劉揚(yáng)，石鳳翎，王桂花*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

隨著天然色素在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，新的天然色素的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用已成為必然趨勢(shì)[1]。真菌色素作為一類(lèi)天然色素，具有安全可靠、色澤自然，并兼顧營(yíng)養(yǎng)和保健作用而倍受人們的喜愛(ài)[2]。內(nèi)生菌是存活于活體植物中的一類(lèi)特殊微生物，在植物中廣泛存在[3]，由于內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性分泌物[4]，因此藥用植物的內(nèi)生菌具有廣闊的研究前景和藥用價(jià)值[5]。卷邊樁菇[Paxillus involutus（Batsch Fr）]屬擔(dān)子菌，生長(zhǎng)在東北、華北、西南等地區(qū)，生長(zhǎng)力旺盛，可在多品種樹(shù)下生長(zhǎng)，常用于風(fēng)寒濕痹、腰腿疼痛、手足麻木，具有良好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[6]。卷邊樁菇的提取物還具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等功效，可用于制備藥物[7]。

張妍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，卷邊樁菇菌絲分離較適宜的培養(yǎng)基配方，并且菌蓋與菌柄連接處為分離的最佳部位，并對(duì)分離株rDNA ITS片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，鑒定出分離的菌株為卷邊樁菇的純菌種。謝永生等[9]研究發(fā)現(xiàn)，懷地黃內(nèi)生真菌HR-1產(chǎn)生的紅色素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉均有不同程度的抑制效果，對(duì)大腸桿菌的抑制效果與硫酸鏈霉素的抑制效果相當(dāng)，抑菌率達(dá)95.7%。

近年來(lái)研究者多以真菌產(chǎn)色素作為研究對(duì)象，從而探討真菌色素的提取及優(yōu)化方法[10-11]，對(duì)于植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的天然色素成分組成研究甚少。因此本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)特征及基因序列分析對(duì)一株產(chǎn)紅色素卷邊樁菇內(nèi)生真菌進(jìn)行菌種鑒定，將分離的菌體純化培養(yǎng)后，對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行分析，進(jìn)一步探究?jī)?nèi)生真菌與常見(jiàn)色素的差別，為產(chǎn)色素資源的開(kāi)發(fā)和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

采用常規(guī)內(nèi)生菌分離方法，從新鮮野生卷邊樁菇菌蓋與菌桿交界處分離得到在PDA培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生紅色素的內(nèi)生真菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，煮沸15 min后過(guò)濾，加蒸餾水至1 000 mL，葡萄糖20 g、瓊脂20 g、鏈霉素100 mg/L，pH值為自然狀態(tài)。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，煮沸15 min后過(guò)濾，加蒸餾水至1 000 mL，葡萄糖20 g，鏈霉素100 mg/L，pH值為自然狀態(tài)。

1.1.3 試劑

葡萄糖、瓊脂：中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；GoldviewTM DNA染料、Taq酶、dDNTP：TaKaRa公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

BX51-P光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TanonGis—2008凝膠成像系統(tǒng)：天能科技有限公司；HYG-C多功能恒溫?fù)u床：上海一恒有限公司；HWS型智能恒溫恒濕箱：寧波東南儀器有限公司；Agilent-6890氣相色譜儀：AGILENT公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)色素內(nèi)生真菌卷邊樁菇的分離與培養(yǎng)

采新鮮卷邊樁菇，蒸餾水去除表面泥土，75%的酒精進(jìn)行表面消毒，在無(wú)菌超凈臺(tái)中用無(wú)菌刀片取菌蓋與菌桿交界處組織，切成1 cm左右，接種在PDA培養(yǎng)基上，于21℃培養(yǎng)3 d～5 d，待菌落均勻鋪滿(mǎn)平板，分離純化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

接種針取適量菌體于液氮中研磨，待菌體研磨呈粉末狀后，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取總DNA，以引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-），ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-）為上下游引物PCR擴(kuò)增其序列。擴(kuò)增體系為：20 μL總反應(yīng)體系中包括DNA模板 0.5 μL，引物 1 μL，2×MKS 10 μL，雙蒸水 8.5 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（94℃ 1 min，48℃40 s，72℃2 min），最后 72℃充分延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送至華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交Gene Bank并進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定其分類(lèi)學(xué)地位。

1.2.3 產(chǎn)色素發(fā)酵條件的優(yōu)化

由于組織塊在普通PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，因此分別添加了經(jīng)消毒滅菌后的腐殖質(zhì)、楊樹(shù)葉，每500 mL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 g，其余培養(yǎng)條件均相同，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，發(fā)酵培養(yǎng)3 d～5 d，以此來(lái)觀察菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.4 色素的提取及鑒定

1.2.4.1 色素提取

將發(fā)酵液過(guò)濾，并用蒸餾水沖洗菌體，將菌體沖洗液與發(fā)酵過(guò)濾液合并后待用。按照體積比1∶1加入乙酸乙酯除去脂溶性雜質(zhì)，將色素液濃縮至30 mL～50 mL，真空抽濾，制備色素粗提物。

1.2.4.2 色素的鑒定

稱(chēng)取250 mg凍干菌體，用液氮充分研磨，菌體粉末加入至50 mL離心管中，立即加入4 mL三氯甲烷和4 mL甲醇溶液并密封管口。搖勻后，超聲5 min，4 500 r/min離心5 min，吸取三氯甲烷萃取液，得到粗脂質(zhì)提取液。余留的殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ匦绿崛纱?，氮?dú)獯蹈煞Q(chēng)重，計(jì)算粗脂質(zhì)占菌體干重的比例。

采用三氟化硼甲酯化方法制備脂肪酸甲酯。取0.05 g油樣于10 mL試管中，加入2 mL氫氧化鈉-甲醇溶液，65℃下皂化30 min，冷卻后加入2 mL三氟化硼/甲醇溶液（1∶3，體積比），70 ℃下皂化 3 min～5 min。使用色譜純正己烷萃取脂肪酸甲酯，并用無(wú)水硫酸鈉去除痕量水分，離心（10 000 r/min，5 min），用有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣。

氣相色譜法，色譜條件：毛細(xì)管柱（CP Sil-88，60 m×250 μm×0.25 μm）。程序升溫：60 ℃保持 3 min，以5℃/min升溫至175℃，保持15min，以2℃/min升溫至220℃，保持20 min；采用火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度250℃；進(jìn)樣口溫度250℃；空氣壓力50 kPa；H2壓力 60 kPa；載氣 N2，壓力 240 kPa；進(jìn)樣體積為 1 μL。分流比：1∶100。以歸一化方法計(jì)算各脂肪酸百分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，Excel繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將斜面菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌絲生長(zhǎng)接近培養(yǎng)皿邊緣1 cm左右時(shí)可見(jiàn)菌體呈現(xiàn)紅色，菌絲光滑，菌體呈現(xiàn)蔓延式點(diǎn)狀生長(zhǎng)，均勻的爬滿(mǎn)培養(yǎng)基整個(gè)表面，有些菌落邊緣呈現(xiàn)半透明狀，真菌培養(yǎng)形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 真菌培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 Morphology of fungus culture

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增其序列長(zhǎng)為574 bp，提交Gene Bank進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖2。

圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of fungi

由圖2可知，該序列與Fusarium petersiae（NR_156397.2）的序列同源性達(dá)到98.69%，綜合其形態(tài)學(xué)特征與測(cè)序比對(duì)結(jié)果，此內(nèi)生真菌鑒定為鐮刀菌（Fusarium petersiae）。

2.3 色素發(fā)酵條件篩選結(jié)果

不同培養(yǎng)環(huán)境下菌體生長(zhǎng)速度見(jiàn)表1。

表1 不同培養(yǎng)環(huán)境下菌體生長(zhǎng)速度Table 1 Fungal growth rate under different culture environments

不同培養(yǎng)條件對(duì)內(nèi)生真菌產(chǎn)紅色素周期影響較大，使用同一環(huán)境下的腐殖質(zhì)、楊樹(shù)葉進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其產(chǎn)生紅色素的量較使用普通培養(yǎng)基明顯增多，說(shuō)明此內(nèi)生真菌在生長(zhǎng)環(huán)境相似的條件下菌體生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)生紅色素的能力強(qiáng)。

2.4 色素脂肪含量的測(cè)定及成分分析

抽濾后的菌體進(jìn)行稱(chēng)重，重復(fù)3次，脂肪含量分別為 0.075、0.080 8、0.080 8 g，其提取率分別為（30.00%、32.32%、32.32%）。采用三氟化硼甲酯化方法制備脂肪酸甲酯，其標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜結(jié)果如圖3 A所示，菌體的氣相色譜結(jié)果如圖3B。采用歸一法計(jì)算各脂肪酸百分含量，結(jié)果如表2。

由圖3和表2可知，檢測(cè)到的真菌色素集中出現(xiàn)在15 min～26 min時(shí)間段內(nèi)，根據(jù)色素脂肪酸組分進(jìn)行了初步鑒別，主要包含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酯、亞麻酸。且油酸和亞油酯的含量最多，分別為36.86%、27.84%。

圖3 各樣本的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of each sample

表2 樣品中脂肪酸成分氣相色譜鑒定結(jié)果Table 2 Gas chromatography identification results of fatty acid components in samples

3 結(jié)論與討論

卷邊樁菇是一種具有祛風(fēng)散寒，舒筋活絡(luò)功效的植物，其多糖提取物可用于制備免疫調(diào)節(jié)的藥物[12]。而內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植株相同或者相似的活性產(chǎn)物[13]，因此藥用植物內(nèi)生菌的研究在多個(gè)領(lǐng)域均具備研究?jī)r(jià)值[14-15]。目前的研究發(fā)現(xiàn)藥用植物產(chǎn)生的色素具有一定的營(yíng)養(yǎng)和保健作用[16-17]，但有關(guān)卷邊樁菇內(nèi)生真菌產(chǎn)紅色素能力的研究目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)從卷邊樁菇中分離得到一株能產(chǎn)生紅色素的內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定此內(nèi)生菌為鐮刀菌（Fusarium petersiae）。動(dòng)物體內(nèi)不能直接合成部分不飽和脂肪酸，必須從食物中獲取，而微生物中也含有不飽和脂肪酸[18]，因此本試驗(yàn)對(duì)真菌色素的脂肪酸成分進(jìn)行了分析，為產(chǎn)色素資源的開(kāi)發(fā)和研究奠定了基礎(chǔ)。

鄭青波等[19]研究發(fā)現(xiàn)，艾草分離篩選得到的內(nèi)生真菌，具有多種生理活性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在優(yōu)化了內(nèi)生真菌發(fā)酵條件后，紅色素產(chǎn)量得到顯著性提高。證明了不同培養(yǎng)條件對(duì)內(nèi)生真菌產(chǎn)紅色素周期影響較大，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用同一環(huán)境下的腐殖質(zhì)、楊樹(shù)葉進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其產(chǎn)生紅色素的量較使用普通培養(yǎng)基明顯增多，表明內(nèi)生真菌在生長(zhǎng)環(huán)境相似的條件下菌體生長(zhǎng)更加迅速，產(chǎn)生紅色素的能力更強(qiáng)。

李長(zhǎng)皓等[20]研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸中的共軛亞油酸具有預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤生成，改善超高胰島素血癥及調(diào)節(jié)免疫活性等作用。而油酸有順?lè)串悩?gòu)體，天然油酸都是順式結(jié)構(gòu)，反式結(jié)構(gòu)人體不能直接吸收，但人體自身合成的油酸不能滿(mǎn)足需要，要從食物中攝取。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)真菌色素的脂肪酸組分主要包含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酯和亞麻酸。且油酸和亞油酯的含量最多，表明內(nèi)生真菌色素可能也具有軟化血管，調(diào)節(jié)新陳代謝等作用，但其功能及應(yīng)用還需進(jìn)一步的研究。