韓佳慧， 劉唐娟， 羅 勁， 溫中薇， 黃海珠， 張 珂， 蔣玉婷， 陳一強(qiáng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，越來越多的醫(yī)療器械和人造器官等植入物用于治療各種疾病，據(jù)報(bào)道，絕大多數(shù)的醫(yī)療器械或人造器官會(huì)導(dǎo)致生物膜相關(guān)的感染，包括導(dǎo)尿管、假牙、人工心臟瓣膜和假肢等[1]。生物膜的形成最初被認(rèn)為是微生物的一種神秘行為，是微生物主要的生活方式?，F(xiàn)定義為一個(gè)相互作用的微生物群落，緊密地、不可逆地錨定在一個(gè)表面，并嵌入到由胞外聚合物(EPS)組成的基質(zhì)中[2-3]。通常治療濃度下的抗生素?zé)o法根除生物膜結(jié)構(gòu)深處的細(xì)菌/真菌，針對(duì)生物膜的抗生素療法一般療程長(zhǎng)、劑量高，過度使用抗生素將引起抗生素耐藥性的傳播，隨著多重耐藥(MDR)、廣泛耐藥(XDR)和全耐藥(PDR)病原體的出現(xiàn)，世界正處于后抗生素時(shí)代的邊緣，這將使醫(yī)學(xué)重新陷入黑暗時(shí)代，因此迫切需要開發(fā)能夠調(diào)節(jié)生物膜形成和發(fā)育的新型抗菌劑，以克服微生物感染性疾病中的耐藥問題[4-5]。近年來的研究表明中藥及其活性成分能抑制生物膜的形成和發(fā)育，如五倍子水煎劑可抑制鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成；土荊芥提取物可抑制幽門螺桿菌生物膜形成；桑黃正丁醇提取物可抑制白念珠菌生物膜形成；隱丹參酮可抑制表皮葡萄球菌生物膜等[6-10]。關(guān)于中藥活性成分抑制生物膜形成已有大量報(bào)道，其中黃芩作為現(xiàn)代藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)，其活性成分黃芩苷也成為近些年研究的明星化合物。

黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，別名山茶根、土金茶根，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，味苦，性寒，歸肺、膽、脾、小腸、大腸經(jīng)，其有效成分是黃酮類化合物，主要包括黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)、漢黃芩苷(wogonoside)、漢黃芩素(wogomin)、黃芩新素I(skullcapflavone I)、黃芩新素Ⅱ(skullcapflavone Ⅱ)[11]。黃芩苷是黃芩的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也是黃芩質(zhì)量控制的主要植物化學(xué)標(biāo)志，具有抗病毒、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、保肝、利膽、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，尤以抗真菌/細(xì)菌作用最為顯著[12]。本文將近年來黃芩苷抗生物膜作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期進(jìn)一步深入挖掘其在抗生物膜方面的潛在價(jià)值，為治療生物膜相關(guān)感染提供新的治療策略。

1 抗細(xì)菌生物膜

生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)育過程，主要分為初始粘附階段、早期生物膜形成階段、生物膜成熟階段、擴(kuò)散與再定植階段[13]。生物膜的形成是細(xì)菌引發(fā)慢性感染的關(guān)鍵毒力因子，為細(xì)菌提供了有利于生存的惰性環(huán)境，由于細(xì)菌特有的生活方式賦予了其固有的抗生素抗性，因此治療生物膜相關(guān)感染成為全球面臨的一大挑戰(zhàn)[14]。大量研究表明中藥黃芩活性成分黃芩苷具有抑制細(xì)菌生物膜的作用。

1.1 抗金黃色葡萄球菌生物膜 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, Sa)是革蘭氏陽性菌，常分為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)，主要存在于皮膚和黏膜的正常菌群中[15]。金黃色葡萄球菌能形成成熟的生物膜，與浮游細(xì)菌相比，生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受性可以高出1 000倍[15]。本課題組利用臨床分離并且能夠穩(wěn)定形成生物膜的金黃色葡萄球菌，研究黃芩苷對(duì)金黃色葡萄球菌早期、成熟生物膜的抑制作用，采用TSB-G系統(tǒng)構(gòu)建體外生物膜模型，實(shí)驗(yàn)測(cè)得黃芩苷對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為2 048 μg/mL，黃芩苷可減少金黃色葡萄球菌對(duì)載體的黏附，抑制和清除金黃色葡萄球菌生物膜，同時(shí)還能抑制新的生物膜形成[16-17]。在后期研究中發(fā)現(xiàn)黃芩苷與抗生素具有協(xié)同增效作用，黃芩苷與頭孢他啶[18]、頭孢唑林[19]、左氧氟沙星[20]、萬古霉素[21]等聯(lián)用，能加速破壞生物膜的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)抗生素的滲透以及對(duì)細(xì)菌的清除作用，顯示出了協(xié)同殺菌作用，與其干擾了細(xì)菌群體感應(yīng)(Quorum Sensing, QS)系統(tǒng)密切相關(guān)。在觀察黃芩苷與左氧氟沙星聯(lián)用抗生物被膜感染的療效時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃芩苷作為QS抑制劑，在體外可提高金黃色葡萄球菌熱核酸酶的產(chǎn)量，下調(diào)agrA的表達(dá)，通過agr系統(tǒng)來調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌的毒力因子[22]?；谶@些研究，黃芩苷可作為治療金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)感染的候選藥物，與抗生素聯(lián)用可作為新的、可行的治療策略。

1.2 抗銅綠假單胞菌生物膜 銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是機(jī)會(huì)性致病菌，是囊性纖維化患者持續(xù)性和頑固性感染的主要原因[23]。

謝林利等[24]發(fā)現(xiàn)黃芩苷、黃芩素對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的形成具有抑制作用，對(duì)早期生物膜的抑制作用強(qiáng)于成熟生物膜。王貴年等[25-26]選取臨床分離的銅綠假單胞菌，研究黃芩苷在體外對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為15.65 mg/L的黃芩苷可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，并增強(qiáng)頭孢他啶對(duì)生物膜內(nèi)銅綠假單胞菌的清除作用。Brackman等[27]在探索群體感應(yīng)抑制劑(QSI)在體內(nèi)外增加抗生素對(duì)細(xì)菌生物膜的敏感性研究中，發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過增加妥布霉素 (TOB)對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的敏感性來抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，但敲除參與QS調(diào)控的rhlI基因、lasI基因后，黃芩苷不能增加TOB對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的敏感性，進(jìn)而說明黃芩苷可通過影響群體感應(yīng)系統(tǒng)提高抗生素對(duì)細(xì)菌生物膜的抑制與清除作用。Luo等[28]發(fā)現(xiàn)黃芩苷在體內(nèi)外均可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，對(duì)QS通路調(diào)控的與生物膜形成相關(guān)的基因有明顯的抑制作用，亞MIC黃芩苷處理后，LasI、LasR、rhLI、rhLR、pqsR和pqsA基因的表達(dá)均下調(diào)，從而使QS信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL和C4-HSL的表達(dá)顯著降低，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，黃芩苷處理后不僅可降低銅綠假單胞菌對(duì)秀麗隱桿線蟲的致病性，在小鼠腹腔植入感染模型中，黃芩苷處理后，還提高了感染銅綠假單胞菌的小鼠對(duì)銅綠假單胞菌的清除能力。李少濱等[29]取銅綠假單胞菌 PAO1標(biāo)準(zhǔn)株，用黃芩苷對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1生物膜的體外培養(yǎng)進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示黃芩苷不僅抑制生物膜的形成，還降低多糖蛋白復(fù)合物的產(chǎn)量，抑制mRNA的表達(dá)效果，同時(shí)也說明黃芩苷抑制生物膜生成的機(jī)制存在多靶點(diǎn)，具體的作用機(jī)制仍需深入探索。

1.3 抗其他細(xì)菌生物膜 變形鏈球菌 (Streptococcusmutans, Sm) 是引起口腔致齲的主要致病菌。劉連等[30]發(fā)現(xiàn)黃芩苷、黃芩素對(duì)變形鏈球菌無直接殺滅作用，但可顯著抑制其生物膜的形成，有利于避免細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生。

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis, Pg) 是慢性牙周炎最常見的致病菌，張廣平[31]采用PVC吸痰管作為載體建立體外生物膜模型，實(shí)驗(yàn)測(cè)得32.25 mg/L的黃芩苷可抑制和破壞牙齦卟啉單胞菌生物膜，其抑制機(jī)制可能通過抑制細(xì)菌的黏附作用。

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis, Ef)是普遍存在于人體的腸道和口腔中的正常菌群，由于其以生物膜的形式定植于根管中，所以成為再治療根管中常見的難治性問題。付爽等[32]測(cè)得黃芩苷對(duì)糞腸球菌的MIC為2 mg/mL，MBC為4 mg/mL，共聚焦顯微鏡觀察膜內(nèi)活菌和死菌比例明顯下降，提示黃芩苷可抑制糞腸球菌生物膜的形成。

洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia, Bc)是一種革蘭陰性非發(fā)酵桿菌，廣泛存在于自然和醫(yī)療環(huán)境中，洋蔥伯克霍爾德菌感染會(huì)加速囊性纖維化(CF)患者肺功能衰竭，同時(shí)會(huì)增加死亡率[33]。Slachmuylders等[34]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用妥布霉素相比，同黃芩苷聯(lián)用后會(huì)增加洋蔥伯克霍爾德菌生物膜的氧化壓力，也可增強(qiáng)洋蔥伯克霍爾德菌對(duì)妥布霉素的敏感性，使妥布霉素介導(dǎo)的殺傷力增加。這種增強(qiáng)作用與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，使活性氧的產(chǎn)生增多。

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii, Cs)是近些年新分類出的一種機(jī)會(huì)性病原體，為腸桿菌科克羅諾桿菌屬，常導(dǎo)致嚴(yán)重的感染并發(fā)癥，如新生兒腦膜炎、尿路感染、敗血癥和癲癇等，阪崎克羅諾桿菌能在各種生物及非生物表面形成生物膜。景春娥等[35]測(cè)得2 048 mg/L黃芩苷能夠通過降低阪崎克羅諾桿菌的粘附性，下調(diào)阪崎克羅諾桿菌生物膜相關(guān)基因(glpQ、nlpD、gsiB、deoB)來抑制生物膜的形成。

Wang等[36]發(fā)現(xiàn)黃芩苷還能有效地抑制腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus, Ss)生物膜的形成及agr系統(tǒng)，具體機(jī)制是通過抑制Msra外排泵，外排泵與生物膜的形成之間呈顯著的正相關(guān)。黃衍強(qiáng)等[37]發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)耐藥幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)有抑制作用, 濃度<50%MIC能明顯抑制菌株生物膜的形成。

2 抗真菌生物膜

真菌可以單獨(dú)或與細(xì)菌一同形成生物膜，真菌生物膜的形成與細(xì)菌相似，真菌生物膜是由附著在表面上的細(xì)胞和菌絲組成的復(fù)雜群落，并嵌入細(xì)胞外基質(zhì)中。近年來，與生物膜相關(guān)的侵襲性真菌感染病例不斷增多，尤以白色念珠菌和煙曲霉菌感染率最高，生物膜的形成參與了侵襲性真菌感染的致病過程，因此被認(rèn)為是重要的毒力因子[38]。目前只有幾類抗真菌藥物用于治療真菌感染，而新型抗真菌藥物的開發(fā)進(jìn)展緩慢，故從中藥中挖掘具有抗生物膜作用的中藥活性成分顯得尤為重要。我國(guó)具有豐富的中藥資源，其中有不少中草藥已被證明具有抗真菌生物膜作用，如中藥黃芩活性成分黃芩苷[39]。

2.1 抗白色念珠菌生物膜 念珠菌是引起侵襲性真菌感染最常見的病原菌，其中白色念珠菌(Candidaalbicans, Ca)是引起侵襲性念珠菌病的主要病原體。白色念珠菌是口腔或胃腸道中的共生菌，然而當(dāng)機(jī)體免疫功能嚴(yán)重受損時(shí)，這種真菌可以傳播到血液中并定植于內(nèi)臟，導(dǎo)致危及生命的感染[40]。白色念珠菌生物膜是一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，包含酵母狀細(xì)胞、假菌絲細(xì)胞和菌絲細(xì)胞，這些細(xì)胞被包裹在細(xì)胞外基質(zhì)中，細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)抗真菌藥物起著物理屏障的作用，現(xiàn)有的抗真菌藥物在對(duì)浮游菌有效的濃度下，對(duì)生物膜中的白色念珠菌基本上無效，雖然高濃度的藥物可清除生物膜結(jié)構(gòu)深處的白色念珠菌，但這些劑量往往會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用(即腎臟或肝臟損傷)[41-42]。黃芩及其有效成分對(duì)浮游狀態(tài)的白色念珠菌的抑制作用已有大量報(bào)道，黃芩苷具有抑制白色念珠菌生物膜形成的作用。

李福明等[43]研究黃芩苷在體外對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響，結(jié)果顯示黃芩苷可抑制白色念珠菌生物膜的形成，在質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時(shí)，白色念珠菌生物膜活性降低(90.6±5.2)%，生物膜生物量減少(90.3±2.6)%。黃芩苷在抗白色念珠菌生物膜時(shí)與氟康唑具有協(xié)同增效作用。顏貴明等[44]發(fā)現(xiàn)黃芩苷聯(lián)合氟康唑時(shí)對(duì)白色念珠菌生物膜的抑制作用加強(qiáng)，通過下調(diào)白色念珠菌生物膜相關(guān)基因(ALS1、ALS3、EAP1和SUN41)的表達(dá)，降低細(xì)胞表面疏水性調(diào)控基因CSH1，從而減弱白色念珠菌的毒力，發(fā)揮協(xié)同抗白色念珠菌生物膜的作用。

Wang等[45]研究黃芩苷對(duì)白色念珠菌生物膜的潛在作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃芩苷不僅與氟康唑具有明顯的協(xié)同作用，還可能逆轉(zhuǎn)了白色念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性，同時(shí)在黃芩苷處理的白色念珠菌生物膜中觀察到細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)積累，線粒體膜電位(MMP)降低，磷脂酰絲氨酸(PS)外化，染色體凝聚，細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞色素C(Cytc)釋放等凋亡相關(guān)的現(xiàn)象；通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)發(fā)現(xiàn)黃芩苷處理后RAS1/TPK1上調(diào)、CAP1/PDE2下調(diào)，這四個(gè)基因與Ras-cAMP-PKA通路相關(guān)，該通路調(diào)控著白色念珠菌的凋亡。關(guān)于細(xì)胞凋亡在黃芩苷抗白色念珠菌生物膜中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

2.2 抗非白色念珠菌生物膜 汪長(zhǎng)中等[46]研究了黃芩苷對(duì)光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌生物膜的作用，測(cè)得黃芩苷對(duì)4種非白念珠菌生物膜的SMIC50分別是 1 000、500、125、250 mg/L，SMIC80均≥1 000 mg/L，具有體外抗非白念珠菌生物膜的功能。因此，針對(duì)臨床上可能發(fā)生念珠菌生物膜感染疾病的患者，在未出現(xiàn)感染或感染的早期階段應(yīng)用黃芩苷具有重要的防治意義。

3 結(jié)語

廣譜抗菌藥的使用，導(dǎo)致了大量耐藥菌株的出現(xiàn)，生物膜的形成增強(qiáng)了微生物對(duì)不利因素的抵抗能力。中藥在防治細(xì)菌/真菌生物膜相關(guān)感染方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，黃芩為中醫(yī)臨床常用藥，具有廣泛的藥理作用和重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，黃芩苷可通過抑制細(xì)菌或真菌的粘附、下調(diào)生物膜形成相關(guān)基因，抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞膜通透性等多種途徑達(dá)到抑制生物膜形成的作用，與抗生素聯(lián)用還具有協(xié)同增效作用和逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用。盡管黃芩苷抗生物膜作用已取得一定的進(jìn)展，但仍需深入的研究其作用機(jī)制，以明確其抗生物膜作用的靶點(diǎn)，通過對(duì)中藥黃芩活性成分黃芩苷抗生物膜作用的系列研究，從而建立一種模式，以延伸到其他中藥對(duì)生物膜抑制作用的研究中，更好地促使中藥在這一領(lǐng)域的開發(fā)，為研發(fā)新型抗菌藥物開辟新途徑，為臨床防治生物膜相關(guān)感染策略提供參考。目前市面上的黃芩苷新型制劑主要有納米制劑、固體分散體、脂質(zhì)體制劑、 磷脂復(fù)合物、β-環(huán)糊精包合物、金屬配合物等，但臨床上應(yīng)用于生物膜相關(guān)感染的黃芩苷制劑比較少，今后應(yīng)將該成分基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床效益，研發(fā)出抗生物膜制劑，充分發(fā)揮其特色優(yōu)勢(shì)，使廣大患者獲益。