馬悅原，陳金春，陳國強，2

（1 清華大學生命科學學院，北京100084；2 清華大學化工系，北京100084）

工業(yè)生物技術生產了一些人類所需的化工、材料、能源、酶、食品和醫(yī)藥等產品[1]。但是，除了醫(yī)藥和食品，現(xiàn)代工業(yè)生物技術生產的化工、材料和能源等產品制造成本高昂，雖然制造過程安全，但競爭性不如化學工業(yè)。目前的工業(yè)生物技術主要利用模式微生物，特別是大腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、乳酸菌、鏈霉菌和酵母菌進行，過程有容易染菌、淡水消耗大、耗能高、發(fā)酵不連續(xù)、細胞密度低和產量低等缺點。為克服目前的工業(yè)生物技術的缺點，利用極端微生物進行工業(yè)生物制造的“下一代工業(yè)生物技術”應運而生。下一代工業(yè)生物技術使用嗜鹽微生物、嗜冷微生物、嗜熱微生物、嗜酸微生物、嗜堿微生物、旱生菌以及在特殊碳源或有毒物質中生長的微生物等特殊微生物進行工業(yè)發(fā)酵[2]，以實現(xiàn)無需滅菌、節(jié)能節(jié)水、開放式、連續(xù)的發(fā)酵過程。其中，嗜鹽微生物以其在高鹽環(huán)境中生長的獨特優(yōu)勢，成為“下一代工業(yè)生物技術”的最先成功開發(fā)的底盤細胞[3-4]。

1 嗜鹽微生物的特點和優(yōu)勢

嗜鹽微生物是一類生長于NaCl濃度大于1%的環(huán)境中的微生物，根據生長環(huán)境鹽濃度的不同，嗜鹽微生物可以分為低度嗜鹽菌（1%～3%NaCl）、中度嗜鹽菌（3%～15% NaCl）和高度嗜鹽菌（15%～30%NaCl）[5]，除了耐高鹽，很多嗜鹽微生物還具有耐高堿的特點[6]。嗜鹽微生物主要生長于海洋、鹽湖等環(huán)境中，在分類學上包括細菌、古菌、藻類和真菌， 常見的嗜鹽微生物有Halomonas、Haloferax、Alkalibacterium、Bacillus、Pontibacillus和Marinobacter等[7]。

相較于大腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、天藍鏈霉菌和酵母等底盤細胞，嗜鹽微生物底盤細胞的遺傳背景不夠清晰、基因編輯難度更大，這為嗜鹽微生物的研究和改造帶來了許多挑戰(zhàn)。但是，因為具有耐鹽、不易染菌、生長速度快和魯棒性強等諸多優(yōu)勢（表1），以嗜鹽微生物為底盤細胞的“下一代工業(yè)生物技術”相較于現(xiàn)有的工業(yè)生物技術展現(xiàn)出如下優(yōu)勢：第一，由于其他微生物無法在嗜鹽微生物生長所需的高鹽高堿環(huán)境中生存，嗜鹽微生物不易被其他微生物污染，所以在用嗜鹽微生物進行工業(yè)發(fā)酵時，可以省去滅菌步驟，進行無滅菌、開放式、連續(xù)發(fā)酵，這極大地簡化了發(fā)酵操作過程，減少了滅菌能耗和人力操作；第二，可以用海水替代淡水作為嗜鹽微生物進行工業(yè)發(fā)酵的高鹽濃度培養(yǎng)基，這節(jié)約了淡水資源；第三，進行發(fā)酵的生物反應器也無需滅菌，可以用塑料、陶瓷等材料制作，無需耐高溫耐高壓的金屬材料；第四，工程化改造后，可以用廚余垃圾、秸稈等廉價碳源替代葡萄糖進行工業(yè)發(fā)酵；第五，可以用同一株嗜鹽菌生產多種產品；第六，可以用全自動電子控制系統(tǒng)自動控制連續(xù)發(fā)酵過程，取代現(xiàn)有的人工操作。鹽單胞菌屬菌株Halomonas bluephagenesis TD01 和Halomonas campaniensis LS21 可以在高鹽高堿的環(huán)境下生長，具有生長速度快、細胞干重大、不易染菌、產品豐富等優(yōu)勢，已經成為“下一代工業(yè)生物技術”的重要底盤細胞[2,4,8-10]。

表1 嗜鹽微生物底盤細胞與其他底盤細胞的優(yōu)缺點

2 嗜鹽微生物分子操作工具的開發(fā)

在工業(yè)生產中，提高產量和開拓新產品是關鍵，為了達到這個目的，經常需要用分子生物學手段對底盤細胞進行改造。作為“下一代工業(yè)生物技術”的底盤細胞，嗜鹽微生物也需要進行分子生物學改造。但是不同于遺傳背景清晰和分子操作工具完善的模式微生物，嗜鹽微生物作為非模式微生物，缺乏足夠的分子改造方法。為了解決這一弊端，首先需要開發(fā)出適用于嗜鹽微生物的分子操作工具。

2.1 基因組編輯工具CRISPR-Cas

CRISPR（規(guī)律成簇間隔短回文重復序列）是原核生物基因組內的一段重復序列，CRISPR 與Cas 蛋白組成的CRISPR-Cas 系統(tǒng)作為一種在古生菌中存在的天然保護機制，可以抵御外源核酸侵入古生菌基因組[11]。在古嗜鹽菌Haloferax volcanii 中存在著CRISPR-Cas Ⅰ-B 系統(tǒng)[12-13]，將該系統(tǒng)的cas3基因敲除后，DNA雙鏈將無法被剪切，此時導入靶向特定DNA 序列的crRNA，Cascade 蛋白被crRNA 引導到該DNA 片段所在的位置，由于Cascade 蛋白形成了空間位阻，導致RNA聚合酶無法正常結合，因此目標基因的轉錄會受到抑制，通過這樣的方法可以抑制基因表達，將crRNA 靶向目標基因的啟動子或者模板鏈導致基因轉錄水平下降到原來的8%，將crRNA 靶向目標基因的編碼鏈導致基因轉錄水平下降到原來的88%[14]。

除了調控基因表達，嗜鹽微生物的基因組編輯技術同樣至關重要。在嗜鹽微生物中建立CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以實現(xiàn)對嗜鹽細菌的基因組編輯：在鹽單胞菌Halomonas bluephagenesis TD01 和Halomonas campaniensis LS21 中，用兩個質粒分別表達釀膿鏈球菌的Cas9 蛋白和靶向特定基因組DNA 序列的向導RNA(gRNA)，在gRNA 的引導下，Cas9 蛋白在靶向位點切割DNA 雙鏈，質粒上的同源臂和切割位點附近的相同同源臂發(fā)生同源重組，兩段同源臂中間的序列從基因組上缺失，實現(xiàn)基因敲除[圖1(a)]；如果在質粒上的兩段同源臂之間加入外源基因，則可以在同源重組過程中將外源基因插入基因組或替換基因組上的DNA片段[圖1(b)][15]。

2.2 組成型啟動子庫PPorin lib

為了在嗜鹽微生物中生產某種產物或進行其他改造，經常需要在嗜鹽微生物中用組成型啟動子表達外源基因，由于同一啟動子在不同物種之間的表達情況存在差異，所以需要開發(fā)在嗜鹽微生物中適用的啟動子?？椎鞍譖orin 是在鹽單胞菌H.bluephagenesis 中表達強度最高的蛋白，該蛋白的啟動子PPorin也被開發(fā)為在鹽單胞菌H.bluephagenesis 中持續(xù)表達外源基因的組成型啟動子[16]。PPorin的表達強度非常強，適合表達需要超高表達強度的基因，而將PPorin-10 區(qū)前的3 個堿基或者-10 區(qū)后、-35 區(qū)前的4 個堿基進行隨機突變可以得到組成型啟動子庫PPorinlib[圖1(c)]，該啟動子庫包含95 個不同強度的啟動子，最高表達強度是最低表達強度的3500 倍，可以用各種不同的強度表達基因，該啟動子庫不但可以在鹽單胞菌中使用，在模式生物大腸桿菌中的表達范圍也很廣[17]。用該啟動子庫在鹽單胞菌H.bluephagenesis 中調控4-羥基丁酰輔酶A 轉移酶基因orfZ、4-羥基丁酰輔酶A脫氫酶基因4hbd、琥珀酸半醛脫氫酶基因sucD 和α-酮戊二酸脫羧酶基因ogdA 的表達，可以有效提高3-羥基丁酸（3HB）和4-羥基丁酸（4HB）的共聚物P34HB 的產量和4HB 在共聚物中的含量[17-18]。

2.3 誘導型表達系統(tǒng)

在對嗜鹽微生物進行改造的過程中，除了組成型表達外源基因，還需要在特定條件下誘導外源基因的表達，這就要用到誘導型啟動子。

嗜鹽古菌Haloferax volcanii 的色氨酸酶啟動子p.tna 受色氨酸調控[19-20]，在100μg/mL 色氨酸的誘導下，p.tna 啟動子控制的基因的表達水平提高了100 倍[19]，用色氨酸誘導乙醇脫氫酶基因的表達可以將乙醇脫氫酶ADH/D1 的產量提高到16.8mg/g CDW（細胞干重）[21]。

T7 誘導系統(tǒng)是在大腸桿菌中廣泛使用的誘導系統(tǒng)，然而，T7 RNA 聚合酶無法在鹽單胞菌中正常表達，導致該誘導系統(tǒng)在鹽單胞菌中失效[22]。為了在鹽單胞菌中建立有效的誘導系統(tǒng)，研究者用異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導類T7 RNA 聚合酶的表達，建立了類T7啟動子受IPTG調控的誘導系統(tǒng)，用類T7 啟動子表達外源基因，在一定范圍內，IPTG 的濃度越高，外源基因的表達強度越強[22][圖1(d)]。該系統(tǒng)已經用來在H. bluephagenesis中控制細胞形態(tài)[22-23]和生產PHA[18,24-25]。

3 嗜鹽微生物作為生物合成的底盤細胞

作為下一代工業(yè)生物技術的底盤細胞，嗜鹽微生物具備高效、大量合成多種產品的能力，這些產品包括多種聚羥基脂肪酸酯（PHA）、蛋白質和小分子化合物（表2）。

表2 嗜鹽微生物合成多種產品

3.1 PHA的合成

圖2 聚羥基脂肪酸脂（PHA）結構式

聚羥基脂肪酸酯簡稱PHA，是由100～30000個羥基脂肪酸聚合而成的一類大分子生物聚酯（圖2），PHA多由微生物天然合成，在胞內以碳源和能源貯藏物質的形式存在。PHA具有類似合成塑料的物理化學特性以及合成塑料所不具備的生物可降解性和生物相容性，因此，PHA在可降解塑料、組織工程材料、緩釋材料等方面有廣闊的應用前景[60-62]。根據組成聚合物的單體含碳原子數目的差異，PHA可以分為三類[62]：第一類是單體含3～5 個碳原子的短 鏈PHA （scl PHA）， 如 聚3- 羥 基 丙 酸 酯（P3HP）、聚3-羥基丁酸酯（PHB）、聚4-羥基丁酸酯（P4HB）、聚3-羥基戊酸酯（P3HV）及其共聚物聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯[P(3HB-co-4HB)]（P34HB）、聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯[P(3HBco-3HV)]（PHBV）等；第二類是單體含6個碳原子以上的中長鏈PHA（mcl PHA），如聚3-羥基己酸酯（PHHx）、聚3-羥基辛酸酯（PHO）及其共聚物聚3-羥基己酸-3-羥基辛酸酯[P(3HB-co-3HO)]等；第三類是短鏈PHA 和中長鏈PHA 的共聚物（sclco-mcl PHA），如聚3-羥基丁酸-3-羥基癸酸酯[P(3HB-co-3HD)]、聚3-羥基丁酸-3-羥基十二烷酸酯[P(3HB-co-3HDD)]等。

很多嗜鹽微生物可以天然合成PHA，這為以嗜鹽微生物為底盤細胞進行的PHA 工業(yè)生產提供了優(yōu)勢。Halomonas sp. YLGW01 可以用果糖生產PHB，產量達到細胞干重的94.6%，與以葡萄糖為碳源相比，以果糖為碳源生長的Halomonas sp.YLGW01細胞更大、更長，細胞長度從葡萄糖培養(yǎng)的2.34μm 提高到果糖培養(yǎng)的8.39μm[34]。Haloferax mediterranei 可以以淀粉為碳源生產PHBV，產量達到細胞干重的50.8%，3HV 摩爾分數為10.4%[41]。H.mediterranei可以生產PHBV的隨機共聚物或者高階共聚物，通過改變葡萄糖和戊酸鹽的比例，可以調控3HV 的摩爾分數[42]。與普通微生物合成的PHBV和PHB以及醫(yī)用級材料PLA相比，這種嗜鹽微生物合成的PHBV有更好的生物相容性和生物可降解性[63]，敲除該嗜鹽菌表多糖合成相關的基因簇還可以將PHBV 的產量提高約20%[64-65]。Halomonas boliviensis 可以在含有0～25% NaCl、pH=6～11 的環(huán)境中生長[29]，并利用葡萄糖、淀粉水解物、蔗糖、木糖或農業(yè)殘渣等多種碳源合成PHB[28-30]，其細胞干重可達到44g/L，PHB 含量為81%，PHB 生產率為1.1g/(L·h)[33]。Vibrio proteolyticu 可 以 在 含 有5%NaCl 的培養(yǎng)基中積累PHB，其最高PHA 含量為54.67%，細胞干重為4.948g/L[26]。

工程改造以后，下一代工業(yè)生物技術的重要底盤細胞H.bluephagenesis 和H.campaniensis 具備大量積累多種PHA的能力。在56h半連續(xù)發(fā)酵中，野生型菌株H.bluephagenesis TD01的細胞干重可以達到80g/L，PHB 含量占細胞干重的80%[31]。重組型鹽單胞菌Halomonas campaniensis LS21 可以在添加了廚余垃圾等廢料的海水中進行65d的開放式、非滅菌、連續(xù)發(fā)酵，積累的PHB 達到細胞干重的70%[32]。用分子生物學手段改造H.bluephagenesis和H. campaniensis 可以有效提高其合成的PHA 的種類、數量或者改變PHA 的積累方式。研究發(fā)現(xiàn)，H.bluephagenesis 的乙酰乙酰輔酶A 還原酶PhaB 是NADH依賴型的，因此，加入乙酸鈉、葡萄糖酸鈉等物質可以提高胞內NADH/NAD+比例，進而為PhaB 蛋白提供更多的能量，提高PHA 產量[66]；在H.bluephagenesis 內表達orfZ、4hbd、sucD 和ogA 基因可以生產P34HB，精確調控上述基因的表達強度可以有效提高P34HB 的產量和聚合物中4HB 的摩爾含量[35-36]，在7L發(fā)酵罐中改造過的H.bluephagenesis細胞干重達48g/L，P34HB產量為36g/L，占細胞干重的75%，4HB的摩爾含量可以達到16%[18]；敲除2-檸檬酸甲酯合成酶基因prpC 和琥珀酸脫氫酶組裝因子2基因sdhE、過表達甲基丙二酰輔酶A變位酶基因scpA、甲基丙二酰輔酶A 脫羧酶基因scpB和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc 的重組型H.bluephagenesis 可以生產PHBV，搖瓶中的細胞干重為6.3g/L，PHBV 含量為細胞干重的65%，3HV摩爾含量最高可達25%[24]；抑制細胞分裂環(huán)蛋白基因ftsZ 和細胞骨架蛋白基因mreB 的表達可以增大H. campaniensis LS21 的體積，為PHA 的積累提供了更多的空間[67]；敲除包涵體蛋白基因phaP 后，H.bluephagenesis 的PHA 顆粒會從多個小顆粒變成一個大顆粒[23]。

3.2 蛋白質的合成

除了合成PHA，嗜鹽微生物還可以合成多種蛋白質，例如各種酶和PHA 相關蛋白，嗜鹽微生物合成的酶不但可以在高鹽環(huán)境下行使催化功能，而且在高溫下有更強的穩(wěn)定性[68]。

Halorubrum lacusprofundi 可以合成β-半乳糖苷酶，用冷休克蛋白基因cspD2的啟動子過表達β-半乳糖苷酶基因，可以將產量提高20 倍[44]。Haloarcula marismortui 合成的乙醇脫氫酶ADH12可以在pH=10、60℃的環(huán)境中發(fā)揮催化功能[45]。Halobacterium salinarum 表達的谷氨酸脫氫酶最高可 以 在pH=10 的 環(huán) 境 下 發(fā) 揮 活 性[46]。 在Staphylococcus equorum sp. AMC7 和表面活性劑Triton X-100的刺激下，Halomonas sp.LM1C脂肪酶的產量會提高9倍，最高達3000U/L[47]。Haloferax sp.HA10 產生的淀粉酶可以在pH=5～9、NaCl 濃度為0.5～3mol/L 環(huán)境中催化淀粉水解，在55℃的環(huán)境中，該淀粉酶活性保持在99%[48]。H.bluephagenesis可以生產PHA 包涵體蛋白PhaP 和PHA 調控蛋白PhaR，PhaP 蛋白具有調控PHA 顆粒的形成的功能，在H.bluephagenesis 中的最高產量為1.86g/L[49]，PhaR蛋白對脂類分子有乳化作用，H.bluephagenesis生產的PhaR 耐高溫，經過98℃、105℃和115℃處理20min后，PhaR蛋白仍然可以發(fā)揮活性[50]。

3.3 小分子化合物的合成

嗜鹽微生物還可以合成控制小分子化合物合成的酶，進而合成小分子化合物。

四氫嘧啶對維持微生物滲透壓平衡起著重要作用，嗜鹽微生物生長在高滲透壓的環(huán)境中，所以會合成大量的四氫嘧啶，四氫嘧啶的合成主要依靠L-2,4-二氨基丁酸二酸鹽乙酰轉移酶基因ectA、L-2,4-二氨基丁酸二酸鹽氨基轉移酶基因ectB和四氫嘧啶合成酶基因ectC。在H.bluephagenesis中進行精確的代謝流調控，調整ectABC 和其他上游基因的表達強度，可以有效提高四氫嘧啶的產量，在7L發(fā)酵罐中得到28g/L四氫嘧啶或者聯(lián)產8g/L四氫嘧啶和24g/L PHB，其中PHB占細胞干重的75%[51]。在Halomonas elongate DSM 2581T中，四氫嘧啶轉運蛋白TeaABC 將四氫嘧啶從胞內轉移到胞外[52]，用含15%和3% NaCl 的培養(yǎng)基交替培養(yǎng)H. elongate DSM 142T，重復9次，可以得到155mg/g CDW四氫嘧啶[53]。Halomonas boliviensis 兩次補料發(fā)酵合成四氫嘧啶的速度為每天11.1g/L，通過改變滲透壓分泌到胞外的四氫嘧啶產量為每天9.1g/L[54]。

除了四氫嘧啶，甜菜堿也在平衡滲透壓中起著重 要 作 用 ， Actinopolyspora halophila 和Ectothiorhodospira halochloris可以以甘氨酸為底物合成甜菜堿[55]。嗜鹽微生物還可以合成萜類化合物，表達IPP異構酶基因idi、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）合成酶基因crtE、八氫番茄紅素合成酶基因crtB、八氫番茄紅素脫氫酶基因crtI 和番茄紅素環(huán)化酶基因crtY 后，H. elongate 可以在2%NaCl 中生 產560mg/g CDW β - 胡 蘿 卜 素[56]， 在H.mediterranei 中表達crtB 和crtI 基因可以生產番茄紅素，敲除番茄紅素下游代謝途徑和PHBV合成途徑后，番茄紅素的產量可以提高到119.25mg/g CDW[57]。此外，重組型H. bluephagenesis 還可以生產33g/L 的蘇氨酸[58]或0.7g/L 的5-氨基乙酰丙酸（ALA）[59]。

4 高密度下嗜鹽微生物的應用前景

高密度（細胞干重＞50g/L）培養(yǎng)是工業(yè)生物技術的難題之一，在高密度環(huán)境下，細胞的代謝更為復雜，調控更加困難，以嗜鹽菌為底盤細胞的下一代工業(yè)生物技術在高密度培養(yǎng)方面有應用前景。嗜鹽微生物H. bluephagenesis TD01 或者其衍生菌株可以進行的開放式、非滅菌的連續(xù)發(fā)酵，已經完成了7L實驗室小試、1000L和5000L工業(yè)生物反應器中試，在5000L 中試中，細胞干重達到100g/L，P[3HB-co-13.5% （摩爾分數） 4HB]含量達到60.4%[31,69]。但是，高密度下的細胞代謝更為復雜、基因誘導表達更為困難、耗能更大、穩(wěn)定性更低，因此，研究并解決“高密度壁壘”對下一代工業(yè)生物技術的完善和發(fā)展有著重要的意義。

4.1 高密度下多代謝模塊高效調控

在嗜鹽微生物發(fā)酵培養(yǎng)時，在不同生長時期進行取樣，對每個取樣點進行轉錄組和蛋白組檢測，可以獲得不同生長時期細胞RNA 和蛋白質的表達情況，以及RNA 和蛋白質在不同生長時期的動態(tài)變化過程，根據這些信息可以解析高密度下嗜鹽菌的代謝調控網絡，結合生物量、生長趨勢、膜組分、ATP需求量等關鍵參數，可以建立這些參數與基因轉錄和蛋白質表達在不同生長時期的關系網絡，根據這些信息解析嗜鹽微生物在高密度時期的代謝特點，而后對所表達的代謝通路進行適宜的表達調控，使得代謝調控將更加精確高效[70-71]。

4.2 高密度可誘導強啟動子的開發(fā)與細胞體積調控

根據不同生長時期的轉錄組和蛋白組測序結果，還可以分析出嗜鹽微生物各基因表達強度隨生長情況變化的規(guī)律，從而找到在低密度情況下表達水平低，而在高密度情況下表達水平高的啟動子，這樣的啟動子可以被高密度條件誘導。用這樣的高密度可誘導啟動子調控細胞分裂環(huán)蛋白基因ftsZ或者細胞骨架蛋白基因mreB 的表達，在高密度條件下實現(xiàn)對細胞體積的調控，使細胞響應高密度信號，體積變大，這有利于PHA 的積累和發(fā)酵結束后將細胞從發(fā)酵液中分離、進行下游工業(yè)環(huán)節(jié)[67]。

4.3 高密度下節(jié)能和高轉化率

在高密度條件下細胞能獲取的氧氣會減少，能量供給隨之降低，為了解決這一問題，可以通過敲除嗜鹽微生物細胞外膜、在嗜鹽微生物胞內或者細胞膜上表達透明顫菌血紅蛋白VHb 等方式增加細胞獲取氧氣的能力[72]，還可以在高密度條件下抑制三羧酸循環(huán)、引入外源的糖酵解途徑，使得代謝流通往無氧呼吸途徑，消耗NADH，為細胞提供能量，提高能量轉化效率，保持嗜鹽微生物在高密度條件下合成產物的能力。

4.4 高密度下酶的穩(wěn)定性調控

為了降低各產物合成酶在高密度下的降解，提高高密度下產物的合成能力，可以通過定向進化等方式，對相關合成酶進行改造，提高合成酶的穩(wěn)定性，或者突變蛋白酶，抑制其降解PHA 合成酶的能力，最終提高高密度下嗜鹽微生物合成PHA 等產物的能力[73]。

5 結語

由于嗜鹽微生物的發(fā)酵節(jié)水、節(jié)能、無需滅菌、過程連續(xù)，以嗜鹽微生物為底盤細胞的下一代工業(yè)生物技術有廣闊的發(fā)展前景（圖3）。“下一代工業(yè)生物技術”將以嗜鹽微生物等極端微生物為底盤細胞，利用海水、普通碳源、秸稈、廚余垃圾等特殊碳源進行無滅菌、開放式和連續(xù)發(fā)酵，在發(fā)酵的中后期，誘導嗜鹽微生物發(fā)生形變以便于菌體的分離，沉降的菌體可以用來提取PHA 等產物，發(fā)酵液可以回收重復使用，或者還可以用一株嗜鹽菌同時生產多種產物，從發(fā)酵液和菌體中同時獲得產品。此外，結合新興的人工智能（AI）技術，“下一代工業(yè)生物技術”還將打造“無人車間”，自動控制上述生產過程，最終實現(xiàn)PHA、蛋白質、小分子化合物等各類產物的簡易、高效、低價生產。

圖3 以嗜鹽微生物為底盤細胞的下一代工業(yè)生物技術構想