奎秀瑩代解杰

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 昆明 650118)

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一種單股正鏈RNA 病毒,屬于黃病毒科黃病毒屬,與其他黃病毒類似,寨卡病毒基因組長約1.1 × 104bp,只有一個開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼3 個結(jié)構(gòu)蛋白和7 個非結(jié)構(gòu)蛋白,包括5′端的結(jié)構(gòu)蛋白C、prM 和 E,以及 3′端的 NS1、NS2a、NS2、NS3、NS4a、NS4b 和NS5[1-2]。寨卡病毒引起的疾病是一種蟲媒傳染性疾病,在人群中的傳染率極高,一旦感染該病毒,一部分人即出現(xiàn)頭痛、發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛等多種病癥[3],有的還會引起神經(jīng)系統(tǒng)性疾病,其可經(jīng)白紋伊蚊和埃及伊蚊叮咬傳播,因而這一病毒的傳播更加迅速[4-5]。寨卡病毒早在1947 年就已被發(fā)現(xiàn),但直到2015 年美洲大爆發(fā)后其對胎兒健康發(fā)育的破壞性影響才被公認(rèn)[6]。到2016 年,南美洲和中美洲已有31 個國家和地區(qū)報道了這一蟲媒病毒的傳播[7]。同年2 月,中國、日本和韓國也陸續(xù)報道了寨卡病毒的感染病例,這標(biāo)志著寨卡病毒已蔓延至全球[8]。經(jīng)過對感染病毒者的追蹤調(diào)查以及多項研究,發(fā)現(xiàn)寨卡病毒還可通過血液、淚液傳播、性傳播以及母嬰傳播[9-11],研究者對被感染的埃及伊蚊后代進(jìn)行實(shí)驗室檢測后,發(fā)現(xiàn)其后代的多個內(nèi)臟器官以及唾液腺中都有寨卡病毒RNA 的存在,同樣證實(shí)了寨卡病毒可經(jīng)母嬰垂直傳播[12]。一旦孕婦感染上該病毒也就意味著新生嬰兒有極大概率會攜帶這一病毒,并且嬰兒的神經(jīng)系統(tǒng)、身體發(fā)育也會受到嚴(yán)重阻礙,即寨卡病毒的垂直傳播會導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞感染和腦實(shí)質(zhì)破壞[13]。

目前已有大量的研究發(fā)現(xiàn)寨卡病毒的感染可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)從輕度發(fā)熱到重度神經(jīng)系統(tǒng)紊亂甚至嬰兒死亡等癥狀[14-15]。早前人們得出結(jié)論,寨卡病毒感染孕婦,胎兒比較突出的先天性寨卡綜合癥(congenital Zika syndrome,CZS)癥狀為小頭畸形、腦部發(fā)育不全、眼部異常以及關(guān)節(jié)攣縮等[16-18],而順利出生的嬰兒則常伴有癲癇、發(fā)育遲緩和視力障礙[19]。近期有文獻(xiàn)報道,有些出現(xiàn)先天性寨卡綜合征的嬰兒在影像學(xué)上未觀察到腦成像異常,因而,在判定嬰兒是否有先天性寨卡綜合征時,還需關(guān)注除影像學(xué)外的其他癥狀[20]。從各個地區(qū)的不同病例身上也發(fā)現(xiàn)孕婦感染寨卡病毒后,母體和胎兒均會表現(xiàn)出發(fā)燒、結(jié)膜炎、皮疹等癥狀[21],多個病例均證實(shí)寨卡病毒可以通過母嬰垂直傳播感染胎兒,并且能夠?qū)е绿撼霈F(xiàn)比成年人更嚴(yán)重的病癥,實(shí)驗觀察到胎兒多表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂,生長受限,頭部發(fā)生小頭畸形等[22-23],以及一些眼部疾病,常見的包括視網(wǎng)膜局灶性色素斑點(diǎn)和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮[24],嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致孕婦流產(chǎn)和胎兒死亡[25-26]。

為了能夠更細(xì)致地研究寨卡病毒垂直傳播的全過程,探究病毒在母嬰之間的傳播路徑,尋找阻斷寨卡病毒母嬰傳播的突破口,很多研究人員都在致力于妊娠期間寨卡病毒動物模型的建立,希望能夠較大程度地模擬寨卡病毒在人類身上的垂直傳播過程,以便開展病毒侵染胎兒的相關(guān)研究。一個成功的動物模型能夠在研究病毒感染分子機(jī)制、藥物治療以及疫苗研發(fā)等多個方面起到不可替代的作用。在已有的研究中,很多研究者發(fā)現(xiàn)不同的動物感染寨卡病毒后,動物的表現(xiàn)有很多相似之處,同時也存在一定的差異。

1 寨卡病毒感染孕期小鼠

有研究顯示,寨卡病毒感染未懷孕小鼠,或一些妊娠期間免疫能力強(qiáng)的雌鼠時,會出現(xiàn)病毒無法復(fù)制或沒有臨床癥狀的現(xiàn)象,說明小鼠的天然免疫系統(tǒng)可以阻擋部分病毒的侵入[27]。但對于大多妊娠期間的雌鼠,其免疫功能都會受到一定影響,這也就減弱它們身體抵抗病毒入侵的能力,以致于雌鼠在妊娠期間易出現(xiàn)各種疾病。Miner 等[28]的實(shí)驗表明,在懷孕雌鼠胚胎期第6.5 天和第7.5 天進(jìn)行皮下注射寨卡病毒,胚胎期第13.5 天有胎兒死亡,并被母體吸收,剩下部分胎盤殘留,未死亡的將雌鼠施以安樂死后,取出的胎盤可見到明顯的胎盤顏色發(fā)白,組織壞死,胎兒的冠臀長度相比對照而言也有縮小。為確定母體中的寨卡病毒是否侵入到胎兒體內(nèi),研究者們還對胎兒進(jìn)行了病毒檢測,結(jié)果顯示,在胎兒頭部及體內(nèi)有高水平的寨卡病毒核酸并且其核酸有復(fù)制能力。在Cugola 等人[29]的研究中發(fā)現(xiàn),接種過寨卡病毒的雌鼠產(chǎn)下的小鼠有顯著的全身生長遲緩和宮內(nèi)生長受限的現(xiàn)象,大腦皮層出現(xiàn)畸形,細(xì)胞數(shù)目減少且皮層厚度也下降,qPCR 檢測結(jié)果證實(shí),小鼠大腦內(nèi)的病毒核酸量遠(yuǎn)高于身體的其它組織。此外,他們還觀察到小鼠眼部與正常小鼠相比存在一些異常,這與人類感染寨卡病毒后新生兒的眼部畸形癥狀較為相似[24]。野生型C57BL/6 小鼠是個能夠穩(wěn)定傳代的品系,目前有較多研究者利用該品系小鼠進(jìn)行實(shí)驗。在Yockey 等[30]的實(shí)驗中,他們用寨卡病毒感染懷孕的野生型C57BL/6 雌鼠,利用電子顯微鏡可觀察到胎兒的大腦皮層和小腦中存在寨卡病毒,盡管在RT-PCR 的檢測中未檢測到病毒顆粒。通過腹腔注射的方式接種病毒,可在腦室區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞中檢測到病毒[31]。而通過直接接種病毒至母體羊水或子宮中的方法感染時,能夠看到自然流產(chǎn)、脊髓缺損、運(yùn)動神經(jīng)元和眼部畸形,或是存活的小鼠顱內(nèi)鈣化的顯著臨床癥狀[32-33]。

Yockey 等[30]的實(shí)驗則證實(shí)了寨卡病毒感染懷孕雌鼠的陰道后,病毒能夠經(jīng)黏膜感染小鼠,并導(dǎo)致胎兒的感染,野生型小鼠和缺乏I 型干擾素的小鼠感染后均會出現(xiàn)胎兒生長受限以及腦內(nèi)病毒水平較高的現(xiàn)象,缺乏I 型干擾素的小鼠胎兒癥狀尤為顯著,有的雌鼠甚至?xí)鳟a(chǎn)。有研究表明,寨卡病毒對小鼠體內(nèi)I 型干擾素信號通路中的關(guān)鍵中心體小鼠STAT2 的拮抗能力較弱,導(dǎo)致病毒的外周感染受阻[34-35]。因而研究人員利用C57BL/6 小鼠進(jìn)行了兩組實(shí)驗,一組是I 型干擾素受體基因敲除的小鼠和野生小鼠雜交,之后采用皮下注射的方式進(jìn)行病毒感染,另一組是在病毒感染之前對受精的小鼠加入I 型干擾素受體抗體,感染結(jié)果顯示,兩組實(shí)驗小鼠均出現(xiàn)垂直傳播現(xiàn)象,胎兒都有宮內(nèi)生長受限的癥狀[36],基因敲除后的小鼠表現(xiàn)更為明顯,還有胎盤損傷、胎兒發(fā)白及頭部感染等現(xiàn)象[28]。在近期研究中,研究人員還發(fā)現(xiàn)利用RT-PCR 進(jìn)行病毒核酸檢測時,I 型干擾素缺陷的雌鼠體內(nèi)胎盤中的病毒含量要遠(yuǎn)高于胎兒體內(nèi),然而胎兒已出現(xiàn)較顯著的生長受限以及頭部畸形的臨床癥狀了[37],這一結(jié)果表明寨卡病毒在懷孕雌鼠體內(nèi)通過胎盤傳播感染的概率極高,并且對胎兒有較強(qiáng)的致病性。利用寨卡病毒感染小鼠進(jìn)行體內(nèi)成像,追蹤病毒在小鼠體內(nèi)的感染路徑,也能清晰地看到寨卡病毒垂直傳播的動態(tài)效果[38]。

在小鼠I 型干擾素會使寨卡病毒感染受阻的研究基礎(chǔ)上,Gorman 等[39]用同源重組的方式將人STAT2 等位基因插入到C57BL/6 小鼠的STAT2 位點(diǎn),再對其進(jìn)行皮下注射寨卡病毒,結(jié)果顯示,母體血清和脾中含有高濃度的寨卡病毒,胎兒的頭部、胎盤以及胎盤與子宮內(nèi)膜的連接層也可以檢測到較高的病毒RNA。

2 寨卡病毒感染孕期非人靈長類動物

在靈長類動物中,有不少研究者對恒河猴進(jìn)行了實(shí)驗。Dudley 等[40]對妊娠期分別為31、38 d(孕中期)的恒河猴接種寨卡病毒后,追蹤觀察,發(fā)現(xiàn)感染后第2 天就能在血漿、尿液甚至唾液中檢測到105左右的病毒含量,之后的4 ～6 d 逐步增加,母體中的CD8+T 細(xì)胞數(shù)量顯著高于未懷孕的恒河猴,妊娠31 d 的恒河猴表現(xiàn)尤為明顯,NK 細(xì)胞的活性也有所升高,但這一表現(xiàn)與未懷孕的感染猴體內(nèi)水平相當(dāng),未見突出異常。此外,在胎兒的腦內(nèi)能夠檢測到較高水平的寨卡病毒。在 Nguyen 等[41]的研究中,懷孕恒河猴的血液、尿液中均可檢測出寨卡病毒的存在,4 只實(shí)驗猴中,有2 只可在唾液中檢測到病毒存在,有1 只可在羊水中檢測到,此外,4 只實(shí)驗猴均表現(xiàn)出明顯的血漿病毒血癥。超聲成像顯示,在妊娠最后1 個月時,胎兒的頭圍相較于正常胎兒小了一個標(biāo)準(zhǔn)差。進(jìn)行qRT-PCR 后,胎兒身體的多個組織中檢測出寨卡病毒核酸,包括淋巴、肺、脾、肝等。經(jīng)組織病理學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)胎兒均表現(xiàn)出輕微至中度嚴(yán)重性不等的化膿性中耳炎,4 只胎兒中有3 只出現(xiàn)化膿性羊膜炎,另1 只則出現(xiàn)輕度至中度化膿性脾炎。此外,還有的胎兒出現(xiàn)化膿性肺炎、化膿性淋巴結(jié)炎和化膿性肝炎等。眼部組織病理分析還發(fā)現(xiàn)有視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和視神經(jīng)的炎癥,但未發(fā)現(xiàn)胎兒腦內(nèi)的異常表現(xiàn)。

在更近的妊娠期恒河猴感染實(shí)驗[42]中,4 只懷孕恒河猴分別在妊娠41、50、64 和90 d 時靜脈接種寨卡病毒。其中妊娠41 d 時接種的實(shí)驗猴胎兒在接種7 d 后即死亡,且能在胎兒體內(nèi)和胎盤中檢測到較高的病毒載量。其余3 只均未見胎兒死亡,根據(jù)實(shí)驗需要安樂死后對嬰兒和母體進(jìn)行進(jìn)一步的分析。妊娠64 d 接種的母體會出現(xiàn)間歇性胎盤出血的現(xiàn)象,生產(chǎn)的嬰兒生長受限,導(dǎo)致個體相對較小。妊娠50、90 d 接種的嬰兒個體沒有明顯的小頭畸形癥狀,體型在恒河猴平均范圍內(nèi),只是生長有所遲緩。在嬰兒的多個器官中都檢測到寨卡病毒,尤其是腦部存在大量病毒,還觀察到腦內(nèi)出現(xiàn)鈣化和神經(jīng)前體細(xì)胞明顯減少的現(xiàn)象。這一結(jié)論與人類胎兒感染后大腦腦室周圍白質(zhì)鈣化相吻合[43-44]。

近期,另一項用恒河猴建立新生兒寨卡病毒感染模型的研究[45]表明,在母體和胎兒體內(nèi)利用RTPCR 技術(shù)都能檢測到較高水平的寨卡病毒RNA,胎兒頭部與正常動物相比雖沒有出現(xiàn)畸形,但頭圍明顯縮小,并且胎盤出現(xiàn)異于常見雙胎盤的單盤狀結(jié)構(gòu)。此外,研究人員還進(jìn)行了心臟病理學(xué)、功能性神經(jīng)病理學(xué)、感覺以及安樂死后的后期神經(jīng)病理學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)聽覺和視覺未見明顯異常,但心臟收縮時出現(xiàn)雜音,且胸片也顯示心臟腫大,神經(jīng)方面出現(xiàn)抽搐、運(yùn)動遲緩和腦內(nèi)出現(xiàn)不同程度的損傷,包括鈣化,炎癥,不同神經(jīng)細(xì)胞增加或丟失等情況。

除恒河猴外,用豚尾猴進(jìn)行寨卡病毒感染實(shí)驗也有相似的癥狀出現(xiàn)。皮下接種人工高劑量寨卡病毒后(每只接種量為7 log10PFU,蚊子叮咬傳播一般為1 log10PFU ～5 log10PFU[46-47]),顯微鏡觀察,可見胎兒也出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷,包括腦發(fā)育不全、腦室周圍白質(zhì)膠質(zhì)增生、軸突細(xì)胞損傷,神經(jīng)前體細(xì)胞減少等。此外,還有豚尾猴的室管膜細(xì)胞也顯示有損傷現(xiàn)象[48]。

此外,狨猴在感染寨卡病毒后也會出現(xiàn)一些類似于人的癥狀。Seferovic 等[49]在用寨卡病毒對懷孕68、79 d 的狨猴進(jìn)行肌肉注射感染后,兩組狨猴都出現(xiàn)胎兒死亡,流產(chǎn)的明顯表征,尸檢時也能夠檢測到胎盤和胎兒中存在極高的病毒RNA 含量,明顯高于母體腎、淋巴中的載量水平。

因此,通過開發(fā)模擬自然經(jīng)胎盤傳播的非靈長類動物模型[50],可以對進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化直接胎兒接種模型有較大的啟發(fā)和幫助,為解決寨卡病毒發(fā)病機(jī)制研究中還未解決的關(guān)鍵問題提供研究平臺,并從中尋找阻斷寨卡病毒感染相關(guān)的方法,以便更好的指導(dǎo)臨床試驗[43]。

3 寨卡病毒感染雞胚

在人們發(fā)現(xiàn)寨卡病毒可導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀后,有研究者采用可有效擴(kuò)增多種病毒的雞胚進(jìn)行了羊膜卵穿刺接種感染試驗。他們發(fā)現(xiàn),雞胚在接種后的臨床癥狀對寨卡病毒有較強(qiáng)的劑量依賴性,高劑量的病毒接種可直接導(dǎo)致胚胎死亡,而相對低劑量的病毒可導(dǎo)致雞胚生長受限,腦組織發(fā)育受到抑制,大腦皮層區(qū)域腦心室出現(xiàn)較空的狀況[51],出生的小雞伴有小頭樣癥狀表現(xiàn),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及身體各個器官中也能夠檢測到有效的寨卡病毒復(fù)制[52]。雞胚對寨卡病毒的易感性,病毒感染后的致死情況以及與人類較類似的神經(jīng)系統(tǒng)變化等優(yōu)勢提示我們,可利用雞胚作為模式動物進(jìn)行寨卡病毒的胚胎感染機(jī)理研究[53]。然而由于雞胚在進(jìn)化關(guān)系上與人類稍有距離,并且其孵育時間過短,往往在還未見胚胎有明顯變化時,就出現(xiàn)胚胎死亡或者出生的現(xiàn)象,實(shí)驗者難以進(jìn)行某一時段具體研究,因而可以將雞胚和其他物種動物模型相互補(bǔ)充,實(shí)現(xiàn)寨卡病毒致病機(jī)理從整體到局部的一系列研究。

4 總結(jié)與展望

目前全球已有多個實(shí)驗室建立了各自的寨卡病毒動物模型,其中應(yīng)用較為廣泛的就是嚙齒類和非人靈長類,其中,小鼠和恒河猴還被建立了妊娠期的感染模型。小鼠的研究相對全面且多樣化,包括免疫健全小鼠、I 類/II 類干擾素受體缺乏小鼠以及各類免疫缺陷型小鼠等寨卡病毒感染模型。從實(shí)驗結(jié)果總體來看,免疫健全的小鼠普遍對寨卡病毒有一定程度的耐受能力,若建立動物模型將不利于后續(xù)對病毒傳播能力和致病機(jī)制的評價[54-55]。而缺乏干擾素受體和免疫缺陷型小鼠感染后會出現(xiàn)一些與人類感染后相似的癥狀,可以根據(jù)不同的研究需求來利用具有相應(yīng)缺陷型的小鼠模型進(jìn)行寨卡病毒的分子機(jī)制研究,病毒疫苗和治療藥物的前期評價等。此外,小鼠的生殖周期相對較短,利用妊娠期間的小鼠來建立模型可以在較短時間內(nèi)得到實(shí)驗所需數(shù)據(jù),由于其體型小的優(yōu)勢,進(jìn)行體內(nèi)病毒感染追蹤成像時也較容易操作。

從非人靈長類動物的實(shí)驗結(jié)果可以看出,妊娠期恒河猴感染寨卡病毒后胎兒所表現(xiàn)出的生長遲緩,腦部神經(jīng)細(xì)胞損傷、減少,神經(jīng)系統(tǒng)損傷,多個器官和胎盤病毒水平極高,以及部分育齡較小胎兒死亡等現(xiàn)象,從臨床表現(xiàn)來看,恒河猴是對病毒入侵胎兒感染機(jī)制研究最恰當(dāng)?shù)牟牧?也是病毒疫苗和藥物有效性評價不可替代的實(shí)驗?zāi)Ｐ?。然?它們繁殖周期較長,實(shí)驗成本高等問題也是很多實(shí)驗室所面臨的實(shí)際難題。因此,在對寨卡病毒的各項研究中,可以將非靈長類動物用于后期實(shí)驗,不僅能夠達(dá)到實(shí)驗驗證和評價的效果,還能很大程度上節(jié)約時間成本和經(jīng)濟(jì)成本。

目前由寨卡病毒給人們帶來了不小的影響,尤其是病毒經(jīng)胎盤垂直傳播對新生兒造成的感染,影響其一生,對社會造成了較大的負(fù)擔(dān),而只有合適的動物模型才能夠更清楚地研究病毒如何從母體子宮經(jīng)胎盤侵入胎兒體內(nèi),從根本上阻斷這一方式的傳播,減小病毒對下一代造成的影響?，F(xiàn)有的動物模型,都只能分別從其中一些方面模擬出人類的感染癥狀,要想對其垂直傳播進(jìn)行更進(jìn)一步的研究,目前仍缺乏一個較合適的動物模型,這對寨卡病毒的深入研究也是一個較大的阻礙。在未來的研究中,需要尋找更合適的動物來建立寨卡病毒垂直傳播的感染模型,為探究其垂直傳播感染路徑及其分子機(jī)制,開發(fā)預(yù)防性疫苗,尋找有效的檢測辦法及治療方法提供更佳的平臺。