胡澤斌，孫彬裕，孫晶，王布強(qiáng)，于婷

·技術(shù)與方法·

抗人球蛋白檢測卡行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的研究

胡澤斌，孫彬裕，孫晶，王布強(qiáng)，于婷

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所（胡澤斌、孫彬裕、孫晶、于婷）；214400 江陰，江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司（王布強(qiáng)）

抗人球蛋白試驗(yàn)已成為臨床上保障安全輸血，診斷預(yù)防新生兒溶血病、自身免疫溶血性疾病、藥物免疫溶血性疾病以及血型學(xué)研究工作中最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)[1-3]?？谷饲虻鞍讬z測試劑以凝膠柱或玻璃珠柱的柱凝集法為主流，是一個(gè)量大面廣的產(chǎn)品[4-5]。從監(jiān)管角度，屬于 III 類高風(fēng)險(xiǎn)體外診斷試劑產(chǎn)品。隨著檢測技術(shù)發(fā)展和臨床需要的增加，國內(nèi)外已有多家生產(chǎn)企業(yè)開發(fā)的抗人球蛋白檢測卡獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)，并且仍有不少企業(yè)正在申報(bào)該類產(chǎn)品的注冊(cè)。但是該類試劑沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)產(chǎn)品臨床使用上的風(fēng)險(xiǎn)不易把控。因此急需制訂針對(duì)抗人球蛋白檢測卡的行業(yè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范統(tǒng)一此類產(chǎn)品的技術(shù)評(píng)價(jià)指標(biāo)，并對(duì)此類試劑質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。

按照國家藥品監(jiān)督管理局 2020 年醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃，由中國食品藥品檢定研究院牽頭，組織多家行業(yè)內(nèi)的檢測機(jī)構(gòu)以及生產(chǎn)企業(yè)，起草制訂了《抗人球蛋白檢測卡（柱凝集法）》醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本研究選取 6 個(gè)代表性的國內(nèi)外生產(chǎn)企業(yè)的 42 批次抗人球蛋白檢測卡，對(duì)擬定標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)指標(biāo)和檢驗(yàn)方法進(jìn)行全面試驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 抗人球蛋白凝膠卡由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供；抗人球蛋白檢測卡（微柱凝膠法）、直接抗人球蛋白試劑分類卡（微柱凝膠法）由蓋立復(fù)醫(yī)藥科技（上海）有限公司提供；低離子抗人球蛋白卡（微柱凝膠法）由伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司提供；抗人球蛋白（抗 IgG + C3d）檢測卡（柱凝集法）、抗人球蛋白（抗 IgG）檢測卡（柱凝集法）、抗人球蛋白（抗 IgG、抗 C3d）檢測卡（柱凝集法）由江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司提供?？谷饲虻鞍祝↖gG）檢測試劑卡（柱凝集法）、抗人球蛋白（IgG，C3b/C3d）檢測試劑卡（柱凝集法）由奧森多醫(yī)療器械貿(mào)易（中國）有限公司提供；抗人球蛋白檢測卡及抗人球蛋白檢測卡（IgG + C3d）由長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 抗人球蛋白試劑（抗 IgG + C3d）國家標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：370029-201601，0.5 ml/支，綠色凍干品，由中國食品藥品檢定研究院提供；抗人球蛋白試劑（抗 IgG）國家標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：370028-201601，0.5 ml/支，白色凍干品，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.3 儀器 北利離心機(jī)、恒溫水槽、微量移液器由中國食品藥品檢定研究院提供；試劑卡孵育器（型號(hào)：K37-24）和血型卡離心機(jī)（型號(hào)：TD2-24）由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供；醫(yī)用離心機(jī)（型號(hào)：DG Spin）和孵育器（型號(hào)：DG Therm）由蓋立復(fù)醫(yī)藥科技（上海）有限公司提供；久保田離心機(jī)（型號(hào)：KA-2200）、卡式離心機(jī)（型號(hào)：D-Centrifuge L）和卡式孵育器（型號(hào)：ID-Incubator L）由伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司提供；血型及配血離心孵育工作組（型號(hào)：ORTHO workstation）、全自動(dòng)血型及配血分析系統(tǒng)（型號(hào)：Ortho Autovue Innova）由奧森多醫(yī)療器械貿(mào)易（中國）有限公司提供；多管架離心機(jī)（型號(hào)：TDZ5-WS）、孵育器（型號(hào)：FYQ）、離心機(jī)（型號(hào)：TD-A）由長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；醫(yī)用離心機(jī)（型號(hào)：LB-3000）、久保田離心機(jī)（型號(hào)：KA-2200）、恒溫水箱（型號(hào)：HH-600）由江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.2 方法

對(duì)現(xiàn)有抗人球蛋白檢測卡產(chǎn)品的性能指標(biāo)進(jìn)行調(diào)研評(píng)估，結(jié)合臨床實(shí)際需求，參考國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)指標(biāo)，制訂《抗人球蛋白檢測卡（柱凝集法）》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，性能指標(biāo)包含外觀、特異性、靈敏度、重復(fù)性、批間重復(fù)性、穩(wěn)定性項(xiàng)目，選擇 6 家企業(yè)的抗人球蛋白檢測卡對(duì)這些評(píng)價(jià)指標(biāo)和檢驗(yàn)方法進(jìn)行全面驗(yàn)證。

1.2.1 外觀 在自然光下目視檢查產(chǎn)品外觀，一般由制造商規(guī)定產(chǎn)品的外觀要求，通常應(yīng)有試劑各組分組成、性狀；內(nèi)外包裝完整、標(biāo)簽清晰等的要求。

1.2.2 特異性與靈敏度

1.2.2.1 間接抗人球蛋白試驗(yàn) 按照抗人球蛋白檢測卡（以下簡稱檢測卡）的產(chǎn)品說明書中間接抗人球蛋白試驗(yàn)的方法進(jìn)行操作和判斷。將 IgG 型抗 D 抗體、抗 Jka/Jkb抗體、抗Fya/Fyb抗體與相應(yīng)抗原陽性的紅細(xì)胞在檢測卡中反應(yīng)，37 ℃孵育后離心，目測觀察，結(jié)果應(yīng)均為陽性反應(yīng)，且凝集強(qiáng)度應(yīng)分別≥ 3+、≥ 1+、≥ 1+；與相應(yīng)抗原陰性的紅細(xì)胞在檢測卡中反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)均為陰性反應(yīng)；健康人的血漿或血清與 O 型紅細(xì)胞在檢測卡中反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性反應(yīng)。

1.2.2.2 直接抗人球蛋白試驗(yàn) 抗人球蛋白檢測卡的 IgG 柱中加入 IgG 型抗 D 抗體、抗 Jka/Jkb抗體、抗 Fya/Fyb抗體致敏的相應(yīng)抗原陽性紅細(xì)胞，結(jié)果應(yīng)均為陽性反應(yīng)，且凝集強(qiáng)度應(yīng)分別≥ 3+、≥ 1+、≥ 1+；加入同樣致敏操作的相應(yīng)抗原陰性紅細(xì)胞，結(jié)果應(yīng)均為陰性反應(yīng)。當(dāng)此柱僅為抗 IgG 柱時(shí)，與 C3d 致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性反應(yīng)。

抗人球蛋白檢測卡的 C3d 柱中加入 C3d 致敏的紅細(xì)胞，結(jié)果應(yīng)為陽性反應(yīng)且凝集強(qiáng)度應(yīng)≥ 1+；當(dāng)此柱僅為抗 C3d 柱時(shí)，與 IgG 型抗 D 抗體致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性反應(yīng)。

1.2.3 國家標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比對(duì)試驗(yàn) 待檢抗人球蛋白（抗 IgG）檢測卡和抗人球蛋白（抗IgG、抗 C3d）檢測卡使用抗人球蛋白試劑（抗 IgG）國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行同步比對(duì)，待檢抗人球蛋白（抗 IgG + C3d）檢測卡應(yīng)使用抗人球蛋白試劑（抗 IgG + C3d）國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行同步比對(duì)。按國家標(biāo)準(zhǔn)品的說明書進(jìn)行操作和判斷，檢測卡間接抗人球蛋白試驗(yàn)檢測 IgG 型抗 D 抗體的效價(jià)，應(yīng)不低于用相應(yīng)抗人球蛋白試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品同步試管法測得的效價(jià)。

1.2.4 批內(nèi)重復(fù)性 間接抗人球蛋白試驗(yàn)：用同批檢測卡分別對(duì)能產(chǎn)生 1+ ～ 2+ 凝集強(qiáng)度稀釋度的 IgG 型抗體與相應(yīng)抗原陽性和陰性紅細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測，各重復(fù)檢測 10 次，結(jié)果均應(yīng)一致；且陽性結(jié)果凝集強(qiáng)度的差異不超過1 個(gè) +。

直接抗人球蛋白試驗(yàn)：用同批檢測卡分別對(duì)能產(chǎn)生1+ ～ 2+ 凝集強(qiáng)度稀釋度的 IgG 型抗體致敏的紅細(xì)胞進(jìn)行檢測，對(duì)同一 C3d 致敏和未致敏紅細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測，各重復(fù)檢測10 次，結(jié)果均應(yīng)一致且陽性結(jié)果反應(yīng)強(qiáng)度的差異不超過 1 個(gè) +。

1.2.5 批間重復(fù)性 用 3 個(gè)批次的檢測卡分別對(duì)批內(nèi)重復(fù)性進(jìn)行檢測，比較 3 批檢測卡的結(jié)果，應(yīng)符合相應(yīng)要求。

1.2.6 效期穩(wěn)定性 制造商應(yīng)規(guī)定過效期后多長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行效期穩(wěn)定性檢測，一般取到效期后一個(gè)月內(nèi)的產(chǎn)品，檢驗(yàn)其外觀、特異性、靈敏度和批內(nèi)重復(fù)性，結(jié)果應(yīng)符合上述要求。

1.2.7 熱穩(wěn)定性 制造商應(yīng)規(guī)定熱穩(wěn)定性的放置時(shí)間是否與剩余效期有關(guān)，一般在 37 ℃條件下加熱檢測卡 7 d 后，檢驗(yàn)其外觀、特異性、靈敏度和批內(nèi)重復(fù)性，結(jié)果應(yīng)符合上述要求。

2 結(jié)果

2.1 外觀驗(yàn)證結(jié)果

采用 6 家共 42 批次抗人球蛋白檢測卡試劑盒，依據(jù)擬定抗人球蛋白檢測卡行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的性能指標(biāo)進(jìn)行全部驗(yàn)證，所有試劑盒的各組分齊全、完整，包裝標(biāo)簽清晰、無磨損，試劑卡封口完好，凝膠柱形態(tài)完整，凝膠呈均勻微顆粒狀，無干裂或氣泡、異物等。外觀均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2 特異性與靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

使用三種檢測卡：抗人球蛋白（抗 IgG + C3d）檢測卡（柱凝集法）、抗人球蛋白（抗 IgG、抗 C3d）檢測卡（微柱凝膠法）、抗人球蛋白（抗 IgG）檢測卡（柱凝集法）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證。間接抗人球蛋白試驗(yàn)中，將 IgG 型抗 D 抗體、抗 Jka或 Jkb抗體、抗 Fya抗體分別與 D 抗原、Jka或 Jkb抗原、Fya抗原陽性的紅細(xì)胞在檢測卡中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果均為陽性反應(yīng)，凝集強(qiáng)度分別是 3+ ～ 4+、1+ ～ 3+、1+ ～ 4+；與相應(yīng)抗原陰性的紅細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果均為陰性反應(yīng)；將 AB 型血漿與 O 型紅細(xì)胞在檢測卡中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果均為陰性反應(yīng)。間接抗人球蛋白試驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果如表 1 所示，均滿足擬定標(biāo)準(zhǔn)的要求。

直接抗人球蛋白試驗(yàn)中，將 IgG 型抗 D 抗體、抗 Jka或 Jkb抗體、抗 Fya抗體致敏的相應(yīng)抗原陽性紅細(xì)胞，C3d 致敏的紅細(xì)胞加入到檢測卡中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果均為陽性反應(yīng)，凝集強(qiáng)度分別是 3+ ～ 4+、1+ ～ 4+、1+ ～ 4+、1+ ～ 4+；將同樣致敏操作的相應(yīng)抗原陰性紅細(xì)胞加入到檢測卡中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果均呈陰性反應(yīng)；檢測卡的微柱僅為抗 IgG 柱時(shí)，與 C3d 致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果均為陰性反應(yīng)；檢測卡的微柱僅為抗 C3d 柱時(shí)，與IgG 型抗 D 抗體致敏的D 抗原陽性紅細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果均為陰性反應(yīng)。直接抗人球蛋白試驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果如表2 所示，均滿足擬定標(biāo)準(zhǔn)的要求。

表 1 間接抗人球蛋白試驗(yàn)的特異性和靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

注：“-”表示陰性反應(yīng)；“/”表示該試劑盒未對(duì)該項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證；試劑盒為抗人球蛋白分型檢測卡（抗 IgG、抗 C3d）時(shí)，僅抗 IgG 柱進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗(yàn)的驗(yàn)證，抗 C3d 柱不進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗(yàn)的驗(yàn)證。

表 2 直接抗人球蛋白試驗(yàn)的特異性和靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

注：“-”表示陰性反應(yīng)；“/”表示該試劑盒未對(duì)該項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 效價(jià)比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果

抗人球蛋白試劑（抗 IgG + C3d）國家標(biāo)準(zhǔn)品用于評(píng)價(jià)不同廠家的柱凝集法的抗人球蛋白卡（抗 IgG + C3d）間接抗人球蛋白試驗(yàn)檢測 IgG 型抗體的效價(jià)，抗人球蛋白試劑（抗 IgG）國家標(biāo)準(zhǔn)品用于評(píng)價(jià)不同廠家柱凝集法的抗人球蛋白卡（抗 IgG 部分）間接抗人球蛋白試驗(yàn)檢測 IgG 型抗體的效價(jià)。結(jié)果如表 3 所示，4 家企業(yè)的抗人球蛋白卡（抗 IgG + C3d）的效價(jià)測定結(jié)果在 1:512 ～ 1:1024，3 家企業(yè)的抗人球蛋白卡（抗 IgG）的效價(jià)測定結(jié)果在 1:512 ～ 1:1024，均高于相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品的同步效價(jià)結(jié)果，滿足要求。

表 3 國家標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比對(duì)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.4 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

采用表 1 中 6 個(gè)企業(yè)的 11 種抗人球蛋白檢測卡各 3 批次，進(jìn)行了批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。間接抗人球蛋白試驗(yàn)的重復(fù)性結(jié)果顯示，1+ ～ 2+ 凝集強(qiáng)度稀釋度的 IgG 型抗體與 D 抗原陽性紅細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)檢測 10 次，11 種抗人球蛋白檢測卡結(jié)果均為陽性且凝集強(qiáng)度的差異不超過 1 個(gè) +；1+ ～ 2+ 凝集強(qiáng)度稀釋度的 IgG 型抗體與 D 抗原陰性紅細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)檢測 10 次，11 種抗人球蛋白檢測卡結(jié)果均為陰性。

直接抗人球蛋白試驗(yàn)的重復(fù)性結(jié)果顯示，將 1+ ～ 2+ 凝集強(qiáng)度稀釋度的 IgG 型抗體致敏的紅細(xì)胞和 C3d 致敏紅細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)檢測 10 次，11 種抗人球蛋白檢測卡結(jié)果均為陽性且凝集強(qiáng)度的差異不超過 1 個(gè) +。將未致敏紅細(xì)胞樣本進(jìn)行重復(fù)檢測 10 次，11 種抗人球蛋白檢測卡結(jié)果均為陰性。

2.5 穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

效期穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性項(xiàng)目中，均采用表 3 中 5 家企業(yè)的 7 種抗人球蛋白檢測卡各 1 批次，對(duì)過效期的檢測卡和 37 ℃加熱 7 d 的檢測卡，進(jìn)行外觀、特異性、靈敏度和批內(nèi)重復(fù)性項(xiàng)目的性能檢測。試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有項(xiàng)目均符合擬定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3 討論

抗人球蛋白試驗(yàn)（又稱 Coombs 試驗(yàn)）是測定結(jié)合在紅細(xì)胞上的抗體和（或）補(bǔ)體的主要方法。直接 Coombs 試驗(yàn)是檢測體內(nèi)已被抗體和（或）補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞。間接 Coombs 試驗(yàn)通過血清與細(xì)胞的孵育，證實(shí)抗體和（或）補(bǔ)體與紅細(xì)胞在體外的結(jié)合。在臨床常規(guī)的交叉配血、抗體篩檢鑒定、新生兒溶血病診斷過程中胎（嬰）兒致敏紅細(xì)胞檢測、新生兒溶血病胎（嬰）兒或母體不完全抗體的檢測中，要求對(duì)具有輸血史、妊娠史以及輸用過血液制品的受血者和供血者都應(yīng)該進(jìn)行不完全抗體檢測[6-8]。最初最廣泛使用的 Coombs 試驗(yàn)是使用抗人球蛋白檢測液體試劑在試管中進(jìn)行檢測，即試管法，但該方法操作步驟繁瑣，且不能同時(shí)對(duì)多份樣本檢測。1989 年，法國學(xué)者發(fā)明了一種凝膠技術(shù)，該技術(shù)很快商品化并迅速推廣應(yīng)用到臨床輸血，并產(chǎn)生了“凝膠試驗(yàn)”（gel test）的專用名詞[9-12]。不完全抗體和相應(yīng)抗原紅細(xì)胞，在含有抗人球蛋白凝膠介質(zhì)中進(jìn)行的 Coombs 試驗(yàn)被稱為微柱凝膠 Coombs 試驗(yàn)。隨著技術(shù)研發(fā)的不斷進(jìn)步，除凝膠柱之外，還出現(xiàn)了玻璃珠柱的抗人球蛋白檢測卡。這種柱凝集法的抗人球蛋白檢測卡以其簡便快捷和高靈敏度的優(yōu)勢在臨床中廣為使用，但是不同廠家的產(chǎn)品在原材料的選擇和設(shè)計(jì)、樣本的選取及成品質(zhì)量控制等方面有所差異，導(dǎo)致檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性也受到影響。因此制訂一個(gè)抗人球蛋白檢測試劑的通用標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)一規(guī)范及要求，與抗人球蛋白試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品配合使用，將有助于該產(chǎn)品的質(zhì)量提升，更好滿足臨床需求和市場監(jiān)管。

本標(biāo)準(zhǔn)為首次制訂，主要內(nèi)容包括范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、要求、試驗(yàn)方法、標(biāo)簽和使用說明書、包裝、運(yùn)輸、貯存、附錄 A（檢測所用紅細(xì)胞）、附錄 B（檢測所用血清或血漿）、附錄 C（抗人球蛋白試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品）、參考文獻(xiàn)。本標(biāo)準(zhǔn)編制時(shí)遵守了GB/T 1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則》系列標(biāo)準(zhǔn)確定的規(guī)則。本標(biāo)準(zhǔn)在相關(guān)技術(shù)指標(biāo)的確定方面，參考了國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)文件以及目前市場上產(chǎn)品說明書和性能評(píng)估資料[13]，并結(jié)合臨床要求著重從保障臨床安全輸血角度出發(fā)，在產(chǎn)品的特異性和靈敏度這兩個(gè)關(guān)鍵性能指標(biāo)中，不僅規(guī)定了間接抗人球蛋白試驗(yàn)的質(zhì)量要求，同時(shí)規(guī)定了直接抗人球蛋白試驗(yàn)的質(zhì)量要求。業(yè)內(nèi)專家對(duì)逐條性能指標(biāo)進(jìn)行了充分討論。并且對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中每一條性能指標(biāo)和試驗(yàn)方法均進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，關(guān)鍵指標(biāo)效價(jià)評(píng)價(jià)采用了相應(yīng)的抗人球蛋白試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行考察，如上所述，驗(yàn)證結(jié)果全部符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求。綜上，本次制訂的適用于柱凝集法的抗人球蛋白檢測卡產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，所列技術(shù)指標(biāo)是合理的，所列試驗(yàn)方法是可靠的、可行的。

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國家藥品監(jiān)督管理局2020年醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃（I2020007-T-ZJY）

王布強(qiáng)，Email：15995361358@126.com；于婷，Email：yuting@nifdc.org.cn

2022-01-21