羅在柒 陸 俊 田 凡 顏鳳霞 黃安香

(貴州省林業(yè)科學(xué)研究院 ，貴州 貴陽(yáng) 550005)

隨著人們對(duì)生活質(zhì)量的不斷追求，以及對(duì)中藥活性成分研究的不斷深入，許多天然活性成分的實(shí)際應(yīng)用需求不斷增加。然而，受藥用植物資源的貧乏和中藥活性成分含量偏低的限制，常規(guī)的種植方法已難以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量植物次生代謝產(chǎn)物的需求?，F(xiàn)代生物技術(shù)能夠從分子水平實(shí)現(xiàn)對(duì)中草藥有效成分合成代謝的人工調(diào)控，并且可以借助轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因的異源表達(dá)，從而提高有效藥用成分的產(chǎn)量和質(zhì)量，其中聚酮類(lèi)化合物研究得比較系統(tǒng)和深入，現(xiàn)已開(kāi)辟了一條藥用資源開(kāi)發(fā)利用的新路徑[1]。

1 聚酮化合物與聚酮合酶

聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)是調(diào)控植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物為聚酮類(lèi)化合物酶的復(fù)合體，藥用方面具重要工業(yè)價(jià)值，目前上市的醫(yī)藥用或農(nóng)用抗生素藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)中，聚酮類(lèi)化合物的位于各類(lèi)天然產(chǎn)物前列，通常常見(jiàn)的聚酮類(lèi)抗生素有紅霉素(erythromycin)、兩性霉素(amphotericin)、螺旋霉素(spiramycin)、四環(huán)素類(lèi)(tetracycline)等[2]。因?yàn)榫弁衔锝Y(jié)構(gòu)的多樣性導(dǎo)致了代謝過(guò)程中產(chǎn)生多樣性的活性，行使多種重要生物學(xué)功能活性。

1.1 聚酮合酶的類(lèi)型劃分

豈止目前，通常將PKS分為3類(lèi)，PKSI型也稱(chēng)為模塊類(lèi)，由多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域通過(guò)共價(jià)連接后形成模塊，再由多個(gè)模塊組成多功能酶的復(fù)合體，這類(lèi)物質(zhì)主要合成大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，如紅霉素、利福霉素、西羅莫司等；PKSII型也稱(chēng)為重復(fù)型、疊代或芳香類(lèi)，含有的各個(gè)催化結(jié)構(gòu)域?yàn)楠?dú)立的蛋白，具有2個(gè)不同的酮類(lèi)酶連接縮合后形成的酮縮合酶，如KSα和KSβ，其中的KSα與PKS I中的KS功能相似，而KSβ控制的是聚酮鏈的長(zhǎng)度。通常PKS II型酶主要控制合成芳香族的物質(zhì)，譬如蒽環(huán)類(lèi)及四環(huán)化合物等； PKSⅢ型又稱(chēng)查兒酮型PKS，和其他兩種PKS不同， PKS Ⅲ型直接作用于?；鵆oA活化的簡(jiǎn)單羧酸，然而，Ⅰ型和Ⅱ型PKS是通過(guò)ACP活化酰基-CoA的底物[3]。

1.2 植物類(lèi)型Ⅲ聚酮化合物合酶超家族產(chǎn)物多樣性及催化原理

植物Ⅲ型PKS，由40-45 kD的二聚體多肽組成，編碼基因通常由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，在所發(fā)現(xiàn)的Ⅲ型PKSs中完全相同，可完成重復(fù)縮合反應(yīng)，其具有高度保守的催化活性中心，即Cys-His-Asn的組合結(jié)構(gòu)，被命名為查爾酮合酶(chalcone synthse，CHS)。這類(lèi)酶主要出現(xiàn)在植物界的植物體代謝，但在枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和米曲霉等少數(shù)細(xì)菌及真菌中也存在[4]。

目前，中藥黃酮類(lèi)化合物有效成分的合成路徑已經(jīng)很明晰[5]。在已發(fā)現(xiàn)的4000余種的黃酮類(lèi)化合物種，主要有黃酮(flavones)、異黃酮(isoflavones)、黃酮醇(flavonols)花色素苷(anthocyanins)等類(lèi)別。植物次生代謝基因工程方面已有近 30 種不同功能的植物PKSs 基因堿基序列被相繼挖掘和功能驗(yàn)證。其中包括了：芪合酶(Stilbene synthase, STS)、CHS、2-吡喃酮合酶(2-Pyrone Synthase,2-PS)、苯亞甲基丙酮合酶、吖啶酮合酶(Acridone synthase,ACS、戊烯酮-色酮合酶(Pentaketide chromone synthase, PCS)、4-香豆酰甘油酸合酶(p-Coumaroyl triacetic acid synthase,CTAS)、辛烯酮合酶(Octaketides synthase, OKS)、聯(lián)芐合酶(Bibenzyl synthase,BBS)、二苯甲酮合酶(Benzophenone synthase,BPS)、聯(lián)苯合酶(Biphenyl synthase,BIS)、芪-羧酸酯合酶(Stilbenecarboxylate synthase,STCS)、蘆薈松合酶(Aloesone synthase,ALS)、苯戊酮合酶(Valerophenone synthase,VPS)、姜黃素合酶(Curcuminoid synthase, CUS；Curcumin synthase 1-3, CURS1-3)等，大量研究證明：植物類(lèi)型Ⅲ聚酮化合物合酶(PKS) 決定該類(lèi)化合物基本分子骨架建成和代謝途徑碳硫走向，在該類(lèi)化合物生物合成起始反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，是合成途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。

目前，已經(jīng)成功分離得到 14 種植物類(lèi)別的PKS Ⅲ型基因，像虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc[6-7])、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)、金魚(yú)草(AntirrhinummajusCHS AMCHS)、八仙花(Hydrangeamacrophyllavar.thunbergii)、紫花苜蓿(MedicagosativaCHS)、掌葉大黃(RheumpalmatumBAS)、花生(ArachishypogaeaSTS)和野葛(PuerarialobataCHScDNA)等，這些基因都既具有保守性和獨(dú)特的個(gè)性這些同祖同源基因及其表達(dá)產(chǎn)物既有共性也表現(xiàn)出許多獨(dú)特個(gè)性，這些個(gè)性賦予此類(lèi)次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上的多樣性[10]。其中，虎杖根中分離得到的PcPKS 5表現(xiàn)出高效率的催化效率[8-9]，并成功遺傳轉(zhuǎn)化到壺瓶棗表現(xiàn)出較好的抗真菌能力[11-12]。以上超家族內(nèi)其他成員酶(CHS-Like) 功能的多樣性均來(lái)自其原型酶-CHS 活性位點(diǎn)的小的修飾影響了該類(lèi)酶活性中心空間構(gòu)象，空間變化極大改變了酶分子的起始底物選擇性、鏈延伸長(zhǎng)度和環(huán)化反應(yīng)機(jī)制[13-14]。

為更多了解功能酶活性差異可能產(chǎn)生的機(jī)制，以確定其高效 BAS 活性的分子機(jī)理，開(kāi)展了酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)比較。蛋白晶體學(xué)研究以PKSs 家族不同成員的功能多樣性來(lái)自于酶催化位點(diǎn)的非常微小的構(gòu)象變化[15]。類(lèi)式的Austin和Noel研究認(rèn)為紫花苜?！伴T(mén)衛(wèi)”P(pán)he215 和 Phe265是調(diào)節(jié)PKSⅢ類(lèi)型 活性位點(diǎn)與輔酶 A(Co A)結(jié)合通道之間的空間結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位點(diǎn)[16]。掌葉大黃 的相關(guān)研究得到了一個(gè)顯著特點(diǎn)是 Phe215(Ms CHS2 順序)被 Leu 取代，而取代對(duì)于該酶的 BAS 功能活性具有自身的獨(dú)特性。試驗(yàn)得到Rp BAS 的Phe265(Ms CHS2 順序)與 CHS2 的區(qū)別是其側(cè)鏈構(gòu)象更加靠近 Leu215 ，并形成相互疏水作用，這兩個(gè)氨基酸基團(tuán)構(gòu)象變化致使 BAS 活性擴(kuò)大兩倍，且還限定了其底物專(zhuān)一性[17]。相類(lèi)似的Pc PKS1 是一個(gè)同時(shí)擁有 CHS 和 BAS 活性的雙功能酶，且 Pc PKS1 的 BAS催化活性效率(Kcat/Km) 是 Pc PKS2 的70 倍[7]。然而，在 Pc PKS1 序列中，Phe215 和 Phe265也存在保守性，我們也推測(cè)出Pc PKS1區(qū)別于Pc PKS2特異的重要氨基酸序列，是決定 BAS 活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。以上研究再次證明了以查爾酮合酶為原型酶的植物類(lèi)型Ⅲ PKS 超家族是研究系統(tǒng)進(jìn)化和蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的模式分子家族。

1.3 PKS功能與機(jī)制多樣性

植物聚酮類(lèi)化合物(Polyketide)主要包含酚類(lèi)、芪類(lèi)及類(lèi)黃酮化合物等三大類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)在調(diào)控植物花色、防止紫外線傷害、預(yù)防病原菌及昆蟲(chóng)危害，以及作為植物與環(huán)境互作信號(hào)分子方面扮演重要的生物學(xué)功能，況且這類(lèi)化合物具有豐富多樣的生物學(xué)活性，在人體保健及疾病防控方面被廣泛應(yīng)用[18]。

植物類(lèi)型Ⅲ PKS 超家族其他成員酶(CHS-Like) 功能的多樣性來(lái)自原型酶——CHS 活性位點(diǎn)的小的修飾，這樣極小的變動(dòng)改變了起始底物的選擇性、鏈延伸的長(zhǎng)度和環(huán)化反應(yīng)機(jī)制。因此，揭示植物類(lèi)型Ⅲ PKS超家族結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)聯(lián)作用，對(duì)于利用該類(lèi)酶進(jìn)行基因工程、代謝工程遺傳操作是必不可缺的重要資源[19]。

2 存在問(wèn)題與展望

有關(guān)聚酮合酶基因的最新研究表明，藥用植物具有聚酮合酶基因，并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)[20]。一些聚酮合酶參與螺萊素的生物合成[21]，煙草植物中也相繼克隆得到查爾酮合酶基因[22]，近期研究從樹(shù)莓中獲得具有查爾酮和苯亞酮合酶的雙功能聚酮合酶基因[23]。另外，在姜科、非洲菊、余甘子等植物聚酮合酶基因研究也取得明顯進(jìn)展[24-26]，相關(guān)酶基因在腸道菌群中產(chǎn)生活性毒素具有抑制直腸癌等疾病的防控[27]。因此，植物III型聚酮合成酶(PKSs)產(chǎn)生多種次生代謝物，呈現(xiàn)一個(gè)基因的復(fù)制和功能的復(fù)雜性，植物與微生物系統(tǒng)PKS研究也得到深入[28]。在一些傳統(tǒng)中草藥內(nèi)生真菌中也鑒定出Ⅲ型聚酮合成酶基因[29],一種Ⅲ型聚酮合酶可以催化螺旋藻毒素的生物合成[30]，成功表達(dá)了一種用于改進(jìn)異源代碼的自動(dòng)化數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)管道酶基因，目前該類(lèi)基因挖掘勢(shì)頭呈平穩(wěn)態(tài)勢(shì)在發(fā)展[31]。

相關(guān)植物聚酮合酶的研究顯示，在分離和克隆CHS 基因的近30 年中，已經(jīng)報(bào)道了200多個(gè)基因。目前，藥物來(lái)源于聚酮化合物的每年銷(xiāo)售額已超過(guò) 100 億美元。然而，仍然存在許多藥用植物中的聚酮類(lèi)化合物PKS基因始終沒(méi)有得到分離和克隆，基于PKS功能與機(jī)制多樣性，有其在苯亞甲基丙酮的生物合成究竟由BAS或者CHS/BAS，或其它類(lèi)型酶等的路徑選擇等諸多問(wèn)題仍然未知。

綜上所述，今后需大量開(kāi)展聚酮合酶基因的克隆以及蛋白酶的生物學(xué)活性的研究，不但可以補(bǔ)充聚酮合酶超家族基因的成員，還有助于深入認(rèn)識(shí)植物聚酮化合物藥用成分合成的分子機(jī)理。同時(shí)，對(duì)植物Ⅲ型聚酮合酶及整個(gè)超基因家族的深入研究為尋找新型藥物，以及對(duì)提升植物本身藥用成分和促進(jìn)作物的遺傳改良等提供新的途徑，以及對(duì)基因工程獲取聚酮化合物開(kāi)發(fā)新藥具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。