+DCs，以平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI) 為單位計(jì)算DCs Lin-CD33+PD-L1+表達(dá)水平。CD20+CD24hiCD38hiBreg水平測定時分別加入抗人CD38(APC標(biāo)記)、抗人CD20(FITC標(biāo)記)、抗人CD24(PE標(biāo)記)，室溫避光孵育20 min，離心、洗滌并采用2%多聚甲醛溶液固定，流式細(xì)胞術(shù)檢測Breg占比。以相同方法檢測外周血CD4+CD25+CD127lowTreg水平。

2 結(jié)果

2.1不同危重程度患者Treg、Breg及DCs PD-L1表達(dá) 中輕度膿毒癥患者及嚴(yán)重膿毒癥患者Treg、DCs PD-L1表達(dá)水平均顯著高于健康對照組(P<0.001)，Breg水平顯著低于健康對照組(P<0.001)，且嚴(yán)重膿毒癥患者上述細(xì)胞水平與中輕度膿毒癥患者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2不同危重程度患者A-PACHEⅡ評分與死亡率比較 中輕度和嚴(yán)重膿毒癥組患者的A-PACHEⅡ評分見表2，嚴(yán)重膿毒癥組患者7 d死亡率顯著高于中輕度膿毒癥組(P<0.05)。

2.3不同預(yù)后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表達(dá)與A-PACHEⅡ評分比較及相關(guān)性分析 不同預(yù)后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表達(dá)及A-PACHEⅡ評分差異顯著(P<0.05)，死亡組患者Treg、DCs PD-L1表達(dá)及A-PACHEⅡ評分均顯著高于存活組，Breg水平顯著低于存活組(P<0.001)；Treg、DCs PD-L1表達(dá)與A-PACHEⅡ評分呈顯著正相關(guān)(r=0.885、0.854，P<0.05)，Breg水平與A-PACHEⅡ評分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.892，P<0.05)，見表3。

2.4Treg、Breg、DCs水平、A-PACHEⅡ評分對膿毒癥患者預(yù)后診斷的價值 Treg、Breg、DCs PD-L1表達(dá)及A-PACHⅡ評分檢測診斷膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線見圖1，診斷效能均較高。Treg水平預(yù)測預(yù)后的ROC AUC為0.896(95%CI：0.748～0.952)，最佳截?cái)嘀禐?.15%，靈敏度、特異度分別為 80.00%、67.50%；Breg水平預(yù)測預(yù)后的ROC AUC為0.954(95%CI：0.823～0.987)，最佳截?cái)嘀禐?.36%，靈敏度、特異度分別為 87.50%、80.00%；DCs PD-L1表達(dá)水平預(yù)測預(yù)后的ROC AUC為0.923(95%CI：0.785～0.968)，最佳截?cái)嘀禐?23.56 MFI，靈敏度、特異度分別為 85.00%、70.00%；A-PACHEⅡ評分預(yù)測預(yù)后的ROC AUC為0.856(95%CI：0.652～0.923)，最佳截?cái)嘀禐?9.87分，靈敏度、特異度分別為75.00%、71.67%。

表1 各組Treg、Breg、DCs PD-L1表達(dá)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)Fig.1 Flow cytometry detection of CD4+CD25+CD127lowTreg expression

表2 不同危重程度患者A-PACHEⅡ評分與死亡率例(%)]

表3 不同預(yù)后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表達(dá)和A-PACHEⅡ評分比較及其相關(guān)性分析

圖2 ROC曲線分析Fig.2 ROC curve analysis

3 討論

膿毒癥是一種可導(dǎo)致患者死亡的危急重癥，死亡原因主要是感染導(dǎo)致多器官衰竭，其中炎癥反應(yīng)及免疫抑制是膿毒癥過程的2種重要病理狀態(tài)[9]。DCs作為一種與免疫抑制相關(guān)的重要免疫細(xì)胞，其異常表達(dá)與膿毒癥患者預(yù)后不良甚至死亡密切相關(guān)，從而導(dǎo)致DCs抗原提呈及T淋巴細(xì)胞增殖活化被抑制，最終引發(fā)免疫抑制。DCregs作為DCs 的亞群，可誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生[10]。ELKE等[11]研究DCregs可通過產(chǎn)生TGF-β、IL-10等負(fù)性調(diào)控因子對T 細(xì)胞活化過程產(chǎn)生明顯抑制作用，誘導(dǎo)Treg失活。Lin-CD33+PD-L1+是DCs的重要表型，與膿毒癥免疫抑制密切相關(guān)。本研究顯示，膿毒癥患者Lin-CD33+PD-L1+表達(dá)比健康志愿者明顯升高，說明PD-1水平上升可導(dǎo)致DCs數(shù)減少，進(jìn)一步導(dǎo)致患者免疫功能抑制。而PD-1/PD-L1作為與免疫抑制相關(guān)受體及配體，Treg免疫功能的發(fā)揮與PD-1/ PD-L1信號通路有重要聯(lián)系。機(jī)體免疫細(xì)胞接受免疫刺激后，為阻止T細(xì)胞過度激活，CD4+/CD8+細(xì)胞表面大量表達(dá)PD-1[12]。HOOGENDIJK等[13]研究證實(shí)初始 CD4+T細(xì)胞在PD-L1的誘導(dǎo)刺激下轉(zhuǎn)為Treg，當(dāng)PD-L1表達(dá)上升后進(jìn)一步誘導(dǎo)Treg免疫抑制。同時PD-1/PD-L1信號通路具有抑制T細(xì)胞的作用，進(jìn)一步產(chǎn)生反向調(diào)節(jié)及免疫抑制。因此在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中，PD-1/PD-L1通路的反向免疫調(diào)節(jié)功能在誘導(dǎo)Treg分化中發(fā)揮重要作用，從而參與膿毒癥免疫抑制過程，膿毒癥患者體內(nèi)CD4+/CD8+T 細(xì)胞亞群占比明顯低于健康志愿者，其會進(jìn)一步誘導(dǎo)Treg分化，引發(fā)免疫抑制。

CD4+CD25+Treg可明顯抑制T細(xì)胞免疫功能，屬于抑制性T細(xì)胞亞群，主要抑制CD4+/CD8+T 細(xì)胞增殖和活化。王秋卉等[14]研究認(rèn)為低表達(dá)CD127的Treg與膿毒癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本文在其研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者CD4+CD25+CD127lowTreg水平顯著高于健康對照組，且重度膿毒癥患者高表達(dá)程度更高(P<0.05)，說明膿毒癥患者免疫功能發(fā)生抑制，提示可將CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞比例作為評價膿毒癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。CD20+CD24hiCD38hiBreg是B淋巴細(xì)胞的重要表型，其表達(dá)水平與機(jī)體免疫耐受顯著相關(guān)，其免疫耐受能力的產(chǎn)生主要由于Breg可通過分泌發(fā)現(xiàn)，TGF-β及IL-10調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[15]。研究證實(shí)Breg在不同疾病中的表達(dá)存在差異，如系統(tǒng)性硬化癥患者Breg表達(dá)顯著降低的同時也會發(fā)生表型及功能損傷，且B 淋巴細(xì)胞受體受到刺激后抑制P38Mark/STAT3 通路激活[16]。連廣琬[17]等研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的CD24hiCD38hiBreg水平顯著低于健康志愿者，認(rèn)為Breg可能通過抑制免疫作用參與免疫性及炎癥反應(yīng)性疾病發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，膿毒癥患者Breg表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

APACHEⅡ評分是評價患者病情嚴(yán)重程度的經(jīng)典指標(biāo)，廣泛適用于各類危重患者。研究證實(shí)APACHEⅡ評分與重癥患者的死亡風(fēng)險呈顯著正相關(guān)[18]。本研究顯示，死亡組患者Treg、DCs PD-L1表達(dá)水平及A-PACHEⅡ評分均顯著高于存活組，Breg水平顯著低于存活組(P<0.001)；Treg水平及DCs PD-L1表達(dá)水平與A-PACHEⅡ評分呈顯著正相關(guān)(r=0.885、0.854，P<0.05)，Breg水平與A-PACHEⅡ評分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.892，P<0.05)。提示Treg、Breg水平及DCs PD-L1表達(dá)水平可作為評估膿毒癥患者預(yù)后的有效指標(biāo)。通過ROC曲線進(jìn)一步分析患者外周血3種細(xì)胞水平預(yù)后預(yù)測的診斷效能，診斷效能均較高(AUC分別為0.896、0.954、0.923)。提示通過檢測膿毒癥患者Treg、Breg及DCs PD-L1水平可有效評估患者病情嚴(yán)重程度，可將其作為預(yù)后預(yù)測的重要指標(biāo)，為膿毒癥的臨床診治提供新的靶點(diǎn)和思路。