王穎，曲俊澤，梁楠，郝鶴，元英進

（1 天津大學(xué)教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津300072；2 天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津300072；3 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

類胡蘿卜素（carotenoids）是一類由類異戊二烯聚合物構(gòu)成的天然色素，較為常見的是C40骨架的番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、蝦青素、辣椒紅素等四萜類化合物[1]。由于類胡蘿卜素碳骨架結(jié)構(gòu)中的共價多烯結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易通過非特異性（光氧化、化學(xué)氧化）和特異性的方式發(fā)生裂解，進而又可以生成許多脫輔基類胡蘿卜素[2]，例如β-紫羅酮、β-環(huán)檸檬醛、藏紅花酸等[3-4]。同時，這種共價多烯結(jié)構(gòu)還賦予了類胡蘿卜素產(chǎn)品豐富的顏色（紅色、橘色、黃色）和超強的抗氧化活性，因此多被應(yīng)用于功能營養(yǎng)品、化妝品、食品添加劑、動物飼料等領(lǐng)域[5]。據(jù)報道[5-6]，類胡蘿卜素全球市場價值在2018 年已達(dá)到15 億美元，預(yù)計2022 年將增至20 億美元。隨著類胡蘿卜素市場需求的急劇增長，直接提取的產(chǎn)率低以及化學(xué)合成產(chǎn)品結(jié)構(gòu)特異性差的問題也越來越凸顯[5]。而微生物發(fā)酵法可利用廉價的碳源合成構(gòu)型、活性同天然提取的類胡蘿卜素一致的產(chǎn)物，是傳統(tǒng)生產(chǎn)模式的重要補充。此外，由于類胡蘿卜素具有顏色這一特征，還可作為篩選和指示標(biāo)簽在合成生物學(xué)方法和工具開發(fā)中得以應(yīng)用，例如，顯示類異戊二烯合成路徑和競爭路徑的通量[7-8]、示蹤病原體[9]、監(jiān)控血液中鋅離子的濃度[10]等。因此，構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠合成類胡蘿卜素逐漸成為合成生物學(xué)的研究熱點。

合成生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展也極大推動了類胡蘿卜素及脫輔基類胡蘿卜素等產(chǎn)品在大腸桿菌（Escherichia coli）、 釀 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae）、耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica）等常用底盤中的高效合成（表1）。類胡蘿卜素的生物合成路徑以最基本的C5單元異戊烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate, IPP）/二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate,DMAPP）為節(jié)點，分為上游和下游路徑。上游路徑包含來自于真核生物和古細(xì)菌的甲羥戊酸（mevalonate, MVA）路徑及來源于原核微生物和植物質(zhì)體的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4- 磷酸（2-C-methy1-D-erythrito1-4-phosphate,MEP）路徑。下游路徑以IPP 和DMAPP為起始，通過多步異戊二烯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)縮合生成C20的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphat，GGPP）。兩分子GGPP繼續(xù)縮聚形成C40的四萜骨架，之后經(jīng)過連續(xù)多步脫氫、環(huán)化、羥基化、酮基化、氧化裂解等修飾反應(yīng)合成多種類胡蘿卜素及其衍生物（圖1）。在異源底盤中構(gòu)建類胡蘿卜素合成路徑，常采用過表達(dá)MVA 或MEP途徑蛋白[11-13]、表達(dá)N 端截短的羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶（tHMGR1）[14-15]、改造內(nèi)源中心代謝[16-18]等萜類產(chǎn)物合成的通用策略，以提高前體IPP/DMAPP 的供給。值得注意的是，有別于其他萜類產(chǎn)品，類胡蘿卜素的合成需要強化前體GGPP的供應(yīng)和利用。而多數(shù)IPP/DMAPP 下游路徑蛋白具有較為寬泛的底物選擇性和催化多步連續(xù)反應(yīng)的能力[19]，易于形成代謝瓶頸，積累代謝中間體。且類胡蘿卜素產(chǎn)品強還原性[20-21]和質(zhì)膜插入積累[22]的特點常給底盤細(xì)胞帶來脅迫壓力，成為提高該類產(chǎn)品合成水平的重要限制因素。

表1 構(gòu)建類胡蘿卜素細(xì)胞工廠示例

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 類胡蘿卜素生物合成路徑

由于類胡蘿卜素具有顏色，可直接通過觀察菌落表型[39]、檢測發(fā)酵產(chǎn)物吸光度[40]、拉曼光譜分析等手段[41]，挑選出高產(chǎn)菌株。且類胡蘿卜素的強還原性使其具有拮抗活性氧（reactive oxygen species,ROS）的能力[42]，從而使過氧化氫添加成為篩選高產(chǎn)量的選擇壓力。因此，通過在元件、模塊以及底盤水平上產(chǎn)生遺傳多樣性，并結(jié)合顏色篩選或氧化壓力選擇，可以便捷地挑選或富集利于產(chǎn)物積累的個體。這一策略的實施減少了理性設(shè)計的工作量，有效加速了類胡蘿卜素細(xì)胞工廠的構(gòu)建進程和對產(chǎn)物合成瓶頸問題的突破，并為后續(xù)理性優(yōu)化策略提供靶點信息。本文將從路徑的快速構(gòu)建和底盤的定向進化兩個角度，系統(tǒng)綜述類胡蘿卜素細(xì)胞工廠的非理性設(shè)計策略在調(diào)控代謝流和緩解產(chǎn)物脅迫壓力中的應(yīng)用，以期為微生物細(xì)胞工廠中合成其他高附加值產(chǎn)物提供指導(dǎo)和借鑒。

1 合成路徑的快速構(gòu)建

構(gòu)建類胡蘿卜素細(xì)胞工廠涉及多模塊的組裝。除根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品選擇GGPP 合成酶（CrtE 或GGPPS）、八氫番茄紅素合成酶（CrtB）、八氫番茄紅素脫氫酶（CrtI）、番茄紅素環(huán)化酶（CrtY）、β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）、β-胡蘿卜素酮化酶（CrtW）等催化元件，有時還需引入異源MVA 路徑[43-44]、 構(gòu)建非天然異戊烯醇利用途徑（isopentenol utilization pathway， IUP）[45]和類異戊二烯醇合成途徑（isoprenoid alcohol pathway，IPA）[46]，以解除代謝中間體的反饋抑制，增強NADPH 和ATP 的合成，提高前體的供給。類胡蘿卜素產(chǎn)品的高水平合成需要最大限度地增加從底物到目標(biāo)化合物的代謝通量，同時盡量減少不必要的副產(chǎn)品或代謝中間體的積累。因此，需獲得最優(yōu)的催化元件，并從催化特性和表達(dá)水平兩個維度進行模塊與模塊的組合適配（圖2）。

1.1 路徑模塊間催化性能的適配

1.1.1 關(guān)鍵催化元件的篩選和定向進化

類胡蘿卜素產(chǎn)品的高水平合成需要最大限度地增加從底物到目標(biāo)化合物的代謝通量，同時盡量減少不必要的副產(chǎn)品或代謝中間體的積累。CrtE、CrtI、CrtZ和CrtW是公認(rèn)的途徑限速酶。上述蛋白因具有較為寬泛的底物選擇性常催化多步連續(xù)反應(yīng)。而不同物種來源的催化元件在催化活性和底物選擇性上存在較大差異[47]。例如，多數(shù)GGPPS以法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）為底物，而少數(shù)GGPPS 可以直接利用IPP 和DMAPP 生成GGPP[38,48]。在酵母底盤中，后者可以有效避免與內(nèi)源固醇合成競爭FPP 而具有更多的底物來源。不同生物源的CrtI在催化多步連續(xù)脫氫反應(yīng)時，會展現(xiàn)出不同的反應(yīng)步數(shù)，最終影響目標(biāo)化合物在總類胡蘿卜素產(chǎn)品中的占比[49]。CrtZ 和CrtW 分別催化兩步羥基化和兩步酮基化反應(yīng)，形成β-胡蘿卜素到蝦青素的復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)。此二者催化元件的底物選擇差異決定了反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中代謝中間體的轉(zhuǎn)化速率[50]。因此，組合篩選不同來源的路徑催化元件是提高類胡蘿卜素合成路徑通量、減少代謝中間體積累的有效手段[17,51]。通過對篩選結(jié)果的分析，還可獲得影響路徑整體通量和代謝瓶頸產(chǎn)生的關(guān)鍵催化元件，為后續(xù)路徑的進一步優(yōu)化提供了工程化的靶標(biāo)。例如，Wang 等[52]從高等植物、藻類、真菌、細(xì)菌中選擇蝦青素合成路徑上的關(guān)鍵酶CrtZ/CrtW進行復(fù)配組裝，并表達(dá)于β-胡蘿卜素高產(chǎn)的酵母底盤中。通過挑選平板上顏色深紅的菌株并輔以發(fā)酵驗證，獲得最佳的CrtZ/CrtW 來源組合，使蝦青素在釀酒酵母中的發(fā)酵罐水平產(chǎn)量達(dá)到了81mg/L，為當(dāng)時最高產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上對CrtZ/CrtW 的進化距離與蝦青素產(chǎn)量間的關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)CrtW的進化距離越短，蝦青素的產(chǎn)量越高（R2=0.6755），因此CrtW是影響β-胡蘿卜素到蝦青素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白。

以靶標(biāo)催化元件的DNA 序列為模板進行易錯PCR，形成突變文庫并在宿主底盤中予以表征。通過顏色篩選，可獲得符合預(yù)期催化活性和反應(yīng)特異性的突變體，以用于路徑組裝（圖2）。例如，Xie等[27]通過易錯PCR對CrtE和雙功能酶CrtYB進行協(xié)同進化。利用顏色篩選出紅色更深的菌株，獲得了環(huán)化功能失活保留八氫番茄紅素合成功能的CrtYB突變體，并增強了CrtE 對番茄紅素合成的促進能力，最終番茄紅素在釀酒酵母中的產(chǎn)量達(dá)到了1.61g/L（24.41mg/g DCW）。Zhou 等[53]通過CrtW 的定向進化，加速β-胡蘿卜素向角黃素的轉(zhuǎn)化，最終使蝦青素在釀酒酵母中的產(chǎn)量達(dá)到了47.18mg/L（8.10mg/g DCW）。同樣通過易錯PCR 協(xié)同進化CrtZ 和CrtW，使蝦青素在釀酒酵母中的發(fā)酵罐產(chǎn)量進一步提升至235mg/L[16]。

1.1.2 調(diào)節(jié)催化路徑

自然界中存在一些用于類胡蘿卜素合成的雙功能酶，按催化順序銜接的兩個酶，其活性中心之間構(gòu)成底物通道。在底物通道的作用下可使局部底物濃度趨于飽和，使得在連續(xù)催化反應(yīng)過程中加速反應(yīng)底物與酶的接觸，消除底物的競爭性消耗，減少旁路副反應(yīng)[54]。借鑒這種天然的催化路徑調(diào)控機制構(gòu)建蛋白復(fù)合體，可拉近兩個催化單元的蛋白活性中心，增強底物可獲得性，調(diào)控催化路徑。類胡蘿卜素的合成通常涉及多個異源蛋白的共表達(dá)，構(gòu)建IDI和CrtE的蛋白復(fù)合體，可增加IPP和DMAPP直接向GGPP 的轉(zhuǎn)化，減少競爭性FPP 的合成[55]；構(gòu)建CrtE/CrtB/CrtI 的蛋白復(fù)合體，可加速多酶級聯(lián)反應(yīng)速率，促進GGPP 向番茄紅素轉(zhuǎn)化[56]；構(gòu)建CrtY 和CrtZ 的蛋白復(fù)合體，則有利于玉米黃質(zhì)的合成[24]。蛋白融合[57]、蛋白支架[56]和蛋白自組裝[55,58]等是構(gòu)建蛋白復(fù)合體的常用手段。其中蛋白融合方向、linker 的類型、蛋白的比例等均是可工程化操作產(chǎn)生遺傳多樣性文庫的靶標(biāo)，直接影響催化路徑的調(diào)控效果（圖2）。例如，Nogueira 等[59]通過在大腸桿菌中對不同柔性linker 長度下CrtZ-CrtW 正反向融合進行篩選，獲得最佳的CrtZ-CrtW融合蛋白以用于煙草中蝦青素的合成。

1.2 路徑模塊間表達(dá)水平的適配

1.2.1 最適表達(dá)方式的篩選

通過調(diào)節(jié)模塊的表達(dá)水平來平衡模塊間代謝流的通量，也可達(dá)到弱化途徑瓶頸的目的[23]。在調(diào)整表達(dá)強度時，多考慮調(diào)控模塊拷貝數(shù)[60]、染色體整合位置[61]、啟動子強度[62]、模塊排列的位置和方向[63]等因素。其中，工程化模塊在宿主中的質(zhì)粒表達(dá)和染色體整合是篩選模塊最佳拷貝數(shù)的主要手段（圖2）。多拷貝質(zhì)粒在不同的底盤個體中拷貝數(shù)存在較大差異。利用這一特點，將路徑中每一模塊分別克隆到不同質(zhì)粒進行表達(dá)，可較為便捷地建立強度多樣化的模塊表達(dá)文庫，平衡不同模塊的表達(dá)水平[64-65]。在此基礎(chǔ)上復(fù)配強度不同的啟動子可增加文庫的多樣性[66]。通過調(diào)控質(zhì)粒的復(fù)制起始位點，可調(diào)控質(zhì)粒的拷貝數(shù)，以增加所克隆模塊表達(dá)強度的動態(tài)范圍[67]。為增強質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可在表達(dá)載體上引入毒素-抗毒素系統(tǒng)[25]或回補基因組缺陷的必需基因[68]，并通過調(diào)控上述功能標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)質(zhì)?？截悢?shù)。

為實現(xiàn)路徑模塊的穩(wěn)定表達(dá)，類胡蘿卜素合成途徑的構(gòu)建仍多采用底盤基因組整合的方式。模塊在基因組的插入位置和拷貝數(shù)，決定了路徑模塊整體表達(dá)水平的高低，從而直接影響類胡蘿卜素合成路徑的通量。因此，通過進行染色體多位點隨機整合可以產(chǎn)生路徑模塊表達(dá)文庫，結(jié)合高通量篩選也可得到類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株[圖3(a)]。其中，δ-位點整合是釀酒酵母中最常用的基因組多位點隨機整合方法[52]。Yamada 等[69]通過依次進行CrtE、CrtYB和CrtI的δ-位點整合，構(gòu)建β-胡蘿卜素合成路徑。CRISPR 技術(shù)的引入可通過靶向雙鏈斷裂來顯著提高同源整合的效率，避免選擇性標(biāo)簽的使用。Ronda 等[70]開發(fā)了一種名為CrEdit（CRISPR/Cas9 mediated genome editing）的方法，以一步轉(zhuǎn)化實現(xiàn)模塊的多拷貝整合，應(yīng)用于釀酒酵母中β-胡蘿卜素的合成路徑組裝。Hou 等[71]設(shè)計了一個名為“wicket”的DNA 表達(dá)盒。該表達(dá)盒在經(jīng)核酸酶處理后可接受外源基因，并將其整合到釀酒酵母基因組的指定位點，以實現(xiàn)β-胡蘿卜素的合成路徑中各個模塊在基因組的隨機拷貝數(shù)整合。在耶氏解脂酵母中應(yīng)用CRISPR技術(shù)需敲除KU70，以抑制非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），提高同源重組效率[13]。而Cui 等[72]則利用耶氏解脂酵母較強的NHEJ，開發(fā)了非同源性依賴的多模塊隨機整合的方式，以建立模塊表達(dá)水平文庫，篩選β-胡蘿卜素的高產(chǎn)菌株。

1.2.2 最適啟動子序列的篩選

篩選不同強度的天然啟動子[25]，或者通過啟動子工程人工構(gòu)建強度不同的啟動子文庫[73]，可用于路徑模塊相對表達(dá)強度的平衡（圖2）。例如，Wu等[74]通過操縱基因啟動子RBS序列和起始密碼子序列，建立路徑基因表達(dá)文庫，平衡模塊間的表達(dá)水平，在大腸桿菌中構(gòu)建玉米黃質(zhì)的生產(chǎn)路徑（產(chǎn)量為6.33mg/L, 1.24mg/g DCW）。Larroude 等[62]通過篩選每個轉(zhuǎn)錄單位的最佳啟動子-基因?qū)?，最終使耶氏解脂酵母中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到了6.5g/L（89.6mg/g DCW）。大腸桿菌啟動子中通常可用于編輯產(chǎn)生啟動子強度多樣性文庫的順式元件，包括核 糖 體 結(jié) 合 位 點 （ribosome binding site，RBS）[16,39]、RBS 序列與基因翻譯起始位點之間的間隔序列（aligned spacing sequence，AS）[75]、起始密碼子序列[74]等。此外，對于原核底盤，可通過設(shè)計“可調(diào)控基因間序列”（tunable intergenic regions,TIGRs），獲得長度、GC含量、莖環(huán)結(jié)構(gòu)多樣性的原核操縱子內(nèi)基因間序列；還可以通過篩選mRNA二級結(jié)構(gòu)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄單元的穩(wěn)定性，同時獲得一個操縱子內(nèi)多個基因的最優(yōu)表達(dá)水平[76-77]。Shen等[24]應(yīng)用可調(diào)控基因間序列，在大腸桿菌中平衡異源MVA 路徑蛋白表達(dá)，最終使玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到722.46mg/L（23.16mg/g DCW）。

酵母中則通過不同啟動子核心區(qū)序列和上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的雜合以及不同拷貝數(shù)UAS 的串聯(lián)，形成表達(dá)強度梯度更精細(xì)的啟動子文庫[78-79]。引入正交化的異源轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控系統(tǒng)也可構(gòu)建不同表達(dá)強度的啟動子文庫[80]。例如，Cuperus等[81]基于大腸桿菌tet操縱子，使用與轉(zhuǎn)錄激活因子TetR-VP16親和力不同的tetO序列構(gòu)建啟動子文庫，優(yōu)化番茄紅素合成路徑中CrtE、CrtB 與CrtI 的表達(dá)。在篩選路徑模塊的最佳啟動子序列時，常采用Ⅱ型限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的組裝策略[圖3(b)]，例如，Golden Gate DNA 組裝[37]、YeastFab 組裝[82]等。COMPASS 方法（combinatorial pathway assembly）利用營養(yǎng)缺陷標(biāo)記和抗性標(biāo)記分別在大腸桿菌和釀酒酵母中建立正交化的克隆篩選體系，以克隆片段中的啟動子開啟載體上標(biāo)簽序列的轉(zhuǎn)錄[圖3(b)]，從而在迭代轉(zhuǎn)化篩選的過程中避免了反復(fù)進行PCR 驗證和測序驗證等一系列繁瑣的操作過程，有效縮短了組裝周期[80]。

1.3 模塊間的多因素組合適配

理論上若要取得模塊與模塊的最佳適配效果，需對每個催化元件的序列、拷貝數(shù)、表達(dá)水平以及所有元件的排列方式進行多因素的篩選。這需要相當(dāng)龐大的構(gòu)建工作量以滿足文庫所需的覆蓋度?；贑re/loxp 位點特異性重組系統(tǒng)所建立的一系列SCRaMbLE （synthetic chromosome rearrangement and modification by LoxPsym-mediated evolution）方法可有效解決這一問題。體外基因重排[體外SCRaMbLE，圖3(c)]，在體外由Cre 重組酶介導(dǎo)多個含LoxPsym位點的外源模塊任意隨機組合，形成質(zhì)粒文庫導(dǎo)入底盤細(xì)胞進行目標(biāo)產(chǎn)品的顏色篩選。該方法可同時對催化元件的來源、拷貝數(shù)以及排列位置與方向進行篩選，并成功應(yīng)用于β-胡蘿卜素合成途徑通量的優(yōu)化[83]。SCRaMbLE-in[圖3(c)]同時具有體外正交化的重組酶工具包與體內(nèi)基因組重組系統(tǒng)，體外重組系統(tǒng)建立模塊多樣化的啟動子文庫，體內(nèi)重組系統(tǒng)產(chǎn)生基因組不同位置的整合[84]。Qi等[85]綜合上述兩種方法的優(yōu)勢建立體外和體內(nèi)重組系統(tǒng)，以篩選CrtZ/CrtW 的最佳來源組合、拷貝數(shù)和染色體整合位置，使釀酒酵母中蝦青素?fù)u瓶水平產(chǎn)量達(dá)到了6.05mg/g DCW。

模塊化代謝工程 （modular metabolic engineering，MME）[86]將路徑中所涉及的催化單元按一定規(guī)則聚類分組，將每一組中所有的催化單元的表達(dá)盒子視為一個模塊。該方法只涉及平衡模塊間的表達(dá)水平，以降低路徑構(gòu)建的復(fù)雜性。多維啟發(fā) 式 過 程 （multidimensional heuristic process，MHP）不僅按MME 的思想通過篩選表達(dá)載體和不同強度的啟動子對整個模塊的表達(dá)水平進行適配，還增加對模塊內(nèi)部關(guān)鍵催化元件的序列優(yōu)化（物種來源篩選和酶工程改造） 及啟動子順式元件（RBS、5'-UTRS）的篩選，以實現(xiàn)同時從催化活性和表達(dá)強度兩個角度進行模塊與模塊的多因素適配[87]。Zhang 等[87]基于該思想將從乙酰-CoA 起始的蝦青素合成路徑以MVA、DMAPP、β-胡蘿卜素為結(jié)點分為四個模塊進行模塊間適配，并對由CrtZ/CrtW 組成的第四個模塊進行內(nèi)部催化元件的再次適配，使大腸桿菌中蝦青素產(chǎn)量達(dá)到320mg/L（15.1mg/g DCW）。

圖3 模塊間適配的組裝策略

2 底盤細(xì)胞不同尺度的DNA變異與進化

類胡蘿卜素的長鏈異戊二烯基結(jié)構(gòu)使其具有強疏水性。除蝦青素被報道在兩相培養(yǎng)時會有部分產(chǎn)物富集于胞外油相[88]，大多數(shù)缺乏親水基團的類胡蘿卜素（例如番茄紅素、β-胡蘿卜素等）在胞內(nèi)積累后會附著在生物膜上，并以線性形式嵌入磷脂雙分子結(jié)構(gòu)中，進而破壞膜結(jié)構(gòu)、干擾細(xì)胞膜的正常生理功能[89]。作為儲存類胡蘿卜素的主要場所，有限的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)還限制了目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量的提升空間。此外，類胡蘿卜素的強還原性還會觸發(fā)底盤脅迫響應(yīng)，提高胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，進一步危害細(xì)胞生長[20,90]。利用誘導(dǎo)性啟動子的時序調(diào)控解耦生產(chǎn)菌株的生長與生產(chǎn)[29,63,91]、工程化轉(zhuǎn)運蛋白[92]和膜囊泡轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[93]促進類胡蘿卜素外排、調(diào)節(jié)質(zhì)膜磷脂組分弱化膜系統(tǒng)壓力[94-95]、促進原核底盤聚β-羥丁酸顆粒（PHB）[96]和真核底盤脂質(zhì)體[14,36-37]對類胡蘿卜素的存儲與隔絕等理性設(shè)計手段可以在一定程度上緩解類胡蘿卜素合成對底盤生長的影響。例如，通過脂質(zhì)工程與傳統(tǒng)代謝工程結(jié)合，構(gòu)建的工程菌番茄紅素單位細(xì)胞產(chǎn)量通過高密度培養(yǎng)后可達(dá)到73.3mg/g DCW[14]。但對類胡蘿卜素最終產(chǎn)物的產(chǎn)出仍具有局限性的問題。

細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，如基因網(wǎng)絡(luò)和對應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)的存在，決定了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)出必然會受到底盤細(xì)胞內(nèi)的其他各方面因素的影響。越來越多的研究表明底盤內(nèi)源非必需基因?qū)Ξ愒搭惡}卜素的合成水平有著不可忽視的影響[40,47,97]。調(diào)控非必需基因可對底盤內(nèi)環(huán)境造成擾動，有助于增加外源模塊和底盤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的適配，增強細(xì)胞對產(chǎn)物的耐受，強化代謝流向目標(biāo)路徑的流動。但理性的非必需基因調(diào)控往往受限于可操縱的靶點數(shù)目和對內(nèi)源環(huán)境的擾動范圍。因此需輔以非理性的底盤擾動策略，增加細(xì)胞的基因多樣性和相應(yīng)的表型多樣化，從而加快生產(chǎn)菌株的進化過程。對底盤的非理性擾動包含單核苷酸水平、基因水平以及基因組大片段水平不同尺度的DNA變異（圖4）。

2.1 不同尺度的DNA變異

2.1.1 單核苷酸水平下的DNA變異

單核苷酸水平的DNA 變異即為DNA 序列的堿基突變。這種突變常通過易錯PCR、誘變或攜帶堿基突變的寡聚核苷酸鏈產(chǎn)生[圖4(a)]。其中，易錯PCR 的靶點多為內(nèi)源調(diào)控因子。這種全轉(zhuǎn)錄工程（global transcription machinery engineering，gTME）策略旨在從轉(zhuǎn)錄組重構(gòu)的角度對底盤內(nèi)源環(huán)境進行擾動。例如，耶氏解脂酵母中脂質(zhì)積累與β-胡蘿卜素產(chǎn)量相關(guān)。Wang 等[98]利用易錯PCR 構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子Yl-SPT15 的突變文庫調(diào)控胞內(nèi)脂質(zhì)積累，并從中篩選出高產(chǎn)β-胡蘿卜素的菌株（產(chǎn)量較原始菌株提高了4.7 倍）。Huang 等[99]則通過篩選易錯PCR 產(chǎn)生的大腸桿菌全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CRP 突變文庫，獲得了可平衡改善菌體代謝的突變體，增強底盤對番茄紅素細(xì)胞毒性的耐受。實驗過程中常規(guī)使用的誘變手段包括物理誘變（紫外照射、γ射線等）和化學(xué)誘變（如堿基類似物、烷化劑）。近年來新興發(fā)展的常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasmas，ARTP）誘變技術(shù)具有更高的突變效率和更多的隨機突變位點[100]。Jin等[101]利用ARTP誘變技術(shù)獲得高產(chǎn)蝦青素的釀酒酵母，其產(chǎn)量達(dá)到了217.9mg/L（13.8mg/g DCW），并獲得促進蝦青素積累的新靶標(biāo)基因。多元自動化基因組工程（multiplex automated genome engineering，MAGE）通過設(shè)計含有突變的寡聚核苷酸鏈進行基因組多位點同步替換，以實現(xiàn)精確的基因組多靶點定位以及局部堿基的精準(zhǔn)變異，該技術(shù)成功應(yīng)用于提高番茄紅素在大腸桿菌中合成水平的研究中[102]。但在釀酒酵母中，MAGE技術(shù)由于寡聚核苷酸鏈同源重組的問題，無法精確進行靶點定位和基因編輯。Barbieri 等[103]所開發(fā)的改進版真核生物多重基因組工程（eukaryotic multiplex genome engineering,eMAGE）基于酵母DNA 復(fù)制機制，設(shè)計與復(fù)制叉中滯后鏈互補的寡聚核苷酸鏈引入堿基突變，從而在避免雙鏈斷裂的情況下實現(xiàn)精確的堿基變異。利用該方法對β-胡蘿卜素合成路徑每一個催化元件的啟動子、編碼序列、終止子引入遺傳變異，進而篩選影響八氫番茄紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素等積累水平的突變。

圖4 底盤定向進化策略

2.1.2 基因水平的DNA變異

基因水平的DNA 變異是指基因轉(zhuǎn)錄的激活、抑制以及因插入、刪除而造成的基因失活。表達(dá)底盤cDNA 文庫[104]、使用非必需基因單敲文庫[40]、轉(zhuǎn)座子[105]以及CRISPR-Cas9系統(tǒng)[12]，均可實現(xiàn)基因水平的DNA 變異，從而篩選底盤中影響類胡蘿卜素積累的靶點。但上述策略大多只能實現(xiàn)一種基因調(diào)控效果。Lian 等[106]基于CRISPR 組裝策略所開發(fā)的CRISPR-AID (CRESPR combining transcriptional activation, transcriptional interference, and gene deletion)同時具備轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和基因刪除三種正交化功能，可實現(xiàn)平行的模塊化和高通量代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[圖4(a)]。利用這一策略成功將β-胡蘿卜素在釀酒酵母中的產(chǎn)量提高了3 倍。此外，Liu等[107]將釀酒酵母中的基因轉(zhuǎn)移到與其具有較近親緣的耶氏解脂酵母中進行體內(nèi)組裝表達(dá)，以構(gòu)建的“嵌合途徑”擾動解脂酵母底盤的內(nèi)源代謝，并結(jié)合篩選“嵌合途徑”元件的序列、組合、定位順序和拷貝數(shù)，最終將番茄紅素在解脂酵母中搖瓶水平產(chǎn)量提高到了259mg/L（約80mg/g DCW）。

2.1.3 基因組大片段水平的DNA變異

基因組大片段水平的DNA 變異主要指基因組結(jié)構(gòu)變異（structure variation，SV），即大片段DNA的缺失、重復(fù)、移位、倒置等。上述根據(jù)自然界單核苷酸多態(tài)性變異（single nucleotide polymorphism，SNP）和插入缺失變異（Insertion/deletion，InDel）而設(shè)計開發(fā)的單核苷酸水平和基因水平人工變異策略并不能實現(xiàn)基因組結(jié)構(gòu)變異或重排。基于人工酵母合成型染色體非必需基因兩端的LoxP 位點，建立體內(nèi)SCRaMbLE技術(shù)，可以設(shè)計實現(xiàn)由單基因及區(qū)段缺失、復(fù)制、易位、倒置而產(chǎn)生的基因組重排，從而對釀酒酵母進行表型進化，獲得多樣化的功能底盤細(xì)胞[圖4(a)]。Jia等[108]以β-胡蘿卜素的合成為示例，提出以“與”門開關(guān)控制基因組重排的方法，并建立多輪迭代基因組重排策略，以精準(zhǔn)動態(tài)可控的重排技術(shù)實現(xiàn)了基因組多樣化和持續(xù)快速進化，經(jīng)過了5輪重排，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了38.8 倍。Wang 等[109]以玉米黃質(zhì)的合成作為示例，提出環(huán)形染色體重排的新體系，揭示染色體結(jié)構(gòu)變異與生產(chǎn)菌株功能強化的對應(yīng)關(guān)系。

2.2 適應(yīng)性進化

適應(yīng)性進化是目前通過在特殊條件下篩選并積累具有目標(biāo)表型細(xì)胞的常見有效方法[圖4(b)]。為了適應(yīng)特殊的條件，菌株會在選擇壓力的脅迫下富集有益突變。這種突變并不局限于上述從單堿基到基因再到基因組大片段的變異尺度。近些年來，許多成功的案例表明[110-113]，適應(yīng)性進化可被應(yīng)用于改善微生物的生長并同時促進微生物中高附加值化合物的生產(chǎn)?？茖W(xué)家們通過適應(yīng)性進化策略，獲得了適應(yīng)高濃度碳源培養(yǎng)條件的一系列突變工程菌株， 如高度耐葡萄糖的寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii）和高度耐甘油的混濁紅球菌（Rhodococcus opacus），它們被證實分別在高葡萄糖濃度和高甘油濃度的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出生長改善與目標(biāo)產(chǎn)品脂質(zhì)積累[53,114]。

除營養(yǎng)脅迫外，適應(yīng)性進化實驗通常還會采用諸如高氧[111]、高溫[112]、高鹽[113]等環(huán)境脅迫因素來改善微生物性能。利用類胡蘿卜素強還原性的特性，通過在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中定期向培養(yǎng)基中添加過氧化氫產(chǎn)生氧化脅迫，可以迫使菌體增加類胡蘿卜素的產(chǎn)量以對抗氧化壓力，從而提高菌株生產(chǎn)類胡蘿卜素能力的上限。Reyes 等[42]利用該方法使釀酒酵母中類胡蘿卜素的產(chǎn)率從6mg/g DCW 提高到18mg/g DCW。Jiang等[31]將適應(yīng)性進化與ARTP誘變相結(jié)合，以ARTP誘變加速菌株變異速度，以過氧化氫壓力驅(qū)動有益突變體的適應(yīng)性富集，并通過多輪迭代誘變進化穩(wěn)定生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)表型，最終使釀酒酵母中蝦青素發(fā)酵罐水平產(chǎn)量達(dá)到404.8mg/L，并觀察到胞內(nèi)ROS 積累降低，菌株時序壽命增加的現(xiàn)象。

3 結(jié)語

因具備便于篩選的特性，非理性設(shè)計策略適用于類胡蘿卜素細(xì)胞工廠的構(gòu)建和開發(fā)，與理性設(shè)計策略相輔相成，將極大地推動類胡蘿卜素的生物合成進程。通過理性設(shè)計策略篩選路徑基因、優(yōu)化基因表達(dá)、改造底盤細(xì)胞調(diào)控靶點實現(xiàn)類胡蘿卜素的異源合成[47,97]，進一步通過非理性設(shè)計策略實現(xiàn)關(guān)鍵基因元件和底盤細(xì)胞的快速進化，平衡代謝流，實現(xiàn)類胡蘿卜素產(chǎn)品產(chǎn)量的穩(wěn)步提升[31,85]。其中以番茄紅素為代表的類胡蘿卜素產(chǎn)品在微生物中的合成產(chǎn)量已突破g/L級別（表1），有望實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。然而，為降低路徑調(diào)控和底盤優(yōu)化的復(fù)雜性、應(yīng)用多種碳源、應(yīng)對復(fù)雜非理想化的工業(yè)發(fā)酵過程并盡可能縮減生產(chǎn)成本，研究者越來越傾向于使用大腸桿菌、釀酒酵母之外的微生物作為生產(chǎn)番茄紅素等類胡蘿卜素產(chǎn)品的底盤（表2）。這些物種或具有天然的類胡蘿卜素合成路徑[115]，或善于表達(dá)異源蛋白[116]，或可光能自養(yǎng)[117]，或具備對高溫和有機溶劑的耐受性[114]等性狀。同時，煙草[59]等植物底盤也擴展到類胡蘿卜素產(chǎn)品的合成，以便從蛋白表達(dá)、翻譯后修飾以及催化環(huán)境上更加貼近產(chǎn)物的天然宿主。例如，在水稻胚乳中引入異源類胡蘿卜素合成路徑，生產(chǎn)富含β-胡蘿卜素的黃金大米（golden rice）[118-119]、橙紅色的角黃素大米和蝦青素大米[120]，獲得了一批營養(yǎng)價值高、色彩豐富的水稻新物種。

天然類胡蘿卜素除常見的C40骨架外，還存在C30、C50骨架[115]。類胡蘿卜素合成酶具有較為寬泛的底物選擇性[122]，對其中八氫番茄紅素脫氫酶進行定向進化，可獲得不同飽和度的C40類胡蘿卜素產(chǎn)品[49]；而對異戊烯基轉(zhuǎn)移酶、縮聚酶和延伸酶等進行定向進化和組合表達(dá)，還可獲得C50[123]、C60骨架[124]的非天然類胡蘿卜素[圖5(a)]。此外，對基本C5骨架單元IPP 和DMAPP 的甲基化修飾[125]以及β-環(huán)2'-羥基化修飾[126]，也進一步豐富了非天然胡蘿卜素的種類和功能[圖5(b)]。

圖5 合成非天然類胡蘿卜素

合成類胡蘿卜素細(xì)胞工廠使用非常用底盤和合成非天然產(chǎn)物的發(fā)展趨勢，增加了路徑構(gòu)建和底盤適配的難度，也更加彰顯了發(fā)展非理性設(shè)計策略的必需性。為了在大規(guī)模的突變文庫中快速高效地篩選出理想的微生物菌株，在自動化設(shè)備與快速測定方法不斷發(fā)展和完善的背景下，基于光信號與傳感器的高通量篩選策略應(yīng)運而生。研究人員開發(fā)了自動挑菌儀、移液工作站、多功能酶標(biāo)儀等自動化設(shè)備以及流式細(xì)胞術(shù)和微流控技術(shù)等高通量篩選方法[127]，它們能夠?qū)崿F(xiàn)微定量實驗和大規(guī)模分析，以其高效、精確的特點將在合成類胡蘿卜素細(xì)胞工廠的構(gòu)建與開發(fā)中發(fā)揮巨大作用。這些自動化設(shè)備與高通量篩選技術(shù)手段的發(fā)展，也將進一步豐富元件-路徑-底盤的遺傳多樣性，使研究者能夠輕松構(gòu)建并篩選多因素多維度的模塊適配文庫和底盤突變文庫。此外，計算機輔助設(shè)計[128]和機器學(xué)習(xí)[129]的引入，實現(xiàn)了異源代謝途徑設(shè)計和構(gòu)建流程的快速優(yōu)化。通過多輪的設(shè)計、構(gòu)建、測試與學(xué)習(xí)，即根據(jù)機器學(xué)習(xí)算法，計算機基于已有數(shù)據(jù)產(chǎn)生模型，從而對目標(biāo)生物過程提供預(yù)測與判斷，將傳統(tǒng)的實驗過程搬入電腦中，有助于加速了解生物系統(tǒng)及元件間的相互作用，構(gòu)建出更高效、更穩(wěn)定的人工細(xì)胞工廠。而結(jié)合了機器學(xué)習(xí)算法的全自動機器人平臺[130]，可以執(zhí)行實驗操作并即時分析數(shù)據(jù)，以迭代的方式優(yōu)化指定的生物過程，從時間、人力、物力三方面降低了實驗成本，有助于解決傳統(tǒng)分析方法應(yīng)對大規(guī)模數(shù)據(jù)采集和分析在實驗成本、多變性、偏差和認(rèn)知不全等方面的障礙。多學(xué)科的交叉融合，必定會促使路徑構(gòu)建和底盤進化向著更加自動化、智能化的方向發(fā)展。

表2 非常規(guī)微生物底盤合成類胡蘿卜素示例