蔡江帆陳民利

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310053; 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所,杭州 310053)

隨著全球代謝綜合征患病率的不斷上升,非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患病人數(shù)急劇增加,已是全球最常見的肝疾病(占總?cè)丝诘?0%)[1],包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及其相關(guān)肝硬化、肝癌等,其中,近40%的NAFLD 患者可發(fā)展為更嚴(yán)重的NASH[2]。NASH 是一類具有炎癥細(xì)胞浸潤和壞死的嚴(yán)重肝病,是非酒精性脂肪肝病向更嚴(yán)重肝病發(fā)展的一個(gè)重要的過渡階段,其特征在于肝細(xì)胞氣球樣變和炎癥,并且可以發(fā)展為纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌和肝衰竭[3]。NASH 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,最初是通過“兩次打擊”假設(shè)來解釋從脂肪變性到NASH 的逐步轉(zhuǎn)變[4],首次打擊引發(fā)脂肪變性,隨后第二次打擊導(dǎo)致炎癥,肝細(xì)胞損傷和纖維化。然而,NASH 中脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)的發(fā)生順序及因果關(guān)系目前尚不明確。后來又有研究提出了一種改進(jìn)的“多次打擊”理論[5],表明NASH 是多種并行條件作用的結(jié)果,包括遺傳易感性,脂質(zhì)代謝異常,氧化應(yīng)激,脂毒性,線粒體功能障礙,細(xì)胞因子和脂肪因子的改變,腸道生態(tài)失調(diào)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[6-8]。由此可見,NASH 是一個(gè)復(fù)雜的、受多因素影響的疾病。

目前對NASH 的治療策略可大致分為針對驅(qū)動疾病發(fā)病機(jī)理的代謝紊亂(例如胰島素抵抗和脂肪生成)和針對疾病發(fā)生的生理表現(xiàn)(包括細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥和纖維化)的藥物[9]。但至今針對NASH 適應(yīng)癥的藥物均尚未獲得批準(zhǔn),大多數(shù)藥物還處于開發(fā)階段。因此,將NASH 歸類為治療需求未得到滿足的醫(yī)學(xué)病癥,究其原因除發(fā)病機(jī)制不清,病因復(fù)雜外,理想化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娜狈σ彩瞧渲械脑蛑弧，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)性模型大多都不能夠很好的模擬人類NASH 疾病的發(fā)生、發(fā)展以及嚴(yán)重程度,大多數(shù)模型不形成脂肪肝炎,嚴(yán)格意義上存在肝細(xì)胞氣球樣病變卻不存在Mallory 小體和伴隨炎癥的大泡性脂肪變性[10]。本文就近年來的NASH動物模型進(jìn)行了綜述并深入分析其優(yōu)缺點(diǎn),為研究者對NASH 模型的選擇和應(yīng)用提供參考。

1 膳食動物模型

許多疾病都受到飲食因素的調(diào)節(jié),包括NASH、代謝綜合征和癌癥等[11]。飲食因素在NASH 膳食動物模型中也起著至關(guān)重要的作用,這些模型主要利用蛋氨酸和膽堿缺乏、高脂、高糖、高膽固醇、膽酸鹽、果糖、高碳水化合物等多種飲食因素來制備。這些飲食條件可以單獨(dú)使用或可多個(gè)協(xié)同作用,以誘導(dǎo)嚴(yán)重程度較低的脂肪變性和脂肪性肝炎。在NASH 的基因修飾動物模型中,膳食干預(yù)也被用作誘導(dǎo)更嚴(yán)重程度的病癥的方法[12],以更好地復(fù)制人類NASH 病癥。

1.1 蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine-choline deficient,MCD)飲食模型

蛋氨酸和膽堿的缺乏對于肝β 氧化和極低密度脂蛋白(VLDL)的合成至關(guān)重要[13]。MCD 模型是在高糖高脂(10%的脂肪和40%的蔗糖)的基礎(chǔ)上缺乏蛋氨酸和膽堿的飲食誘導(dǎo)的。該模型的特點(diǎn)是肝細(xì)胞脂質(zhì)積累和VLDL 合成減少,并伴隨著肝脂肪變性、氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞因子和脂肪細(xì)胞因子的改變[14]。

小鼠通常是MCD 模型的首選動物,雌性C57BL6/J 小鼠飼喂MCD 飲食后,血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平持續(xù)升高,飼喂第10 天發(fā)生脂肪性肝炎[15]。MCD 飲食干預(yù)雄性C57BL6 小鼠6周即可出現(xiàn)明顯的纖維化[16]。飼喂MCD 的嚙齒動物的NASH 嚴(yán)重程度還可能取決于動物的種類,性別和品系[17]。研究中發(fā)現(xiàn),MCD 小鼠模型非酒精性脂肪肝炎(NASH)發(fā)生的同時(shí),NOD 樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體激活,NLRP3 選擇性抑制劑的使用可以顯著減緩肝纖維化進(jìn)展[14],這提示了靶向NLRP3 是NASH 藥物治療的一條途徑。此外,還研究發(fā)現(xiàn)該模型肝浸潤的Th17 細(xì)胞對NASH 向纖維化的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要,Th22 細(xì)胞在NASH 發(fā)展過程中具有保護(hù)作用[18]。

MCD 飲食模型的優(yōu)勢在于較好地復(fù)制了人類嚴(yán)重NASH 的病理表現(xiàn),其炎癥、纖維化和肝細(xì)胞凋亡發(fā)展得快且嚴(yán)重,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激也活躍[19],因此,常用于NASH 的組織學(xué)進(jìn)展及其炎癥和纖維化機(jī)制研究。然而,MCD 模型不肥胖,反而體重減輕,且無胰島素抵抗,血清胰島素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯等水平降低[20-21]。與人類NASH 的代謝狀況存在差異。為改善上述不足,通常將MCD 飲食飼喂基因修飾小鼠,以更好地模擬人類NASH 的臨床表現(xiàn),如喂食MCD 飲食的DB/DB小鼠顯示出明顯的肝炎和纖維化[12]。

1.2 高脂飲食(high-fat diet,HFD)模型

營養(yǎng)過剩和久坐的生活方式是NASH 的一個(gè)重要病因,它會引起體重增加,最終導(dǎo)致肥胖。高脂飲食模型模擬有害飲食生活習(xí)慣來復(fù)制疾病的病因。此類模型給動物喂食高脂飲食,其中熱量攝入的45%～75%來自脂肪或含有反式脂肪或膽固醇的變體,最終促使動物表現(xiàn)為肥胖,胰島素抵抗和肝損傷。

在HFD 模型中,常用的動物是大小鼠。Lieber等[22]用HFD 飲食(71%的脂肪、11%的碳水化合物和18%的蛋白質(zhì))飼喂SD 大鼠,3周后大鼠出現(xiàn)類似于人類NASH 的生化改變以及胰島素抵抗、肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積、氧化應(yīng)激等,肝組織輕度炎癥和輕度微泡型脂肪變性,但不存在纖維化進(jìn)展。改良飲食成分可加重NASH 病癥的嚴(yán)重程度,如在飼料中添加豬油和膽固醇,可促使SD 大鼠在第4周發(fā)生肝脂肪變性,8周后血清甘油三酯、膽固醇和TNF-α 水平的明顯升高,12周以后出現(xiàn)炎癥,直到第24周時(shí)出現(xiàn)明顯的肝竇纖維化[23]。Ito 等[24]采用含60%豬油的高脂飲食飼養(yǎng)C57BL6 小鼠,50周后發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)肥胖、肝多灶性炎癥細(xì)胞浸潤,同時(shí)出現(xiàn)輕度的竇周纖維化并伴有胰島素抵抗。此類模型有著典型的人類NASH 表型如肥胖、代謝綜合征等,一般用于評價(jià)針對NASH 有潛在療效藥物的藥效特點(diǎn)或用于研究脂肪變性致病機(jī)理。Challa 等[25]確定凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)作為NASH 和纖維化形成的抑制劑,發(fā)現(xiàn)了肝特異性ASK1 過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠可以免受高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性,表明ASK1 對于NASH 的形成具有保護(hù)作用。

HFD 模型表現(xiàn)出類似于人類NASH 的生化改變,在組織病理學(xué)上也出現(xiàn)了炎癥,但缺乏進(jìn)行性纖維化。相比于MCD 模型,高脂飲食模型的肝病變程度與并不嚴(yán)重,并且它的造模時(shí)間也相對較長?？梢詢?yōu)化飼料成分,在不嚴(yán)重影響營養(yǎng)平衡的前提下,適當(dāng)增加其他飲食因素,來放大NASH 病癥的嚴(yán)重程度以及觸發(fā)纖維化效應(yīng)。

1.3 高膽固醇和高膽酸鹽(high-cholesterol and high-cholate,HChCh)模型

飲食中的膽固醇是脂肪性肝炎疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵因素[26-27]。高膽固醇飲食可引起膠原基因表達(dá)增強(qiáng),刺激肝產(chǎn)生TNF-α,增強(qiáng)炎癥反應(yīng)并促使NASH 的進(jìn)展[28]。高膽固醇高膽酸鹽模型是在高脂基礎(chǔ)上額外添加膽固醇及膽酸鹽誘發(fā)的。該模型的常用動物是小鼠,HChCh 飲食喂養(yǎng)C57Bl/6J小鼠24周,期間出現(xiàn)肝脂肪變性,炎癥和纖維化的進(jìn)行性形成。HChCh 飲食中利用可可脂添加60%的脂肪可加速這些組織病理學(xué)改變的發(fā)展[29]。近年來金黃地鼠的使用也越來越多,金黃地鼠具有和人相似的脂蛋白代謝,能模擬人類的血脂異常。采用改進(jìn)的高脂高膽固醇飼料(40.8%的脂肪、14.8%的蛋白質(zhì)、44.4%的碳水化合物和0.5%的膽固醇)和含有10%果糖的飲用水喂養(yǎng)金黃地鼠,20周后出現(xiàn)胰島素抵抗、血脂異常和NASH 相關(guān)的病理特征(微囊性脂肪變性、炎癥、肝細(xì)胞膨脹和肝竇周圍橋接纖維化)[30]。在發(fā)病機(jī)制的研究中,發(fā)現(xiàn)電負(fù)性低密度脂蛋白LDL(-)是高脂高膽固醇誘導(dǎo)金黃地鼠模型肝炎形成的根本原因之一,LDL(-)是氧化的LDL(ox-LDL)的一種生理形態(tài),其具有炎癥特性并能夠誘導(dǎo)庫普弗細(xì)胞(kupffer cell)中的TNF-α分泌[31],這提示LDL(-)在NASH 的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

HChCh 飲食的小鼠模型模擬了人類NASH 的進(jìn)行性發(fā)展過程,出現(xiàn)肝胰島素抵抗,卻存在體重減輕、附睪脂肪減少、血漿甘油三酯水平降低等與人類NASH 特征相反的臨床表現(xiàn)[29]。金黃地鼠模型能很快誘導(dǎo)出血脂異常和肝脂肪變性,但仍需要較長的誘導(dǎo)時(shí)間才能出現(xiàn)脂肪肝炎,且未發(fā)生大泡性脂肪變性。因此,需要調(diào)整高脂高膽固醇的組成或使用飼料添加劑促進(jìn)病程的發(fā)展,增加與人類NASH 的相似度。

1.4 果糖及高碳水化合物模型

人的果糖消耗水平與肝脂肪變性和纖維化的嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)[32-33]。果糖是肝葡萄糖攝取和糖原合成的調(diào)節(jié)劑,會干擾葡萄糖代謝,過量的果糖攝入會導(dǎo)致甘油三酯水平的升高,肝中脂肪的增生并影響了糖原異生,從而引起脂肪變性[34-36]。高碳水化合物飲食模型是用高脂飼料飼喂動物,并在飲用水或飼料中添加了果糖或者其他碳水化合物,以誘導(dǎo)更加嚴(yán)重的NASH 病癥。

小鼠是該模型最常用的動物,C57BL6 小鼠飼喂高脂高碳水化合物飲食并提供含5%果糖的飲用水,16周后形成肥胖并伴有明顯的纖維化[37]。此外沙鼠近年來常用于NASH 和肥胖癥模型,沙鼠具有與人類NASH 相似的生化改變以及病理學(xué)特征[38]。高脂高碳水誘導(dǎo)的沙鼠NASH 模型表現(xiàn)為代謝異常和肝損傷并伴隨著大泡性脂肪變性[39]。此類模型的最大的特點(diǎn)之一是纖維化程度較明顯,常常應(yīng)用于抗纖維化藥物的開發(fā)。Carino 等[40]發(fā)現(xiàn)了一種非膽汁酸、G 蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)和法呢醇x 受體(FXR)的雙重激動劑BAR502,能逆轉(zhuǎn)高脂飲食和果糖飲水的小鼠的脂肪性肝炎,可通過促進(jìn)脂肪組織褐變來治療肝損傷。Du 等[41]利用Cxcr3-(趨化因子受體3)敲除的小鼠和C57BL/6 野生型小鼠建立高脂高碳水飲食模型,研究發(fā)現(xiàn)CXCR3 敲除的小鼠肝組織學(xué)改善,壞死及炎癥程度均較輕,脂質(zhì)過氧化水平低,提示CXCR3 在NASH發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用,這將成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

高脂高碳水化合物模型形成機(jī)制與長期不良飲食習(xí)慣導(dǎo)致的脂肪肝十分相似,且造模簡便,細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重,后期可見明顯的纖維化,但其不足之處是炎癥反應(yīng)輕微,無胰島素抵抗,故這類模型常用于抗纖維化藥物篩選,而不適用于發(fā)病機(jī)制研究。此外,單純的果糖飲食是無法誘導(dǎo)NASH 形成的。因此,除果糖外,需聯(lián)合使用高脂或高膽固醇等飲食因素或者添加其它因素,才可誘導(dǎo)出與人類NASH 具有更高相似性的模型。

2 基因修飾動物模型

隨著基因工程的進(jìn)步,通過改變可能參與脂肪肝形成的特定基因來建立各種實(shí)驗(yàn)嚙齒動物模型。這些特定基因的改變在不同的途徑中發(fā)揮著不同的作用,但他們的共同之處都表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪沉積。這些模型主要涉及的基因包括糖尿病基因(DB)、瘦素基因(OB)、Alms1 基因、SREBP-1c 等,對于研究特定的致病途徑有著特別的價(jià)值?；蛐揎梽游锬Ｐ涂烧T導(dǎo)出與人NASH 相似的生化改變,但常需要添加其他飲食因素來聯(lián)合誘導(dǎo)與人類相似度更高的NASH。

2.1 DB/DB 小鼠和OB/OB 小鼠

DB/DB小鼠是常染色體隱性糖尿病基因(DB)的純合子小鼠。DB基因編碼瘦素受體的點(diǎn)突變,導(dǎo)致瘦素信號傳導(dǎo)受阻[42]。因此,DB/DB小鼠的瘦素水平高,且對瘦素的作用具有抗性。DB/DB小鼠的臨床表現(xiàn)為肥胖、胰島素抵抗或糖尿病,但不會自發(fā)形成NASH 或肝纖維化[43],因此,需要在高脂飲食或MCD 飲食等繼發(fā)性誘導(dǎo)的刺激后發(fā)生NASH,并出現(xiàn)明顯的肝炎癥和纖維化[12,44]。OB/OB小鼠是瘦素基因發(fā)生突變,瘦素合成受阻,從而導(dǎo)致瘦素缺乏。OB/OB小鼠的臨床表現(xiàn)為極度肥胖和胰島素抵抗,患有高血糖和高胰島素血癥[45],可發(fā)生自發(fā)性肝脂肪變性,但不發(fā)生脂肪性肝炎。第二次打擊例如MCD 飲食、高脂飲食或小劑量的脂多糖內(nèi)毒素、 乙醇等刺激下可引發(fā) NASH發(fā)生[46-47]。

這兩種模型能夠較好地復(fù)制人類NASH 表型,應(yīng)用十分廣泛。MCD 飲食會導(dǎo)致DB/DB小鼠的S-腺苷甲硫氨酸(SAME)消耗,而相同飲食的野生型小鼠的肝SAME 水平不受影響。SAME 對肝健康具有多效性作用,SAME 耗竭一般與多種肝損傷有關(guān)。因此,SAME 耗竭可能是NASH 發(fā)展的一條重要途徑[44]。在OB/OB小鼠的研究中,用FXR 激動劑INT-767 和奧貝膽酸,分別干預(yù)使用飼喂高脂飲食的OB/OB小鼠,INT-767 表現(xiàn)出了較好的療效,其作用可能是激活肝(而非回腸)的FXR 功能來實(shí)現(xiàn)病癥的好轉(zhuǎn)[48],體現(xiàn)了OB/OB小鼠在FXR 靶點(diǎn)藥物評價(jià)的應(yīng)用價(jià)值。

DB/DB和OB/OB小鼠模型雖可復(fù)制人類NASH 特征,但若沒有飲食或化學(xué)等因素刺激,也只能形成肝脂肪變性,只有在MCD 飲食等因素的繼發(fā)性刺激誘導(dǎo)下,才可出現(xiàn)炎癥和纖維化。此外,自然情況下,由肥胖基因突變引起的先天性瘦素缺乏或瘦素抵抗性在人類極為罕見[49],因此,DB/DB和OB/OB小鼠模型在模擬NASH 疾病的病因方面存在較大的不足。值得注意的一點(diǎn)是OB/OB小鼠自身缺乏瘦素,而肝纖維化發(fā)展需要瘦素,因此,OB/OB小鼠對肝纖維化具有抵抗力[50]。

2.2 Foz/Foz 小鼠

Foz/Foz小鼠具有一個(gè)突變的Alms1 基因,該基因編碼一種在初級纖毛基體中的蛋白質(zhì),可在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和食欲調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[51-52]。Foz/Foz小鼠可自發(fā)肥胖、胰島素抵抗,食欲亢進(jìn)、脂聯(lián)素水平低、高膽固醇血癥和脂肪變性等代謝綜合癥。當(dāng)Foz/Foz小鼠飼喂高脂飲食后可導(dǎo)致代謝綜合癥加重,脂聯(lián)素水平進(jìn)一步降低,膽固醇水平進(jìn)一步升高,促進(jìn)了病癥向嚴(yán)重的纖維化發(fā)展[53]。相比于其他的基因修飾動物模型,Foz/Foz小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的脂質(zhì)沉積情況,因此,Foz/Foz小鼠在降脂類藥物的研究中正變得越來越重要。依澤替米貝/他汀類藥物聯(lián)合治療高脂飲食飼喂的Foz/Foz小鼠,通過抑制應(yīng)激激活的c-jun N-末端激酶(JNK)激活以及肝細(xì)胞損傷/凋亡,從而逆轉(zhuǎn)NASH 和肝纖維化[54],這表明了該模型在JNK 靶點(diǎn)上的重要研究價(jià)值。盡管Foz/Foz小鼠有著較好NASH 表型,然而這些特征僅在特定背景的品系中發(fā)現(xiàn),例如C57BL6/J 背景的Foz/Foz小鼠中可觀察到IR、高胰島素血癥以及肝纖維化,但在BALB/c 背景的Foz/Foz小鼠中卻很少出現(xiàn)[55]。而且Foz/Foz小鼠模型仍不能自發(fā)地脂肪性肝炎,僅僅是自發(fā)形成脂肪變性,還需要受到飲食或化學(xué)因素的刺激,才可以發(fā)展成脂肪性肝炎或更嚴(yán)重的病癥。

2.3 SREBP-1c 轉(zhuǎn)基因小鼠

在哺乳動物中, 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)的轉(zhuǎn)錄因子家族介導(dǎo)的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和脂肪酸水平。SREBP-1c 轉(zhuǎn)基因小鼠因轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c 過表達(dá),引起脂肪細(xì)胞分泌失調(diào)導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病,小鼠肝脂質(zhì)積累明顯,但體內(nèi)脂肪組織減少[56]。標(biāo)準(zhǔn)飲食飼喂SREBP-1c 轉(zhuǎn)基因小鼠,在10周齡時(shí)就發(fā)生脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥,20周齡時(shí)發(fā)現(xiàn)小葉內(nèi)間隙有明顯的細(xì)胞間纖維化[57]。將SREBP-1c 轉(zhuǎn)基因小鼠的TNF 基因敲除,TNF 基因敲除后改善了SREBP-1c 轉(zhuǎn)基因小鼠的葡萄糖耐量,并顯著降低了肝脂肪變性和纖維化,這表明了TNF-α在NAFLD 的發(fā)展和向NASH 的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[58]。由于人類NASH 患者的臨床表現(xiàn)有內(nèi)臟脂肪增加,而SREBP-1c 轉(zhuǎn)基因小鼠僅在肝中產(chǎn)生脂質(zhì)沉積。因此,該模型盡管具有令人滿意的病理特征,但與人類NASH 的臨床表現(xiàn)仍存在較大的差異。

3 藥物誘導(dǎo)模型

藥物誘導(dǎo)模型是利用化學(xué)毒素侵染肝細(xì)胞,進(jìn)入細(xì)胞后被代謝,產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物從而來引起肝損傷,持續(xù)性的損傷進(jìn)而形成NASH?；瘜W(xué)誘導(dǎo)的實(shí)質(zhì)性肝損傷和纖維化模型常用于研究肝纖維化進(jìn)展機(jī)制,這些模型中的纖維化最終可發(fā)展為肝硬化和肝癌,發(fā)病率很高。目前典型的肝靶向化學(xué)毒素有四氯化碳(CCl4)、硫代乙酰胺(TAA)和鏈脲佐菌素(STZ)等。藥物誘導(dǎo)模型與營養(yǎng)缺乏的MCD模型相似,均會導(dǎo)致動物體重減輕,在模擬病因方面還是存在不足,此外藥物誘導(dǎo)模型造模時(shí)不同的動物對于劑量的敏感程度不同,若是盲目模仿其他實(shí)驗(yàn)的劑量,常常會引起高死亡率或者低成功率。建議在正式實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),摸索造模的條件。

3.1 四氯化碳(CCl4)

CCl4是用于誘導(dǎo)動物肝纖維化肝硬化的最經(jīng)典和最廣泛的毒素之一。肝細(xì)胞吸收并代謝CCl4,引起氧化酶激活,產(chǎn)生三氯甲基自由基,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,引起肝細(xì)胞凋亡以及肝星狀細(xì)胞的過度活化和增殖[59-60]。傳統(tǒng)方法常用CCl4腹腔注射構(gòu)建肝纖維化模型。楊開選等[61]用40% CCl4腹腔注射Wistar 大鼠,6周后出現(xiàn)肝纖維化,第8周出現(xiàn)肝硬化。劉甦蘇等[62]研究發(fā)現(xiàn)高劑量CCl4使小鼠死亡率偏高,并發(fā)現(xiàn)C57BL/6 小鼠注射10% CCl4(10 μL/g),8周能夠明顯地誘導(dǎo)肝纖維化形成,且死亡率相對較低。當(dāng)同時(shí)添加鐵元素?cái)z入時(shí),則有助于加速注射CCl4后的動物的肝硬化進(jìn)展[63]。

CCl4模型是最常用的急性肝損傷模型,有著快速成模的特點(diǎn),在抗炎抗氧化類的NASH 藥物研究中的應(yīng)用最廣泛。Gan 等[64]用20% CCl4構(gòu)建SD大鼠纖維化模型,并用熊果酸干預(yù),結(jié)果表明該藥物通過減少NADPH 氧化酶(NOXs) 和活性氧(ROS)的表達(dá)來抑制NOX 介導(dǎo)的纖維化信號通路的激活,從而緩解了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化,這將成為抗纖維化治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。在研究哌拉西林鈉對CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn),該藥物通過抑制氧化應(yīng)激來減輕CCl4對大鼠肝造成的損傷[65]。王玨等[66]在研究黃芪總皂苷對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn),芪總皂苷可能與減輕肝細(xì)胞凋亡,抑制炎癥因子釋放有關(guān)。

3.2 硫代乙酰胺(TAA)

TAA 是一種肝毒物,在肝細(xì)胞中被氧化并產(chǎn)生反應(yīng)性的硫及其氧化物,這些反應(yīng)性的硫及其氧化物與氨基和氨基蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng),這可能是TAA 引起肝毒性的原因[67]。對雄性F344 大鼠每周兩次腹腔注射TAA 并持續(xù)20周,動物出現(xiàn)進(jìn)行性肝硬化,且伴隨著持續(xù)性肝細(xì)胞損傷,單核細(xì)胞發(fā)炎和橋接纖維化[68]。魯智文等[69]給C57/BL6 小鼠以150 mg/kg 的劑量腹腔注射濃度為15 mg/mL 的TAA,每周3 次連續(xù)8周,小鼠第3周開始出現(xiàn)纖維組織增生,在第4周假小葉開始形成,第8周時(shí)假小葉最為明顯。

TAA 模型是常用的肝纖維化模型,主要用于抗纖維化藥物的評價(jià)。Mi 等[70]通過麥芽酚干預(yù)TAA誘導(dǎo)的小鼠模型,可抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化并通過TGF-β1 介導(dǎo)的PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)活化的HSC 的凋亡來減輕實(shí)驗(yàn)性肝纖維化。這與在大鼠中的研究結(jié)果也類似,覃仁武等[71]研究苦參堿對TAA 誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的保護(hù)作用,苦參堿可抑制活化的HSC,保護(hù)肝細(xì)胞,改善肝功能,從而抑制TAA 誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。

3.3 鏈脲佐菌素(STZ)

STZ 對胰腺β 細(xì)胞具有毒性,導(dǎo)致胰島素合成受阻,但STZ 也可能具有直接的肝毒性作用[72]。Qiang 等[73]用高脂飼料飼喂SD 大鼠,4周后以30 mg/kg 的劑量腹腔注射STZ,并持續(xù)高脂飼料飼喂16周后出現(xiàn)嚴(yán)重的肝脂肪變性,纖維間隔形成假小葉。Fujii 等[74]給C57BL/6J 的新生幼鼠皮下注射STZ 后,從4周齡開始喂高脂飼料,6周齡時(shí)發(fā)生單純性脂肪變性,8周齡時(shí)引起炎癥和球囊擴(kuò)張,在8～12周時(shí)開始出現(xiàn)進(jìn)行性纖維化,最終雄性小鼠幾乎全部發(fā)展為肝癌。

STZ 誘導(dǎo)的NASH 模型由于胰島β 細(xì)胞受損,所以表現(xiàn)為高血糖,此類模型常常用在降糖抗氧化類的藥物研究中。Qiang 等[75]利用丹酚酸A(SalA)干預(yù)STZ 誘導(dǎo)的肝纖維化SD 大鼠模型,發(fā)現(xiàn)肝中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達(dá)顯著下調(diào),并改善了肝線粒體呼吸功能,減少了肝細(xì)胞的凋亡。表明了SalA 抗纖維化潛在機(jī)制涉及減少氧化應(yīng)激、抑制α-SMA 和TGFβ1 表達(dá)以及發(fā)揮抗凋亡和線粒體保護(hù)作用。同樣,方舒等[76]用Exendin-4 治療STZ 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型,也發(fā)現(xiàn)Exendin-4 可通過激活Nrf2/HO-1 抗氧化途徑改善小鼠的肝纖維化和氧化應(yīng)激。說明Nrf2/HO-1 抗氧化途徑在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)與展望

NASH 的發(fā)病機(jī)制是多因素的[5],理想的NASH 模型應(yīng)該能最大程度地模擬疾病發(fā)展的過程,同時(shí)也是可重復(fù)的和穩(wěn)定性好的。傳統(tǒng)的單一模型雖然可能很好地模擬出NASH 某些典型特征,但都具有局限性[77],有的只復(fù)制了其組織病理學(xué),有的只復(fù)制了疾病的生理特性。在單因素持續(xù)刺激作用下所誘導(dǎo)的模型并不能囊括人疾病發(fā)展的全部過程[78]。目前的模型都不滿足理想模型的所有要求。當(dāng)前NASH 的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头N類繁多但各有優(yōu)缺點(diǎn),研究者應(yīng)該根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x取代表性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

隨著全球NASH 疾病的盛行以及抗NASH 藥物的匱乏[79],使得建立一種合適理想化的NASH 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ推仍诿冀?。為了能夠研究出更完善的非酒精性脂肪性肝炎模?基于NASH 疾病的多因素誘導(dǎo)考慮提出以下幾方面的建議:

(1)高脂飲食被認(rèn)為是研究脂肪變性向NASH進(jìn)展的最佳模型之一,絕大多數(shù)的膳食動物模型均以高脂飲食為基礎(chǔ),通過改良營養(yǎng)飼料配比構(gòu)建NASH 模型,但都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)。因此在不改變營養(yǎng)平衡的前提下,適當(dāng)增加多種其他飲食因素,可加重NASH 的病理進(jìn)展。

(2)利用多種造模因素的結(jié)合包括飲食、藥物和遺傳因素,即將飲食因素結(jié)合基因修飾動物或藥物誘導(dǎo)因素聯(lián)合使用[12,73],研究出能夠全面展現(xiàn)非酒精性脂肪性肝炎特征的模型。

(3)深入對非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)基因的認(rèn)識,以培育出更多特殊的基因修飾動物,如DB/DB小鼠和OB/OB小鼠等[42,45];同時(shí),尋找如沙鼠、金黃地鼠等與人類脂代謝相似的新品系或新物種作為NASH 研究的實(shí)驗(yàn)動物[30,38]。

相信隨著對疾病認(rèn)識的不斷深入,一定能研究出涵蓋人類整個(gè)疾病歷程的理想NASH 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?用于致病機(jī)制的研究以及抗病藥物的研發(fā)。