李謙畢愛玲王興榮?畢宏生?

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué),濟南 250002; 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院,濟南 250002;3. 山東省中西醫(yī)結(jié)合眼病防治重點實驗室,濟南 250002; 4. 山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所,濟南 250002)

鈣(Ca2+)是調(diào)節(jié)真核細胞重要活動的第二信使,介導(dǎo)去極化信號的傳導(dǎo),并參與突觸活動的調(diào)控及生物體內(nèi)多種功能的調(diào)節(jié),它對神經(jīng)元的功能至關(guān)重要。當細胞受到外界各種刺激時,細胞外鈣離子內(nèi)流或細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的鈣離子釋放,調(diào)控鈣離子在神經(jīng)細胞質(zhì)膜內(nèi)外的濃度變化,轉(zhuǎn)化為細胞反應(yīng)的信號,引起一系列生理反應(yīng)。細胞內(nèi)鈣離子的測定是研究神經(jīng)元鈣信號的基礎(chǔ)。然而在細胞內(nèi)Ca2+濃度比較低,而且變化迅速,加上Mg2+、Na+、K+等其他離子的濃度較高,通常要比它高出104～106倍,很容易造成較大的干擾,因此,測定細胞內(nèi)鈣離子的濃度比較困難,需要發(fā)展靈敏度高、特異性高的鈣離子檢測技術(shù)。

在早期的大腦皮層神經(jīng)元的相關(guān)研究中,大多數(shù)使用了電生理技術(shù)來研究神經(jīng)元的活動,這項技術(shù)尚存在許多缺點,尤其在長時程記錄神經(jīng)元活動方面,特別不穩(wěn)定,細胞記錄的位置會隨著時間改變[1],這可能導(dǎo)致每天記錄細胞的不同,極大地影響了信號的穩(wěn)定性。鈣成像是一項相對較新的技術(shù),它可以更好地解決電生理記錄的主要弱點。顯微成像技術(shù)的不斷發(fā)展,以及新型鈣指示劑的應(yīng)用,使得鈣信號檢測技術(shù)更加成熟[2]。神經(jīng)系統(tǒng)鈣成像技術(shù)的發(fā)展是一個長期的過程,這包括合適的鈣指示劑的選擇,不同的染色加載技術(shù)的應(yīng)用,以及用于體內(nèi)和體外最先進的鈣成像設(shè)備的發(fā)現(xiàn)。

目前研究發(fā)現(xiàn),雙光子鈣成像技術(shù)已經(jīng)徹底改變了鈣成像領(lǐng)域的研究[3-4],得到了很大的普及與應(yīng)用;隨著微光學(xué)的梯度折射率(GRIN)透鏡系統(tǒng)的出現(xiàn),深腦顯微鈣成像技術(shù)促進了對大腦深層神經(jīng)活動的可視化,從而大大增加了大腦中可以被觀察和監(jiān)控的神經(jīng)元的數(shù)量[5];近幾年,一種光纖鈣信號記錄方法也得到了快速發(fā)展和應(yīng)用。本文就模型動物視皮層鈣信號檢測的方法及其應(yīng)用進行綜述。

1 雙光子鈣成像技術(shù)

雙光子鈣成像技術(shù)已經(jīng)成為一種在亞細胞水平上探索神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的有效方法。其應(yīng)用范圍從亞細胞成像,如樹突、軸突,到神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的功能分析。雙光子顯微鏡可以對活體動物的神經(jīng)回路進行系統(tǒng)的成像,可以同時記錄多個神經(jīng)元,允許在小鼠皮層上以單細胞分辨率對神經(jīng)元群進行活體功能成像[6]。雙光子顯微鏡的光源是一種飛秒激光,它可以發(fā)出具有高峰值功率的周期性脈沖序列的紅外波段。由于紅外光對組織的穿透性較深,因此雙光子顯微鏡非常適合于組織成像。在典型的雙光子顯微鏡中,一束飛秒激光被聚焦到一個有限衍射點上,然后掃描整個目標皮層,皮層被激發(fā)后,可以發(fā)射出被光電倍增管(PMT)收集的熒光,最終由探測系統(tǒng)收集形成一個圖像。由于樣品是被激發(fā)的,信號是逐點收集的,這種方法克服了散射組織的寬場成像中出現(xiàn)的像素干擾。此外,較長的激發(fā)波長相比于單光子激發(fā)更能抵抗組織的散射。由于雙光子顯微鏡具有較高的光采集效率、穿透深度和較低的光毒性,因此它通常是共聚焦顯微鏡在神經(jīng)元功能成像方面較好的替代物。它使一系列關(guān)于嚙齒類動物的神經(jīng)科學(xué)的研究成為可能,如分析皮層之間的功能連接、皮層對各種感覺刺激的反應(yīng)、行為過程中的神經(jīng)活動、神經(jīng)血管耦合以及脊柱結(jié)構(gòu)和功能等諸多研究[7]。

雙光子成像允許深入組織觀察,能夠監(jiān)測神經(jīng)元的Ca2+變化。使用雙光子顯微鏡在模型動物的研究已經(jīng)取得了顯著進展。Tran 等[8]運用雙光子在體成像技術(shù)對小鼠皮層進行鈣成像,檢測到了活躍小鼠星形膠質(zhì)細胞中頻繁的Ca2+瞬變。Muir 等[9]使用漂移光柵和格子模式的刺激來研究小鼠初級視覺皮層(V1 區(qū))對感覺特征的局部整合,同時用雙光子鈣成像記錄麻醉小鼠V1 區(qū)Ⅱ/Ⅲ層視覺誘發(fā)的神經(jīng)元活動。該成像系統(tǒng)是由Ti:藍寶石激光發(fā)射系統(tǒng)提供波長為830 nm 或870 nm 的100 fs 激光脈沖來測量熒光變化,揭示了小鼠V1 區(qū)神經(jīng)元群在移動光柵和格子模式的視覺刺激階段的視覺特征的整合水平。McClure 等[10]利用雙光子鈣成像技術(shù)成功地在清醒的小鼠上進行測量了V1 層數(shù)千個Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元,比較了V1 區(qū)Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元在單模態(tài)(僅視覺)或多模態(tài)(視、聽)條件下的取向和漂移光柵的方向表征,最終發(fā)現(xiàn)了聲音通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的方向、方向調(diào)節(jié)特性以及響應(yīng)振幅來改善Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元中視覺刺激的方向和方向表征。

雙光子鈣成像在體檢測技術(shù)在阿爾茨海默病(AD)小鼠模型的研究中也得到了巨大的應(yīng)用,推動了對疾病發(fā)病的認識和治療機制的研究。近年來,尤其海馬在體雙光子鈣成像檢測技術(shù)是可以一種直接評估阿爾茨海默病病理情況的有效方法。海馬體,位于丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間,具有記憶存儲、空間定位、以及情緒調(diào)節(jié)等功能,同時也是阿爾茨海默病最先產(chǎn)生病變的地方。Busche[11]通過雙光子顯微鏡和熒光鈣指示劑對小鼠海馬體成像,發(fā)現(xiàn)小鼠皮質(zhì)和海馬體神經(jīng)元的淀粉樣蛋白依賴性異?？哼M是原發(fā)性神經(jīng)元損傷的結(jié)果,這是以前的體外分析很難做到的。該方法為研究AD 的發(fā)病機制及治療策略提供了一種理想的體內(nèi)功能測定方法[12]。

神經(jīng)元樹突在神經(jīng)元信號傳導(dǎo)過程中可以同時計算電信號和化學(xué)信號,并將信號傳向胞體,這一過程對大腦的信息處理和交流至關(guān)重要。分析神經(jīng)元樹突上的信號最常用的方法之一是成像細胞內(nèi)Ca2+濃度的動態(tài)變化[13]。雙光子顯微鏡的快速發(fā)展和熒光Ca2+指標的改進使我們能夠更好地在體外和體內(nèi)條件下研究樹突信號。Ding 等[14]利用雙光子鈣成像和細胞內(nèi)藥理學(xué)操作,在體內(nèi)同時監(jiān)測到了絨猴大腦視覺識別神經(jīng)元的胞內(nèi)電信號和來自樹突的Ca2+化學(xué)信號。Birkner 等[6]使用雙光子顯微鏡超短激光脈沖進行成像,并結(jié)合新型熒光鈣指示劑Cal-590 進行深度標記的方法,成功在小鼠皮層的神經(jīng)元群進行活體功能成像,證明了穩(wěn)定皮層的深層記錄并不局限于麻醉的動物,而在清醒的、有行為活動的老鼠中也是可行的。該方法是對傳統(tǒng)雙光子顯微鏡的成像的優(yōu)化,大大地增強了雙光子成像的穿透深度。

雙光子顯微鏡的改進及其與鈣成像技術(shù)的結(jié)合,使我們能夠利用人工合成或基因工程編碼的鈣指示劑來測量深層神經(jīng)元群的活性,在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛,極大地促進了腦科學(xué)的研究和發(fā)展。

2 深腦顯微鈣成像技術(shù)

深腦顯微鈣成像技術(shù)是一種輕量級的成像系統(tǒng),通過微型熒光顯微鏡系統(tǒng)觀察自由行為的動物大腦深處的神經(jīng)活動,并可以記錄數(shù)周內(nèi)自由移動的動物視皮層上的神經(jīng)元鈣信號,這對于理解認知功能背后的神經(jīng)編碼機制具有重要意義。微型熒光顯微鏡系統(tǒng)由微型顯微鏡主體、數(shù)據(jù)采集控制器和帶換向器的數(shù)據(jù)傳輸電纜組成。該系統(tǒng)允許在小鼠的大腦深部區(qū)域進行Ca2+成像,可以在自由移動的動物視皮層上實現(xiàn)跨越0 ～0.5 mm2區(qū)域的高速細胞成像,同時跟蹤跨越9 個小腦微區(qū)的大于200 個浦肯野神經(jīng)元Ca2+的峰值[15]。與臺式顯微鏡相比,微型顯微鏡的主要優(yōu)點是頭戴式和低成本[16]。Ghosh 等[15]首次發(fā)現(xiàn)了帶有熒光燈光源的微型顯微鏡,該顯微鏡體積小,重量輕,易于安裝在小鼠頭上,用于研究自由運動動物的復(fù)雜行為。

近年來,新興的自定義設(shè)計的GRIN 透鏡系統(tǒng),利用其折射率的內(nèi)部變化來引導(dǎo)光線從記錄點來回照射。GRIN 透鏡通常與微型頭戴顯微鏡配合使用,GRIN 鏡頭的長度大小可以定制,具有更大的視野和更寬的焦距。在與GRIN 透鏡相結(jié)合后,微型顯微鏡成像系統(tǒng)可以記錄數(shù)百個大腦深層區(qū)域的神經(jīng)元的鈣活動長達數(shù)月。這些透鏡可以用來觀察位于大腦深部區(qū)域(如下丘腦)中帶有基因標記的神經(jīng)元活動,從而大大增加了大腦監(jiān)測的神經(jīng)元的數(shù)量,有助于解碼特定行為背后的神經(jīng)表征。Zhang 等[17]在微型顯微鏡成像的基礎(chǔ)上結(jié)合GRIN透鏡系統(tǒng),成功對行為動物大腦深部神經(jīng)元進行鈣成像。該系統(tǒng)從微型顯微鏡的設(shè)計、GRIN 透鏡植入的手術(shù)過程、微型顯微鏡在小鼠頭部的安裝以及數(shù)據(jù)采集與分析進行改造。其原理是利用表達鈣離子指示劑(GCaMP6)的病毒來標記靶腦區(qū)域,在目標大腦區(qū)域上方植入一個GRIN 透鏡,在小鼠手術(shù)恢復(fù)后,將微型鏡安裝在小鼠頭部上方,最后將自由活動老鼠的神經(jīng)元活動記錄下來。Ziv 等[18]在反復(fù)探索熟悉環(huán)境的自由活動小鼠身上,使用集成顯微透鏡系統(tǒng)進行鈣成像,在數(shù)周內(nèi)跟蹤了數(shù)千個CA1 錐體細胞Ca2+動態(tài)變化。Barretto 等[19]利用復(fù)合雙透鏡梯度折射率(GRIN)微透鏡,追蹤了成年小鼠的CA1 海馬錐體神經(jīng)元樹突,發(fā)現(xiàn)這些樹突具有極高的穩(wěn)定性,而且它們的結(jié)構(gòu)改變非常罕見。Rehani 等[20]利用微型內(nèi)窺鏡成像系統(tǒng),將GRIN 透鏡植入大腦深處,成功地對自由運動小鼠紋狀體膽堿能間神經(jīng)元鈣活動進行成像,揭示了膽堿能中間神經(jīng)元神經(jīng)纖維網(wǎng)的活動模式。

Sato 等[21]開發(fā)了一種快速的雙光子變焦顯微內(nèi)窺鏡系統(tǒng),該系統(tǒng)具有GRIN 透鏡和顯微內(nèi)窺鏡,能夠以較高的掃描速度對老鼠體內(nèi)背側(cè)海馬CA1和杏仁核區(qū)域的神經(jīng)元活動進行鈣成像。通過在小鼠海馬和杏仁核中呈現(xiàn)不同的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動的多平面模式,證明了它在體內(nèi)成像中的作用。這種多焦點顯微內(nèi)窺鏡系統(tǒng)為目前的單平面深部腦成像方法增加了一個新的維度。

該系統(tǒng)提供了直接進入大腦深部目標區(qū)域的途徑。大腦皮層下的區(qū)域,如海馬、丘腦和下丘腦,甚至精細的結(jié)構(gòu),如CA1 海馬中的樹突棘,都可以成像[22],是目前對大腦中任何深度的神經(jīng)回路活動進行可靠的細胞分辨率成像最有前途的技術(shù)。因此可以用于研究腦內(nèi)的皮層動態(tài)變化和信息交流,從而闡明大腦信息編碼的神經(jīng)元機制。

3 光纖記錄技術(shù)

光纖記錄技術(shù),又稱為光纖光度檢測,是近幾年興起的一種利用光纖記錄鈣信號的方法?？梢酝ㄟ^靈活的輕型光纖傳導(dǎo)來實時監(jiān)測自由活動動物大腦深處的神經(jīng)元活性變化。因其操作簡單、方便且允許檢測特定細胞類型的神經(jīng)元活動得到了廣泛應(yīng)用[23]。當受到外界行為刺激時,神經(jīng)細胞會產(chǎn)生一系列活動導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣水平的升高,進而提高GCaMP 等熒光指示劑的熒光強度。該系統(tǒng)通過一根細的多模光纖進入大腦,然后通過同一根光纖收集發(fā)射信號。熒光通過埋植在特定腦區(qū)的光纖陶瓷插芯導(dǎo)出,光電倍增管可以靈敏的檢測其信號,并將其轉(zhuǎn)換為電信號。電信號放大濾波后,被計算機光纖記錄系統(tǒng)采集到,進一步分析研究神經(jīng)元活動和行為的相關(guān)性。因為這些光纖質(zhì)量很輕,可以彎曲,動物可以不受阻礙地移動,從而將神經(jīng)元活動與動物的特定行為聯(lián)系起來。這對于理解特定神經(jīng)元群在指揮或響應(yīng)某個動作或刺激時所扮演的角色至關(guān)重要[24]。

光纖記錄可以長時程穩(wěn)定檢測神經(jīng)元活性,Zhang 等[25]成功采用了光纖記錄技術(shù)檢測小鼠在自由運動過程中初級運動皮層和初級視覺皮層(M1和V1)第5 層的Ca2+信號。這種方法通過微量注射攜帶鈣離子濃度指示蛋白的熒光指示劑(常用GCaMP 熒光指示劑)到特定腦區(qū),利用指示劑的熒光強度變化將神經(jīng)元中鈣離子的濃度變化表現(xiàn)出來,通?？梢詸z測到腦區(qū)神經(jīng)元鈣活動的范圍大約300 ～500 μm。Stroh 等[26]同樣應(yīng)用光纖記錄技術(shù)證明了視覺誘發(fā)刺激產(chǎn)生的Ca2+波首先發(fā)生在視覺皮層。Cui 等[27]設(shè)計了一套光纖系統(tǒng)來測量熒光生物傳感器在自由活動的小鼠大腦深部結(jié)構(gòu)中表達的強度、發(fā)射光譜和壽命,當與鈣依賴選擇性表達基因編碼的鈣離子指示劑(GECIs)相結(jié)合時,該系統(tǒng)可用于測量執(zhí)行復(fù)雜行為任務(wù)的小鼠特定細胞群的平均神經(jīng)活動,并記錄了執(zhí)行杠桿壓迫操作任務(wù)的小鼠中與鈣峰值相關(guān)的熒光變化。大腦梨狀皮層是重要的嗅覺中樞,主要參與嗅覺信息的學(xué)習(xí)和編碼,并接受強烈的5-羥色胺能(5-HT)神經(jīng)支配,但梨狀皮層如何受5-HT 的調(diào)節(jié)在很大程度上仍是未知的。Wang 等[28]利用鈣光纖光度檢測技術(shù)和光遺傳學(xué)技術(shù)研究了5-HT 如何影響前梨狀皮層(the anterior piriform cortex,aPC)錐體神經(jīng)元的活性,發(fā)現(xiàn)了5-HT 通過5-HT2C受體、磷脂酶C 和鈣激活鉀(BK)通道直接降低錐體神經(jīng)元的興奮性。此外,內(nèi)源性血清素能減弱aPC 錐體神經(jīng)元中氣味引起的鈣反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)確定了aPC 的5-羥色胺能的調(diào)節(jié)機制,并闡明了其潛在作用。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)多巴胺能神經(jīng)元在高度覺醒的各種依賴行為中起著關(guān)鍵作用,然而,VTA 多巴胺能神經(jīng)元在覺醒調(diào)節(jié)中的作用尚未被完全了解。Eban 等[29]使用光纖光度檢測技術(shù)記錄了自由活動小鼠的鈣活性,發(fā)現(xiàn)了VTA 多巴胺能神經(jīng)元的不同投射對覺醒有不同的調(diào)節(jié)作用,揭示了VTA 多巴胺能回路在維持清醒狀態(tài)和與動物行為學(xué)相關(guān)的睡眠相關(guān)行為中的基本作用。

光纖質(zhì)量很輕,高度靈活,不需要對動物進行固定,而且直徑相對較小是收集深層腦組織熒光信號的極佳選擇。該技術(shù)不僅適用于同一動物大腦不同區(qū)域神經(jīng)元活動的記錄,也適用于不同模型動物的記錄。因此,可以廣泛應(yīng)用于自由運動的模型動物的行為學(xué)研究。

4 鈣離子熒光指示劑的發(fā)展與應(yīng)用

近年來,鈣成像技術(shù)在研究在體神經(jīng)元方面變得越來越重要,而鈣離子熒光指示劑的發(fā)展與應(yīng)用起到了巨大的推動作用。帶有熒光示蹤劑的鈣成像技術(shù)為監(jiān)測神經(jīng)元動作電位提供了一種光學(xué)方法。目前普遍作為微電極記錄的補充,來測量神經(jīng)元在體內(nèi)的活動,這種方法為小型模型動物大腦神經(jīng)元群活動的重建開辟了道路。

最早用于監(jiān)測細胞鈣信號動力學(xué)的鈣指示劑是生物熒光鈣結(jié)合光蛋白。隨著技術(shù)的發(fā)展,更加靈敏和通用的鈣熒光指示劑被發(fā)現(xiàn),鈣離子的結(jié)合引起分子構(gòu)象的變化,從而導(dǎo)致熒光的強度變化。第一代鈣熒光指示劑由Indo-1,Fura-2,Quin-2,和Fluo-3 等組成。其中,Fura-2 是當時比較常用的一種鈣螯合劑與熒光團的結(jié)合物,其發(fā)射的熒光強度隨鈣離子濃度的變化而變化,可以達到較高的空間分辨率[30]。但因其時間分辨率較低,組織分布不均勻等缺點逐漸被代替。現(xiàn)在最廣泛使用的熒光指示劑是GCaMP,它是一種新型基因編碼的鈣離子指示劑(GECIs),含有一種綠色熒光蛋白(GFP),可以與鈣調(diào)蛋白和一種來自平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶(RS20)的肽融合。鈣離子誘導(dǎo)鈣調(diào)蛋白與RS20 結(jié)合,增加其結(jié)合的GFP 分子的熒光[31]。由于細胞內(nèi)的鈣水平會隨著動作電位的激發(fā)而升高,導(dǎo)致鈣自然流入細胞,當細胞內(nèi)有足夠的鈣時,鈣與鈣指示劑結(jié)合不到一秒鐘,就能改變連接兩個結(jié)構(gòu)域的GFP 蛋白的構(gòu)象,從而誘導(dǎo)熒光增強[32]。因此可以作為一種測量鈣信號的指標。Chen 等[33]利用慢病毒(AAV)將GCaMP 變異基因?qū)胄∈笠曈X皮層神經(jīng)元,通過體內(nèi)成像檢測到了單個樹突棘神經(jīng)細胞內(nèi)的鈣瞬變。隨著基因編碼的鈣指示劑(GECIs)光學(xué)技術(shù)的最新進展,已經(jīng)有可能將這些熒光指示劑表達到特定的神經(jīng)元亞群中,并監(jiān)測這些神經(jīng)元的熒光變化,可以實現(xiàn)體內(nèi)實時監(jiān)控的細胞和分子活動[34]。所以,這是用于研究腦皮層神經(jīng)元的一種非常好的記錄方法。

5 總結(jié)

不同的生物學(xué)問題將決定選擇不同的研究方法,各種方法最終將相互補充,共同揭示動物行為的神經(jīng)機制。雙光子鈣成像技術(shù)可以特異性記錄大量神經(jīng)元,但僅限于麻醉或頭部受限的小鼠皮層淺層區(qū)域[35-36],并且在頭部固定下,一定的束縛會對研究造成影響。基于GRIN 透鏡系統(tǒng)的微型顯微鏡對動物運動的限制比較小,且能在腦區(qū)深部進行成像,是一種解決雙光子成像問題比較好的方法。但由于成像裝置價格昂貴,手術(shù)難度較大[15,18],并且植入的GRIN 透鏡直徑較大(通?！? mm),可能會造成嚴重的組織損傷,組織損傷預(yù)計是探頭直徑的二次函數(shù),因此,即使成像探頭的直徑稍微減小,也可能會導(dǎo)致組織損傷[27]。目前基于光纖的鈣信號檢測技術(shù)隨著鈣熒光指示劑的發(fā)展日趨成熟,但由于其空間分辨率效果差,信號不特異,不能反映單個神經(jīng)元活性,記錄過程中形成的光漂白和光毒性比較大等缺點,使其應(yīng)用受到一定限制。

6 前景

未來幾年,另一個重要的領(lǐng)域很可能會大力擴展,那就是在清醒、行為正常的動物身上,對特定類型的皮層神經(jīng)元進行鈣成像。這些研究將不會局限于大鼠,但很可能會擴展到其他模型,如雪貂,貓,尤其是靈長類動物。一個影響越來越大的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑹窃诟鞣N神經(jīng)元疾病研究中使用鈣成像技術(shù)來詳細分析疾病的生物學(xué)機制[37]。期待著鈣成像技術(shù)的進一步發(fā)展,相信未來3D 成像和用于自由移動動物的微型化設(shè)備的設(shè)計將成為可能。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,鈣信號檢測技術(shù)日新月異,極大地促進了神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)與功能的研究和發(fā)展,在神經(jīng)系統(tǒng)乃至神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中有更加深入的應(yīng)用。