陳俊男 李治樺 賴琳英 周桂文 梁黎明 陳敏亮

[關(guān)鍵詞]乳糜化脂肪;間充質(zhì)干細(xì)胞;生物學(xué)特性;表面標(biāo)記物

脂肪源性基質(zhì)/干細(xì)胞（Adipose d e r i v e d s t e mcells，ASCs）是一類來源于脂肪組織的成體間充質(zhì)干細(xì)胞，具有自我更新和優(yōu)良多向分化潛能，且取材容易、取材量大、對組織損傷小、干細(xì)胞含量豐富、增殖能力強(qiáng)大、不受倫理約束等優(yōu)點(diǎn)使其迅速成為組織工程與修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。2001年，Zuk等[2-3]首先發(fā)現(xiàn)ASCs，他們在體外能夠很好地擴(kuò)增，具有多向分化能力，治療涵蓋多領(lǐng)域[4-6]。不僅如此，ASCs能夠分泌細(xì)胞因子，建立良好的損傷修復(fù)微環(huán)境，提高機(jī)體組織修復(fù)能力等[7-8]。2013年，Patrick Tonnard等[9]通過機(jī)械乳化與過濾方式把抽吸脂肪組織制成“納米脂肪（Nanofat）”，用于臨床治療并獲較好效果。研究收集3種脂肪樣本（Macrofat顆粒脂肪，Microfat微粒脂肪及Nanofat），三者比較分析發(fā)現(xiàn)，Nanofat內(nèi)含有大量優(yōu)質(zhì)ASCs。

本研究對傳統(tǒng)負(fù)壓抽吸獲得的自體顆粒脂肪，先經(jīng)特殊步驟處理得到“乳糜化脂肪（Chyle fat）”，然后從中提取乳糜化脂肪來源干細(xì)胞（Chyle fat derived stemcells，CFSCs）并進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)、鑒定、多向誘導(dǎo)等實(shí)驗(yàn)，旨在對同一個體、相同體積的兩種脂肪樣本中分離、純化的間充質(zhì)干細(xì)胞，從形態(tài)學(xué)觀察、干細(xì)胞表型鑒別及誘導(dǎo)分化能力進(jìn)行分析比較，初步研究CFSCs的形態(tài)學(xué)特征及生物學(xué)特性，以期為以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的相關(guān)臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 脂肪組織樣本來源：本實(shí)驗(yàn)所用人脂肪標(biāo)本材料來自解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心燒傷整形科接受脂肪抽吸手術(shù)的1例女性患者（35歲）。抽脂部位為下腹部，患者無急、慢性病史，且已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 Chyle fat的制備

1.2.1.1 顆粒脂肪制備：脂肪抽吸是在1例35歲女性患者接受腹部整形修復(fù)手術(shù)的過程中進(jìn)行的。術(shù)前腫脹液的配比如下：無菌生理鹽水1 000ml+2%利多卡因注射液400mg+鹽酸腎上腺素注射液1mg。20ml注射器回抽10ml（抽吸負(fù)壓值60kPa）及管徑3mm伴多個側(cè)孔直徑1mm進(jìn)行脂肪抽吸手術(shù)。將收獲的脂肪用林格氏液沖洗干凈并通過孔徑為0.5mm的無菌尼龍布過濾、清洗、純化，剔除粗大纖維結(jié)締組織，無菌罐內(nèi)收集經(jīng)過處理后的脂肪樣本，分裝存儲在無菌的離心管內(nèi)，每管30ml，每3管為一組，計算均值作為一次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.2.1.2 Chyle fat制備：將顆粒脂肪經(jīng)孔徑大小為0.8mm的納米轉(zhuǎn)換頭（BD Luer-Lok connector）在兩個5ml注射器內(nèi)快速對打30次，通過機(jī)械乳化的方法，使脂肪轉(zhuǎn)換成白色的乳糜狀液態(tài)，將脂肪液體再次用無菌尼龍布過濾，收集Chyle fat，同法分裝儲存于離心管內(nèi)，每管30ml，3管為一組，計算均值作為一次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。見圖1。

1.2.2 分離提取CFSCs及其體外培養(yǎng)：ASCs及CFSCs的分離來自不同的脂肪抽吸物（顆粒脂肪和Chyle fat），分離提取CFSCs步驟均參照Zuk法。具體操作為：每管以1：1（等體積）比例加入相應(yīng)體積的含有0.1% Ⅱ型膠原酶的磷酸鹽緩沖液，37℃恒溫?fù)u床勻速80r/min振蕩消化45min，觀察混合物呈均質(zhì)勻漿狀即為消化完全，再加同等體積DMEM/F12培養(yǎng)基（其中含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)1% 100IU青霉素、100mg/ml鏈霉素）中和膠原酶終止消化，之后2 000rpm/min離心10min，吸出上層液體和破碎脂肪油脂并丟棄，將基質(zhì)細(xì)胞沉淀重懸于磷酸鹽緩沖鹽水中，用70μm細(xì)胞尼龍篩網(wǎng)過濾，并將濾液收集，而后1 600rpm/min離心10min，吸出上清，培養(yǎng)基重懸基底細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/cm2，接種到25T培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。本實(shí)驗(yàn)選取P3代脂肪干細(xì)胞進(jìn)行研究。見圖2。

1.2.3 CFSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡下觀察CFSCs接種不同時間細(xì)胞形態(tài)的變化、分布及克隆增殖情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CFSCs表面抗原標(biāo)記：取P3代CFSCs，0.25%胰酶消化，PBS洗滌2次，1% BSA（牛血清白蛋白）吹打均勻，制備成每管濃度為1×106/100μl分裝，每支EP管100μl。然后分別加入FITC偶聯(lián)小鼠抗人CD105、FITC偶聯(lián)小鼠抗人CD90、BV421偶聯(lián)抗人CD73、BV421偶聯(lián)抗人CD34單克隆抗體每管5μl、Pe偶聯(lián)抗人CD31、Pe偶聯(lián)抗人CD45單克隆抗體每管20μl，設(shè)立空白同型對照，送流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 CFSCs多能誘導(dǎo)分化

1.2.5.1 成脂誘導(dǎo)鑒定：P3代CFSCs細(xì)胞，2×104/cm2接種于六孔板至細(xì)胞100%融合，加成人ASCs成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基A（10%胎牛血清+培養(yǎng)基A+1%青鏈霉素+500μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）誘導(dǎo)3d，棄A加B液（10%胎牛血清+培養(yǎng)基B+1%青鏈霉素+谷氨酰胺+400μl胰島素）。A、B液交替使用20d，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，油紅〇染色：將培養(yǎng)板置于顯微鏡下對成脂染色觀察并拍照。

1.2.5.2 成骨誘導(dǎo)鑒定：P3代CFSCs細(xì)胞，換用成骨誘導(dǎo)液（成骨誘導(dǎo)液+10%胎牛血清+1%雙抗+400μl抗壞血酸、20μl地塞米松、2ml β-甘油磷酸鈉）誘導(dǎo)培養(yǎng)，設(shè)計對照組，誘導(dǎo)培養(yǎng)5周。誘導(dǎo)期間每日顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況，終末期行茜素紅染色，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.5.3 成軟骨誘導(dǎo)鑒定：取P3代CFSCs細(xì)胞，加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（成軟骨培養(yǎng)基+20μl地塞米松+600μl抗壞血酸+2ml ITS添加物+200μl丙酮酸鈉+200μl脯氨酸），采用微團(tuán)培養(yǎng)法誘導(dǎo)分化連續(xù)培養(yǎng)1個月，對照組僅用常規(guī)配制的DMEM培養(yǎng)。誘導(dǎo)4周后行阿利辛藍(lán)染色觀察，對細(xì)胞外基質(zhì)酸性多糖的陽性染色來鑒別成軟骨分化結(jié)果。

1.2.6 CFSCs細(xì)胞增殖能力檢測（CCK-8法）：取P3代CFSCs細(xì)胞，96孔板接種細(xì)胞懸液，100μl/孔，測6孔/天，實(shí)驗(yàn)時間共7d，將首次接種的培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h，每孔加入配置CCK-8工作液100μl，再用酶標(biāo)儀檢測在450nm的吸光度值，連續(xù)檢測7d。以O(shè)D對培養(yǎng)時間繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析：運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較用t 檢驗(yàn)，以P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)：CFSCs原代經(jīng)24h左右可貼壁，接種24h后可見大約半數(shù)細(xì)胞貼壁，形狀呈現(xiàn)出圓形或菱形，大小不一，此時在培養(yǎng)瓶內(nèi)可見大量透光度亮的紅細(xì)胞等漂浮，48h左右細(xì)胞數(shù)量上升，長梭形為主，培養(yǎng)至5～7d后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增殖期，局部融合排列緊密，呈放射狀或平行狀緊密排列，此時視為細(xì)胞傳代時機(jī)。原代細(xì)胞一般在3～5d即可達(dá)90%以上融合，二、三代后CFSCs細(xì)胞生長良好。見圖3。

2.2 CFSCs表面標(biāo)記物免疫表型檢測：流式細(xì)胞儀檢測P3代CFSCs免疫表型結(jié)果：①CFSCs：P3代CFSCs細(xì)胞呈CD105（95.32%）、CD90（90.16%）、CD73（96.90%）陽性表達(dá)，同時呈白細(xì)胞、造血細(xì)胞系及內(nèi)皮細(xì)胞分子標(biāo)記物CD45（0.25%）、CD34（0.39%）、CD31（0.18%）陰性表達(dá); ② 顆粒脂肪A S C s ： P 3 代A S C s 細(xì)胞呈C D 1 0 5（90.89%）、CD90（89.07%）、CD73（90.62%）陽性表達(dá)，同時其呈CD45（0.04%）、CD34（0.05%）、CD31（0.23%）陰性表達(dá)，間接排除白細(xì)胞、造血細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞的污染。見圖4。

2.3 CFSCs三系誘導(dǎo)結(jié)果

2.3.1 成脂誘導(dǎo)結(jié)果：P3代CFSCs成脂肪誘導(dǎo)分化第4天開始，可以觀察到生細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)闄E圓形或圓形，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大小不一、晶瑩透亮的脂滴形成，油紅〇染色示細(xì)胞內(nèi)脂滴呈桔紅色。見圖5。

2.3.2 成骨誘導(dǎo)結(jié)果：P3代CFSCs成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后，大量細(xì)胞呈現(xiàn)出不規(guī)則的形狀，且體積開始慢慢變大，之后細(xì)胞開始密集、重疊，出現(xiàn)聚集，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，茜素紅染色示桔紅色鈣化結(jié)節(jié)的類骨小梁結(jié)構(gòu)。見圖6。

2.3.3 成軟骨誘導(dǎo)結(jié)果：P3代CFSCs成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后，大量細(xì)胞出現(xiàn)體積變大變圓，胞質(zhì)十分豐富，阿利辛藍(lán)染色示軟骨組織內(nèi)酸性粘多糖著色效果。見圖7。

2.4 CFSCs細(xì)胞生長曲線：CCK8法檢測P3代CFSCs，以細(xì)胞的吸光度值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，標(biāo)畫生長曲線?？梢钥闯?，同ASCs的生長曲線相似，CFSCs在經(jīng)歷了一個快速增殖期后，逐漸進(jìn)入平臺期，從第6天開始，細(xì)胞增殖達(dá)到頂點(diǎn)并出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象。見圖8。

3 討論

分離ASCs方法主要有：一為脂肪組織固體團(tuán)塊;二為負(fù)壓吸引法所得到的液態(tài)脂肪組織。但是，何種方法能夠獲取更多干細(xì)胞團(tuán)呢？該疑問尚未解決，有待于更進(jìn)一步地深入探究[10-11]。從分離、提取ASCs角度看，脂肪抽吸手術(shù)因來源豐富、操作簡單、取材方便、創(chuàng)傷痛苦小等諸多優(yōu)勢，臨床實(shí)踐證實(shí)其遠(yuǎn)比切除脂肪法更具優(yōu)勢。最常見的脂肪抽吸術(shù)式仍為腫脹法脂肪抽吸術(shù)[12]，但是要注意抽吸壓力的掌控，否則會導(dǎo)致ASCs產(chǎn)量大幅下降或影響干細(xì)胞的增殖活性[13]。

研究證實(shí)腹部、側(cè)腹部所獲得的ASCs產(chǎn)量無顯著性差異[14]。本研究選取低負(fù)壓（60kPa）抽吸方式得到游離脂肪組織，乳糜化機(jī)械分離結(jié)合酶消化法成功獲取到CFSCs，該細(xì)胞梭形且呈貼壁生長[15]。

Kim等[ 1 6 ]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度含葡萄糖培養(yǎng)基可以加速干細(xì)胞老化，抑制干細(xì)胞的增殖、分化。故本實(shí)驗(yàn)采用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)人CFSCs，發(fā)現(xiàn)通過機(jī)械乳化和酶消化后分離提取的人CFSCs體外培養(yǎng)時克隆增殖快，傳代間隔時間短，連續(xù)多次傳代亦未出現(xiàn)顯著衰老跡象。SVF中除ASCs外，還包括內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞等多種細(xì)胞[17]。未避免上述混合細(xì)胞群可能對ASCs表型鑒定、增殖能力等結(jié)果造成干擾、混淆實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CFSCs的貼壁特性，通過多次離心清洗的方式盡量去除大部分懸浮細(xì)胞，使得CFSCs因其可貼壁牢固從而存留。然而，原代培養(yǎng)CFSCs時存在被成纖維細(xì)胞污染之可能，且兩者形態(tài)神似，均無特異性鑒別標(biāo)志。那么，漂洗及消化時間在此顯得尤為重要，因?yàn)椴煌?xì)胞的貼壁、消化時間均不一致，知曉成纖維細(xì)胞消化所需時間顯著長于CFSCs后，只需要采用適當(dāng)?shù)南瘯r間就能有效地去除此類雜質(zhì)細(xì)胞。

本次用流式細(xì)胞術(shù)檢測P3代CFSCs膜表面的抗原，結(jié)果提示：①CFSCs細(xì)胞高表達(dá)CD105（95.32%）、CD90（90.16%）、CD73（96.90%）等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，而不表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記物、共刺激分子及部分黏附分子如CD45（0.25%）、CD34（0.39%）、CD31（0.18%）;②顆粒脂肪ASCs的細(xì)胞表面標(biāo)志抗原表達(dá)情況：CD105（90.89%）、CD90（89.07%）、CD73（90.62%）、CD45（0.04%）、CD34（0.05%）、CD31（0.23%）。CD34和CD31代表血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，兩者在上述乳糜化脂肪中的極低表達(dá)說明提取并純化過的CFSCs不含血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血系細(xì)胞等。CD45在所有白細(xì)胞上都有表達(dá)，也叫其白細(xì)胞共同抗原，該抗原的低表達(dá)量也證明了本實(shí)驗(yàn)分離獲得的細(xì)胞并非白細(xì)胞等血液來源細(xì)胞。提示：獲取的CFSCs為高度均一的間充質(zhì)來源細(xì)胞群，充分說明乳糜化脂肪中提取到的CFSCs呈現(xiàn)間充質(zhì)干性極強(qiáng)特性。本實(shí)驗(yàn)尚對CFSCs進(jìn)行增殖及三系分化潛能檢測，結(jié)果顯示：同傳統(tǒng)的顆粒脂肪ASCs相似，CFSCs具有強(qiáng)大的增殖能力和向外、中、內(nèi)胚層分化的能力。

本實(shí)驗(yàn)在制備乳糜化脂肪時，脂肪細(xì)胞在機(jī)械乳化過程中被大量破壞，鏡下未見明顯脂肪細(xì)胞，但是乳糜化脂肪樣本后期的細(xì)胞培養(yǎng)與純化過程中，成功分離出具備良好分化潛能的CFSCs，該CFSCs具有粘附性，能夠貼壁形成單層，并表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞形態(tài)，且其具備干細(xì)胞免疫表型，并可在不同誘導(dǎo)條件下向成熟脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化。研究結(jié)果說明：乳糜化脂肪內(nèi)含有大量優(yōu)質(zhì)干細(xì)胞（CFSCs）。

類似Nanofat，乳糜化脂肪不在于容積構(gòu)建，因其內(nèi)缺少脂肪細(xì)胞。前期臨床研究[18]發(fā)現(xiàn)，乳糜化脂肪移植能夠改善瘢痕內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白排列順序使增生性瘢痕趨于平坦。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果得出：乳糜化脂肪內(nèi)都不含脂肪細(xì)胞了，還能稱其為脂肪移植嗎，改善瘢痕質(zhì)地及組織性質(zhì)的關(guān)鍵又是什么呢？考慮主要起效的為其內(nèi)所含的干細(xì)胞。因此，乳糜化脂肪注射可以被想象成是一個體內(nèi)組織工程重建過程。乳糜化脂肪移植治療瘢痕是一種非常有價值的臨床技術(shù)，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。