劉高峰，張 勇，張小貞，湯光耀，李保田，王保健

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院心胸外科，河南 鄭州 450042)

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告顯示，肺癌是目前全球癌癥發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的類型，占全部肺癌的85%左右[2]。由于缺乏早期臨床癥狀，多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期，治療后易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者5年生存率較低[2,3]。因此探究NSCLC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找可能的基因治療靶點(diǎn)對(duì)NSCLC的診斷和治療具有重要意義。近年來研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用[4]。LncRNA MNX1-AS1，又稱為CCAT-5，在卵巢癌、肝癌、惡性膠質(zhì)瘤中異常高表達(dá)，與其增殖、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[5,6]。目前關(guān)于MNX1-AS1與NSCLC發(fā)生發(fā)展的研究較少。本研究擬通過檢測MNX1-AS1在NSCLC組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討MNX1-AS1在NSCLC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的生物學(xué)功能。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象:收集2015年6月至2017年6月在聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院經(jīng)病理組織學(xué)確診并經(jīng)根治性或姑息性切除手術(shù)的180例NSCLC患者的原發(fā)病灶及癌旁組織標(biāo)本。所有組織標(biāo)本均置于液氮中保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為NSCLC；術(shù)前未進(jìn)行放、化療及其他抗腫瘤治療；患者臨床病理資料及隨訪資料完整；排除合并有其他部位惡性腫瘤者；排除惡化嚴(yán)重，生存時(shí)間≤3個(gè)月的患者。其中其中男118例，女62例，年齡30-74歲，平均年齡(52.93±7.39)歲；病理類型：鱗癌79例，腺癌101例；組織分化程度：高分化42例，中分化55例，低分化83例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期55例，Ⅲ期125例；腫瘤大?。?3cm 94例，≥3cm 86例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有95例。所有標(biāo)本采集均告知患者并簽署知情同意書，本研究經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測NSCLC組織及癌旁組織中MNX1-AS1的表達(dá):采用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)(DU800,美國Beckman公司)鑒定OD260/OD280為1.8-2.0，并測定濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照PrimeScriptTM RT Reagent kit(日本TaKaRa公司)說明書將中RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen qPCR Master Mix(日本Toyobo公司)說明在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7300HT，美國ABI公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：MNX1-AS1，上游引物：5'-CCCGCATTTTCAGATTCAC-3'，下游引物：5'-GCTCTCAGCCTCGCCATA-3'；GAPDH，上游引物：5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，下游引物：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。反應(yīng)條件為：95℃ 10min，95℃15s，60℃ 15s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MNX1-AS1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3隨訪:對(duì)所有患者術(shù)后進(jìn)行電話、門診等形式的定期隨訪，所有患者均隨訪5年，隨訪最終截止時(shí)間為2020年6月。隨訪結(jié)束后，生存70例例，死亡110例，無失訪病例。其中無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)是指腫瘤確診至發(fā)生疾病進(jìn)展(腫瘤增長、病灶轉(zhuǎn)移或發(fā)生新病灶)或死亡的時(shí)間；總生存期(overall survival,OS)為腫瘤確直至各種原因死亡時(shí)間或隨訪截止時(shí)間。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例(%)表示，并行χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并行Log-rank檢驗(yàn)，采用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析影響預(yù)后的因素。顯著性水平α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MNX1-AS1的表達(dá):RT-qPCR檢測NSCLC組織及癌旁組織中MNX1-AS1的表達(dá)結(jié)果顯示，NSCLC組織中MNX1-AS1的相對(duì)表達(dá)量為(2.28±0.27)，顯著高于癌旁組織的(1.08±0.24)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 NSCLC組織和癌旁組織中MNX1-AS1的表達(dá)

2.2MNX1-AS1的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系:以NSCLC組織中MNX1-AS1表達(dá)水平的中位值(M=2.28)為截點(diǎn)，將180例NSCLC患者分為MNX1-AS1高表達(dá)組(≥2.28，n=90)和低表達(dá)組(<2.28，n=90)。進(jìn)一步分析MNX1-AS1與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MNX1-AS1的表達(dá)與NSCLC患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理類型等無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 MNX1-AS1表達(dá)與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系n(%)

2.3MNX1-AS1的表達(dá)與NSCLC預(yù)后的關(guān)系:所有患者隨訪5～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為40個(gè)月。采用Kaplan-Meier法繪制NSCLC患者的PFS及OS生存曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)組PFS為(26.44±15.61)個(gè)月，顯著低于低表達(dá)組(34.87±15.95)個(gè)月，(t=3.580，P<0.001)；MNX1-AS1高表達(dá)組患者的OS為(34.29±17.16)個(gè)月，顯著低于低表達(dá)組(40.54±15.05)個(gè)月(t=2.600，P=0.010)；本研究中MNX1-AS1高表達(dá)組患者的5年總生存率顯著低于低表達(dá)組(26.7% vs 51.1%，χ2=11.052，P=0.001)，見圖2。

圖2 NSCLC患者的PFS和OS生存曲線

2.4影響NSCLC患者預(yù)后的多因素分析:將患者的臨床病理參數(shù)及MNX1-AS1的表達(dá)均納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及MNX1-AS1的表達(dá)均為NSCLC患者預(yù)后OS的獨(dú)立影響因素。其中MNX1-AS1高表達(dá)患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)者的1.545倍。見表2。

表2 NSCLC患者預(yù)后多因素分析

3 討 論

NSCLC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程，具有惡性程度高，易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后較差等特點(diǎn)[7]。因此從基因水平深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制對(duì)于NSCLC的早期診斷、治療及預(yù)后判斷十分重要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究顯示，多種lncRNA，如CCAT2、MALAT1、GAS6-AS1等在NSCLC組織中異常表達(dá)，可能是其潛在的新的治療靶點(diǎn)[8]。MNX1-AS1位于人類7號(hào)染色體上，全長992bp。研究發(fā)現(xiàn)，MNX1-AS1在卵巢癌、宮頸癌、肝癌等多種惡性腫瘤中的表達(dá)異常升高，發(fā)揮癌基因的功能[9,10]。但目前關(guān)于MNX1-AS1在NSCLC組織中表達(dá)變化的報(bào)道較少，其與NSCLC疾病進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系尚未明確。

研究發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1在肺癌中顯著上調(diào)，與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征密切相關(guān)，預(yù)示著不良預(yù)后[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MNX1-AS1在NSCLC組織中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示MNX1-AS1可能在NSCLC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著致癌作用，與本課題組前期研究結(jié)果及其在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤組織中的表達(dá)趨勢較為一致[12]。同時(shí)本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1表達(dá)水平與NSCLC的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示MXN1-AS1參與了NSCLC的發(fā)展及轉(zhuǎn)移進(jìn)程。進(jìn)一步分析MNX1-AS1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1高表達(dá)患者的PFS、OS及5年總生存率均顯著低于低表達(dá)者，且MNX1-AS1表達(dá)水平是NSCLC患者的預(yù)后獨(dú)立影響因素。上述結(jié)果充分說明MNX1-AS1與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，與Liu等[11]研究結(jié)果較為一致。

綜上所述，MNX1-AS1在NSCLC組織中高表達(dá)，與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后均相關(guān)，可作為NSCLC患者潛在的早期診斷及預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物。但MNX1-AS1在NSCLC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的潛在分子機(jī)制上需要進(jìn)一步的分子及臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。