劉金磊，顧捷，陳麗琴，阿民勿日他

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學研究生學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學法醫(yī)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010110

苯二氮?類藥物具有抗癲癇、抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠等作用，但此類藥物長期使用，會使用藥者產(chǎn)生很強的依賴性，其用藥風險遠遠超過獲益[1]，此類藥物濫用已經(jīng)是一個全球性的問題[2]。苯二氮?類藥物主要作用于γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神經(jīng)突觸傳導，表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制和肌肉松弛，過量使用可能產(chǎn)生短暫性失憶、認知能力降低，與乙醇或其他藥物聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，并且較易獲得，被認為是與各種犯罪有關最常見的藥物[2-4]。苯二氮?類藥物主要經(jīng)過尿液排泄，因此尿液檢測常作為攝入或者濫用該藥物的依據(jù)。但該類藥物代謝快、半衰期短，故快速檢測方式及高效萃取方法的研究顯得十分重要[4-6]。樣品前處理方法主要有固相萃取法、液液萃取法、中空纖維液相微萃取法等[2，7-9]，前兩者存在耗時長、成本較高及制備量較多等不足，后者萃取技術雖然試劑使用量較少，但操作步驟相對復雜。

超分子溶劑作為一種新型萃取技術，是指在水溶液環(huán)境下由兩親化合物膠體溶液自發(fā)組裝和凝集形成的具有納米結構的膠束聚集體[10]。兩親化合物膠體溶液多采用四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）和烷基醇或者酸混合而成，形成的超分子溶劑可以從含水檢材中有效萃取低分子量的化合物[11-14]。因此，本研究擬建立一種超分子溶劑萃取-氣相色譜-串聯(lián)質譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）檢測尿液中苯二氮?類藥物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Agilent 7890B-7000D 氣相色譜-串聯(lián)質譜儀（美國Agilent 公司）；MDF-382 醫(yī)用超低溫冰箱（日本Panasonic 公司）；TW-NC12 金屬浴氮吹儀（武漢泰特沃斯科技有限公司）等。

甲醇、四氫呋喃、1-己醇、丙酮（色譜純，北京邁瑞達科技有限公司）。

對照品（勞拉西泮、地西泮、咪達唑侖、氟硝西泮、硝西泮、氯硝西泮、氯氮平、艾司唑侖、阿普唑侖）和內(nèi)標（勞拉西泮-d4、地西泮-d5、氟硝西泮-d7、硝西泮-d5、氯硝西泮-d4、艾司唑侖-d5、阿普唑侖-d5）的純度均≥98.0%，購自美國Sigma-Aldrich 公司。咪達唑侖和氯氮平的內(nèi)標為地西泮-d5。

1.2 混合對照品儲備液、工作液及混合內(nèi)標工作液的配制

分別吸取各對照品溶液100 μL 于同一量瓶中，用甲醇配制質量濃度為50 000 ng/mL 的混合對照品儲備液2 mL，再用甲醇逐級稀釋為10 000、5 000、2 000、1 000、500、200、100、20 ng/mL 的系列混合對照品工作液。同法配制質量濃度為5 000 ng/mL 的混合內(nèi)標工作液。儲備液均置于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 尿液樣品

8 名22～27 歲健康男性志愿者實驗前均未服用過此類藥物，實驗前每名志愿者收集100 mL 空白尿液，混合后（共800 mL）于-80 ℃冷凍保存。志愿者單次服用阿普唑侖2 mg，分別在服藥后8、24、48、72 和96 h留取尿液5 mL，將尿液冷凍保存于-80 ℃冰箱中。

所有志愿者簽署知情同意書，本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審批（審批號YKD2019 0205）。

阿普唑侖（0.4 mg/片）片劑由內(nèi)蒙古自治區(qū)精神衛(wèi)生中心提供。

1.4 尿液處理方法

取10 mL 離心管，加入1 mL 尿液、10 μL 質量濃度為5 000 ng/mL 的混合內(nèi)標工作液、1 mL THF 和200 μL 1-己醇，渦旋振蕩1 min，以12 000×g離心5 min，將所形成的超分子溶劑層經(jīng)孔徑為0.22 μm 的有機過濾膜過濾后，轉移到1.5 mL 離心管中，經(jīng)TWNC12 金屬浴氮吹儀吹干，用50 μL 甲醇復溶，振蕩混勻后進行GC-MS/MS 分析。

1.5 分析條件

色譜條件：Agilent J&W HP-5ms 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm；美國Agilent 公司）；載氣為高純氦氣，流速為2.25 mL/min；碰撞氣為高純氮氣，流速為1.5 mL/min。升溫程序：100 ℃1.5 min；以25 ℃/min 升溫至280 ℃，1.5 min；運行23.7 min。前進樣口溫度為250 ℃；分流比為5∶1，進樣量為1 μL。

質譜條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150℃，電子電離（electron ionization，EI）電壓70eV，溶劑延遲時間9 min，數(shù)據(jù)采集采用多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，其余參數(shù)見表1。

1.6 超分子溶劑的選取

本研究的關鍵步驟在于超分子溶劑的選取及其最佳體積配比，根據(jù)談義萌等[10]和ACCIONI 等[12-13]提出的研究方法，探索當1-己醇為200 μL，THF 分別為0.5、1、1.5、2 mL 時尿液中9 種藥物的提取回收率，每個樣品平行測定3 次。其次考察當THF 為1 mL，1-己醇分別為150、200、250、300、350 μL 時尿液中9 種藥物的提取回收率，每個樣品平行測定3 次。

表1 GC-MS/MS定性、定量監(jiān)測離子對保留時間及質譜參數(shù)Tab. 1 Qualitative and quantitative monitoring of ion pair retention time and mass spectrum parameters by GC-MS/MS

1.7 方法學驗證

1.7.1 添加尿液樣品配制

取空白尿液樣品，加入“1.2 節(jié)”配制的系列混合對照品工作液適量，配制成質量濃度分別為0.2、1、2、5、10、20、50、100 ng/mL 的一系列質量濃度添加尿液樣品。

取空白尿液樣品，分別配制質量濃度為0.2、5 和100 ng/mL 的艾司唑侖，1、10 和100 ng/mL 的地西泮、咪達唑侖、氟硝西泮和氯氮平，2、10 和100 ng/mL 的硝西泮和氯硝西泮，5、20、100 ng/mL 勞拉西泮和阿普唑侖的非混合添加尿液樣品。

1.7.2 方法專屬性

在實驗前，將8 名志愿者的空白尿液混勻后取1 mL，按“1.4 節(jié)”和“1.5 節(jié)”進行操作和分析。

1.7.3 校正曲線與線性范圍

取系列質量濃度添加尿液樣品，按“1.4 節(jié)”和“1.5 節(jié)”步驟進行操作和分析，使用Microsoft office 2019 Excel 軟件對藥物質量濃度（x）和藥物峰面積與內(nèi)標峰面積比值（y）進行線性回歸分析，計算線性范圍[4]。

1.7.4 方法靈敏度

靈敏度常以檢測限（limit of detection，LOD）和（或）定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）表示，在儀器分析中，常用信號值和噪聲的比值，即信噪比（signal to noise ratio，S/N）來確定，一般以S/N 為10時的藥物質量濃度作為LLOQ，以S/N 為3 時的藥物質量濃度作為LOD[4，15]。

1.7.5 方法精密度和準確度

取不同質量濃度的非混合添加尿液樣品各5 份，按“1.4 節(jié)”和“1.5 節(jié)”進行操作和分析，同一天內(nèi)不同時間段分別測定5 次，連續(xù)測定5 d，采用隨行校正曲線計算相應的藥物濃度，從而計算得到日內(nèi)和日間精密度及準確度，日內(nèi)和日間精密度用相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來表示，準確度用偏倚（%）來表示。

1.7.6 提取回收率

取不同質量濃度的非混合添加尿液樣品各5 份，按“1.4 節(jié)”和“1.5 節(jié)”的操作和分析，記錄相應的峰面積（SA）。取空白尿液樣品同樣按“1.4 節(jié)”的操作進行處理后，加入相應質量濃度的對照品溶液，每個質量濃度的尿液樣品平行制備5 份，按“1.5 節(jié)”分析，記錄相應的峰面積（SB），提取回收率為SA/SB×100%。

1.7.7 方法穩(wěn)定性

取不同質量濃度的非混合添加尿液樣品各3 份，分別置于室溫（25 ℃）和冷凍（-20 ℃）2 種溫度下放置15 d，按“1.4 節(jié)”和“1.5 節(jié)”進行操作和分析，考察尿液中9 種藥物在上述條件下是否具有良好的穩(wěn)定性。

1.8 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 25.0 軟件（美國IBM 公司）進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，計量資料的統(tǒng)計描述采用表示。滿足正態(tài)性、方差齊性條件的計量資料涉及多個樣本均數(shù)比較時采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）和Student-Newman-Keuls（SNK）法進行單因素方差分析和兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果與討論

2.1 超分子溶劑的選取

表2 顯示，選用1 mL THF，地西泮和咪達唑侖的提取回收率與0.5、1.5 mL THF 的提取回收率相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而0.5、1.5 mL THF 下的提取回收率之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。0.5、1 mL THF 下，氯氮平的提取回收率之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但兩者與1.5 mL THF 下的提取回收率比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當THF≥2 mL時，加入混合對照品溶液后出現(xiàn)有機相與水相不分層現(xiàn)象，因此，1 mL THF 時提取回收率最高。

表3 顯示，當1-己醇含量≥200 μL 時，各含量下勞拉西泮、氟硝西泮、硝西泮和氯氮平4 種藥物的提取回收率兩兩之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但各自與含量為150 μL 時的提取回收率相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當1-己醇含量≥200 μL 時，9 種藥物的提取回收率已較高且較為穩(wěn)定，為了節(jié)省有機溶劑，最終選取200 μL 1-己醇進行提取。

綜合考慮，選取1 mL THF 和200 μL 1-己醇為最佳含量。

2.2 方法的專屬性

圖1 顯示，內(nèi)源性物質不會對檢測結果造成干擾，該方法的專屬性良好。

表2 不同含量THF的提取回收率Tab. 2 Extraction recovery rate of THF with different contents （n=3，，%）

表2 不同含量THF的提取回收率Tab. 2 Extraction recovery rate of THF with different contents （n=3，，%）

注：1）與1 mL THF提取回收率相比，P＜0.05；2）與1.5 mL THF提取回收率相比，P＜0.05。

藥物勞拉西泮地西泮咪達唑侖氟硝西泮硝西泮氯硝西泮氯氮平艾司唑侖阿普唑侖THF含量1.5 mL 93.41±4.05 88.08±3.121）82.60±1.361）92.87±3.77 85.37±3.21 85.94±1.90 76.37±1.71 86.59±6.32 89.15±4.38 0.5 mL 98.66±4.97 88.57±1.791）83.87±0.561）92.17±7.21 80.67±5.93 87.63±5.31 91.84±4.362）86.43±2.95 88.53±2.68 1 mL 98.97±2.66 95.93±0.47 87.43±1.18 93.67±3.74 87.62±2.85 87.93±2.42 90.13±5.732）89.57±3.70 94.03±4.39

表3 不同含量1-己醇的提取回收率Tab. 3 Extraction recovery rate of 1-hexanol with different contents （n=3，，%）

表3 不同含量1-己醇的提取回收率Tab. 3 Extraction recovery rate of 1-hexanol with different contents （n=3，，%）

注：1）與150 μL 1-己醇提取回收率相比，P＜0.05。

圖1 MRM總離子色譜圖Fig. 1 MRM total ion chromatogram

2.3 校正曲線和LLOQ

表4 顯示，尿液中9 種藥物在相應質量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系，LLOQ 為0.2～5.0 ng/mL。

2.4 精密度、準確度和提取回收率

表5 顯示，9 種藥物的日內(nèi)精密度和準確度（絕對值）分別≤9.86%、9.51%；日間精密度和準確度（絕對值）分別≤8.74%、9.98%，提取回收率為81.12%～99.52%。

2.5 穩(wěn)定性實驗

表6 顯示，不同保存溫度下，尿液中9 種藥物在15 d內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，相對誤差為0.03%～10.75%。

表4 尿液中苯二氮?類藥物的校正曲線和定量下限Tab. 4 Calibration curve and lower limit of quantification of benzodiazepines in urine

表5 苯二氮?類藥物的精密度、準確度和提取回收率Tab. 5 Precision，accuracy and extraction recovery of benzodiazepines （n=5，%）

表6 苯二氮?類藥物的穩(wěn)定性Tab. 6 Stability of benzodiazepines （n=3）

2.6 志愿者尿液樣品測定

根據(jù)已有標準[15]進行定性分析，8名志愿者尿液中均檢出阿普唑侖，8～72 h 內(nèi)尿液中阿普唑侖的質量濃度為6.54～88.28 ng/mL。在72 h 時，有2 人檢出但低于定量限，3 人未檢出，在96 h 時均未檢出（表7），6 號志愿者服藥后8h尿液中阿普唑侖的MRM色譜圖見圖2。

表7 志愿者尿液中阿普唑侖的質量濃度Tab. 7 Alprazolam concentration in the urine of volunteers（n=3，，ng·mL-1）

表7 志愿者尿液中阿普唑侖的質量濃度Tab. 7 Alprazolam concentration in the urine of volunteers（n=3，，ng·mL-1）

注：ND表示未檢出；LLOQ表示定量下限。

志愿者1號2號3號4號5號6號7號8號留尿時間8 h 50.51±2.77 52.11±5.98 88.28±6.26 68.38±1.46 82.46±6.26 30.98±0.44 80.15±8.18 43.25±2.83 24 h 16.48±1.61 25.34±3.12 24.09±2.31 17.98±2.22 14.91±1.67 17.22±1.85 16.17±0.98 27.04±2.12 48 h 9.35±0.79 8.33±0.58 12.68±0.57 10.43±0.34 6.44±0.09 6.57±0.54 7.52±0.09 14.77±1.18 72 h ND 6.54±0.78 9.45±0.91＜LLOQ ND＜LLOQ ND 8.58±0.81

圖2 志愿者尿液中阿普唑侖的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatogram of alprazolam in urine of volunteers

3 結 論

本研究基于四氫呋喃和1-己醇組成的超分子溶劑萃取，聯(lián)合GC-MS/MS 進行測定的方法運用于尿液中苯二氮?類藥物的分析，具有簡便、快速、高回收率、高靈敏度、低成本等優(yōu)點。應用本方法對阿普唑侖服藥志愿者尿液進行分析，從志愿者8～72 h 尿液中檢出阿普唑侖（6.54～88.28 ng/mL）。本方法可以滿足實際尿液樣品中苯二氮?類藥物的定性定量檢測要求，為臨床治療藥物監(jiān)測及司法鑒定中苯二氮?類藥物中毒提供新的檢測手段。