陳炫亦, 李紹軍, 陳衛(wèi)民, 孟泉科

1.西北農(nóng)林科技大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)學(xué)院, 陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 楊凌 712100；3.三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 河南 三門(mén)峽 472000

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中，激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)是光學(xué)顯微水平上觀(guān)察生命活動(dòng)的重要工具，但是其成像模式會(huì)對(duì)樣品和熒光分子產(chǎn)生較大的影響，樣品中等焦點(diǎn)以外的熒光分子仍然會(huì)被路過(guò)的激光激發(fā)卻不參與成像，等到更換共聚焦點(diǎn)再次激發(fā)參與成像時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)光漂白而導(dǎo)致失真；在需要長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)測(cè)高靈敏活性樣品的研究中，傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡光毒性較大，會(huì)造成樣品熒光失活，無(wú)法滿(mǎn)足高保真觀(guān)測(cè)要求[1-2]。首個(gè)真正意義上的光片熒光顯微鏡(lightsheet fluorescence microscope, LSFM)，又名選擇平面光照明顯微鏡(selective plane illumination microscope, SPIM)，由Huisken等[3]在《科學(xué)》雜志上于2004年報(bào)道，距普通光片成像技術(shù)的提出(1903年)及熒光顯微鏡的誕生(1908年)已有百年。光片熒光顯微鏡作為一種新型熒光顯微鏡，采用不同于傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的成像模式，大幅降低光毒性，減少了光漂白現(xiàn)象的發(fā)生，解決了時(shí)空連續(xù)性觀(guān)測(cè)大型活體樣品內(nèi)部熒光信號(hào)成像難題。鑒于光片熒光顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值，與光片熒光顯微鏡同年誕生的《自然-方法》將其評(píng)選為建刊十年以來(lái)十大生物學(xué)領(lǐng)域新技術(shù)之一[4]。

基于此，本文簡(jiǎn)要介紹光片熒光顯微鏡的成像原理、成像特點(diǎn)以及標(biāo)志性改進(jìn)成像質(zhì)量的事件，重點(diǎn)介紹光片熒光顯微鏡在神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、動(dòng)物細(xì)胞生物學(xué)和植物科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，并對(duì)近年來(lái)代表性應(yīng)用進(jìn)行匯總，旨在幫助研究人員快速了解該顯微鏡的基本原理及其在生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，為相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供參考。

1 光片熒光顯微鏡的成像原理、特點(diǎn)與改進(jìn)

1.1 成像原理

光片熒光顯微鏡采用薄片層狀光源取代了以往熒光顯微鏡的圓柱狀光源，利用柱面鏡聚焦或快速掃描高斯光束、貝塞爾光束等方式在探測(cè)物鏡的焦面產(chǎn)生非常薄的片狀光場(chǎng)，在樣品內(nèi)形成一塊二維的光平面(sheet)，平面內(nèi)的熒光分子受到光激發(fā)產(chǎn)生熒光，形成熒光平面，如同利用光束在立體標(biāo)本中切出切片一樣，“光片(light sheet)”之名由此而來(lái)[2,5]。光片的產(chǎn)生方式主要有4種，具體見(jiàn)表1。

表1 4種光片產(chǎn)生方式的比較Table 1 Comparation between four ways of producing light sheet

激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)通常只有1個(gè)工作物鏡，基于落射式架構(gòu)的共聚焦顯微鏡，其物鏡同時(shí)起到激光光源照明匯聚和樣品成像的功能，利用濾色鏡將熒光以外的光過(guò)濾掉，再通過(guò)同一物鏡接收激發(fā)得到的熒光信號(hào)[10]。而光片熒光顯微鏡通過(guò)2個(gè)物鏡分別完成激發(fā)光的照射及熒光信號(hào)的收集，將照明和探測(cè)成像兩個(gè)功能分開(kāi)。片狀的激發(fā)光源通過(guò)一個(gè)照明物鏡對(duì)樣品從一側(cè)進(jìn)行照射，橫穿樣品內(nèi)部的扁平光束會(huì)在樣品中形成一個(gè)熒光照射平面。這個(gè)二維平面與激發(fā)光的軸向呈90°，即照明激發(fā)光路與探測(cè)光路互相正交，被與激發(fā)光束垂直排列的探測(cè)成像物鏡和相機(jī)所采集。由于其激發(fā)裝置和探測(cè)裝置在同一平面正交分布，而非在同一條豎線(xiàn)上排列，這使得放置生物樣本的承載容器也與傳統(tǒng)顯微鏡的平板狀載物臺(tái)不同(圖1)[2, 11]。受到這種裝置結(jié)構(gòu)的影響，光片熒光顯微鏡的樣品是裝載在含有瓊脂糖或氟化乙丙烯的樣品圓柱長(zhǎng)管中的。共聚焦顯微鏡的樣品通常承載在載玻片或培養(yǎng)皿等平面支持物上，對(duì)樣品有薄片狀的要求；而光片熒光顯微鏡采用的正交光路設(shè)計(jì)，使其具有較大的觀(guān)測(cè)空間，可以觀(guān)測(cè)較大的樣本，其樣品可以是較大尺度的完整胚胎、器官等[5]，如秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)[12]、黑腹果蠅[13]、斑馬魚(yú)[14-15]、夏威夷明溝蝦[16]和小鼠[17-19]等模式生物的動(dòng)物活體胚胎或器官。

圖1 光片熒光顯微鏡的基本原理Fig.1 Basic principle of the light-sheet fluorescence microscope

1.2 成像優(yōu)勢(shì)

1.2.1低光毒性、光漂白性與低光損傷 光毒性(phototoxicity)是指在較長(zhǎng)時(shí)間的強(qiáng)光照射下，活體生物樣本細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)分子會(huì)產(chǎn)生分解現(xiàn)象，這是利用激光作為光源進(jìn)行顯微觀(guān)測(cè)時(shí)無(wú)法避免的[20]。光損傷(photodamage)是指長(zhǎng)時(shí)間或是高劑量進(jìn)行激光掃描樣品，令樣品細(xì)胞內(nèi)有機(jī)分子受到破壞的現(xiàn)象[1]。光漂白(photobleaching)指的是熒光分子在光照下熒光褪色減弱的過(guò)程，幾乎所有的熒光團(tuán)在光照下都會(huì)出現(xiàn)褪色[21]。光毒性、光漂白和光損傷是熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡觀(guān)察樣本常面臨的負(fù)面效應(yīng)。

共聚焦顯微鏡基于針孔結(jié)構(gòu)，采用傳統(tǒng)的光發(fā)射-激發(fā)耦合模式，即光的發(fā)射與探測(cè)裝置由二向色鏡等效在一條直線(xiàn)上排列且空間重合。在觀(guān)測(cè)樣品某一平面的時(shí)候?qū)?huì)使樣品內(nèi)大多數(shù)的化合物都吸收光，這種無(wú)選擇性的光照會(huì)增大光漂白的影響，容易對(duì)樣本造成較大的光損傷以及光毒性作用，導(dǎo)致無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)觀(guān)測(cè)活體樣本[20]。而光片熒光顯微鏡側(cè)向照明的方式使其只需照亮觀(guān)測(cè)平面即可觀(guān)測(cè)所要觀(guān)測(cè)的成像面，使得光毒性和光漂白效應(yīng)降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)[21]，解決了共聚焦顯微鏡成像時(shí)無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)觀(guān)測(cè)的問(wèn)題。

1.2.2高時(shí)空分辨率 光片熒光顯微鏡采用了寬視場(chǎng)的圖像采集器如電荷耦合器件(charge coupled device, CCD)相機(jī)和科研級(jí)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體相機(jī)(scientific complementary metal oxide semiconductor, sCMOS)，進(jìn)行逐面成像，使得被激發(fā)光所照射的平面所有的熒光信號(hào)都能被檢測(cè)到。結(jié)合精確的采樣定位系統(tǒng)便可以快速地獲得樣品多層次的光學(xué)切片，還可在低光毒性的基礎(chǔ)上對(duì)活樣本同時(shí)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的多色、多視角成像[20]。

最早的成像模式是保持光片固定不動(dòng)，沿探測(cè)光路軸向移動(dòng)樣品，但由于位移平臺(tái)速度受限，其成像速度只能達(dá)到約10 frames·s-1；隨后出現(xiàn)了物鏡耦合平面照明顯微鏡(objective-coupled planar illumination microscope，OCPIM)[22]，主要是通過(guò)保持樣品靜止，用移動(dòng)速度較快的壓電位移平臺(tái)沿軸向同時(shí)移動(dòng)光片和探測(cè)物鏡進(jìn)行三維成像，將成像速度提高到了20 frames·s-1，但僅適用于產(chǎn)生高斯光片，其他類(lèi)型的光片由于需要更復(fù)雜的激發(fā)裝置，無(wú)法滿(mǎn)足OCPIM的承重要求；再往后出現(xiàn)了解耦合照明探測(cè)光片熒光顯微鏡(decoupled illumination detection-light sheet fluorescence microscope, DID-LSFM)[23]，在探測(cè)光路中加入三次相位板(cubic phase-mask, CPM)來(lái)拓展探測(cè)裝置的景深，成像速度可以達(dá)到1 600 frames·s-1(通過(guò)設(shè)置感興趣領(lǐng)域減少相機(jī)使用像素?cái)?shù)目)，這種高時(shí)空分辨率的成像模式是其他顯微鏡難以實(shí)現(xiàn)的。但是在引入CPM后，需經(jīng)后期去卷積處理抵消高速、寬視場(chǎng)成像所帶來(lái)的分辨率與對(duì)比度下降等問(wèn)題。國(guó)內(nèi)也有相關(guān)研究，如胡渝曜等[24]提出通過(guò)引入電動(dòng)可變焦距透鏡(electrically tunable lens, ETL)與一維振鏡，大幅提高成像速度以突破移動(dòng)探測(cè)物鏡或移動(dòng)樣本等方案的速度極限，使單幅圖像穩(wěn)定成像的速度達(dá)到275 frames·s-1，此外通過(guò)調(diào)整光路還有效地減少了高時(shí)空分辨率成像過(guò)程中偽像的出現(xiàn)。Greer和Holy[25]引入了分布式平面顯像(distributed planar imaging)的技術(shù)，即在OCPIM的基礎(chǔ)架構(gòu)中的鏡筒透鏡后置入鋒利的棱鏡鏡面(knife-edged prism mirror, KEM)，將圖像截成兩部分，分別由CMOS相機(jī)接收，可以并行對(duì)兩部分圖像處理，而后拼合，提高圖像處理速度，支持深達(dá)700 μm、每秒掃描28 mm的成像，研究人員將其命名為快速物鏡耦合平面照明顯微鏡(fast objective coupled planar illumination microscopy)。此外，與近年來(lái)快速發(fā)展的超分辨技術(shù)結(jié)合，也成為光片熒光顯微鏡成像模式改進(jìn)的熱點(diǎn)之一，如受激輻射損耗-光片熒光顯微鏡(stimulated emission depletion selective plane illumination microscope, STED-SPIM)[26]、相干結(jié)構(gòu)照明-光片熒光顯微鏡(coherent structured illumination light sheet fluorescence microscope, csi-LSFM)[27]等，突破了傳統(tǒng)熒光顯微鏡的光學(xué)衍射極限，有效提高了顯微鏡的分辨率。如Leica公司的TwinFlex可以與自家的SP8超分辨成像技術(shù)結(jié)合使用。

1.3 成像效果的改進(jìn)與優(yōu)化

常見(jiàn)光源的光是容易產(chǎn)生衍射和散射問(wèn)題的高斯光束(Gaussian beam)，存在觀(guān)測(cè)視場(chǎng)與軸向分辨率相互制約的問(wèn)題。有研究小組選擇利用無(wú)衍射光束解決這一問(wèn)題，如利用艾里光束(Airy beam)[28]或貝塞爾光束(Bessel beam)[29]來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高斯光束來(lái)產(chǎn)生光片，顯著增強(qiáng)了高散射的大型生物樣品的體內(nèi)細(xì)胞分辨率三維成像的信號(hào)對(duì)比度和成像深度。Wang等[30]以1 320 nm的近紅外二區(qū)的連續(xù)激光為激發(fā)光，能夠得到中心波長(zhǎng)為1 600 nm的發(fā)射光，對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行非侵入式成像，成像深度達(dá)到2 mm。利用光片熒光顯微鏡觀(guān)測(cè)樣品過(guò)大仍會(huì)造成樣本光吸收量和散射過(guò)多，從而影響到成像的質(zhì)量。多向選擇性層狀光照明顯微鏡(multidirectional selective plane illumination microscope, mSPIM)的出現(xiàn)解決了這2個(gè)問(wèn)題：首先是從樣品的不同角度成像，成像疊加后的結(jié)果可以消除樣品吸收所引起的激發(fā)路徑陰影，這個(gè)策略也可以解決貝塞爾光片由于旁瓣的存在而導(dǎo)致的成像對(duì)比度下降問(wèn)題；其次，從相反的方向連續(xù)照射樣品或者是成像后利用算法處理得到優(yōu)化后的結(jié)果，解決了在樣品中散射過(guò)強(qiáng)的問(wèn)題[31]。Yang等[32]采用特殊設(shè)計(jì)的水浸式物鏡接收激發(fā)光，而后被相機(jī)采集，通過(guò)改變介質(zhì)，有效地提高了信號(hào)接收率，還可作為附加模塊安裝到熒光倒置顯微鏡上，使其能夠進(jìn)行光片熒光顯微成像。

對(duì)于這種可以進(jìn)行高時(shí)空分辨率成像的顯微鏡來(lái)說(shuō)，高頻的機(jī)械偏移使圖像質(zhì)量下降，是一個(gè)難以避免的問(wèn)題。張球等[33]提出利用4f系統(tǒng)和CCD相機(jī)跟蹤樣品的位置并使用納米平移臺(tái)對(duì)機(jī)械漂移進(jìn)行補(bǔ)償?shù)姆桨?，有效地減少了機(jī)械偏移現(xiàn)象的出現(xiàn)。

在光片熒光顯微鏡允許盡可能多的光線(xiàn)通過(guò)物鏡的同時(shí)，使得衍射所產(chǎn)生的離焦信號(hào)被采集。去卷積算法可以有效解決成像模糊的問(wèn)題，去卷積(deconvolution)就是利用各種算法消除離焦的圖像信號(hào)或是對(duì)其進(jìn)行重新分配，提高圖像的對(duì)比度和分辨率[34]。在單位算力價(jià)格逐步下降的今天，計(jì)算密集型的去卷積算法愈來(lái)愈廣泛地應(yīng)用在光片熒光顯微成像中。如Zhang等[35]采用海森正則化(Hessian regularization)算法和修改后的去條紋算法(stripe-removal algorithm)對(duì)圖像進(jìn)行處理和重建，能夠在較厚的光片中保持高成像對(duì)比度和高信噪比的容積成像。此外，F(xiàn)ei等[36]開(kāi)發(fā)了一種新的光片熒光顯微鏡——亞體素光片熒光顯微鏡(subvoxel light sheet microscopy, SLSM)，通過(guò)支持向量回歸機(jī)(support vector regression, SVR )算法重建一批低分辨率圖像。重建4×SLSM采集到的圖像分辨率優(yōu)于同倍數(shù)鏡SPIM近百倍；4×SLSM的分辨率略?xún)?yōu)于20×SPIM的分辨率，但成像速度是后者的10倍還多，且光漂白顯著低于后者。

目前針對(duì)不同的具體研究條件，產(chǎn)生了以正交光路設(shè)計(jì)為核心的一系列光片熒光顯微鏡，如在探測(cè)物鏡焦平面上快速移動(dòng)聚焦光束，形成一個(gè)虛擬光片的數(shù)字掃描激光光片顯微鏡(digitally scanned laser light sheet microscope, DSLM)[20]；同時(shí)利用3個(gè)物鏡(2個(gè)照明物鏡和1個(gè)探測(cè)物鏡)，發(fā)射兩束排在同一直線(xiàn)對(duì)射的光束激發(fā)樣品的多向選擇性層狀光照明顯微鏡(multidirectional SPIM, mSPIM)[31]；具有多個(gè)探測(cè)物鏡，可多向?qū)αⅢw樣本進(jìn)行信號(hào)采集的多視角光片顯微鏡(multi-view light-sheet microscope, MuVi-LSFM)[5]；在傾斜樣品內(nèi)部形成傾斜光片，可以對(duì)細(xì)胞、秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)性腺、果蠅幼蟲(chóng)腦部、小鼠視網(wǎng)膜和腦切片以及整個(gè)棘魚(yú)進(jìn)行深達(dá)66 μm超分辨成像的單分子傾斜平面顯微鏡(single-molecule oblique-plane microscopy, obSTORM)[37]等。

各大公司開(kāi)發(fā)了許多商用光片熒光顯微鏡。一些顯微鏡套用的是傳統(tǒng)顯微鏡鏡筒裝配架構(gòu)，將平面載物臺(tái)替換為成像室，側(cè)面有照射物鏡。另一些則是采用了集成化箱體設(shè)計(jì)的非傳統(tǒng)顯微鏡裝配架構(gòu)[5]，放棄了傳統(tǒng)顯微鏡的架構(gòu)使得光片顯微鏡能在保留核心結(jié)構(gòu)的同時(shí)，有了更多靈活的裝配空間來(lái)觀(guān)測(cè)較大的立體樣本。如蔡司(Zeiss)推出的Lightsheet Z.1，呈箱式的外觀(guān)與傳統(tǒng)顯微鏡相差極大，內(nèi)部裝載有含瓊脂糖或聚全氟乙丙烯的樣本管；其他比較具有代表性的還有徠卡(Leica)公司的TwinFlex、Luxendo公司的MuViSPIM和InViSPIM等，Lexendo公司生產(chǎn)的這2款顯微鏡中，MuViSPIM還額外支持樣品的旋轉(zhuǎn)功能。

2 光片熒光顯微鏡的應(yīng)用

光片熒光顯微鏡解決了傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡難以長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)測(cè)以及無(wú)法對(duì)大體積活體樣本的觀(guān)測(cè)問(wèn)題，而這些問(wèn)題恰恰是研究神經(jīng)與發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的核心要求。截至2020年12月，被Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的以“l(fā)ight sheet fluorescence”或“selective plane illumination”為關(guān)鍵詞的文獻(xiàn)已有2 263篇，包括但不限于對(duì)光片熒光顯微鏡的改進(jìn)和應(yīng)用。

2.1 光片熒光顯微鏡在神經(jīng)生物學(xué)中的應(yīng)用

光片熒光顯微鏡在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及獲得亞細(xì)胞分辨率的完整哺乳動(dòng)物大腦形態(tài)圖像等研究提供了可能；使用貝塞爾光束和艾里光束等無(wú)衍射光束還可以顯著增加混濁神經(jīng)組織穿透深度的能力[11]。在觀(guān)測(cè)一些密度較大、易造成散射降低成像質(zhì)量的樣品，如大腦、免疫器官、腫瘤組織等時(shí)需要作透明化處理，方可達(dá)到更理想化的觀(guān)測(cè)效果。Tomer等[13]對(duì)發(fā)育中的黑腹果蠅胚胎神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了高分辨率的長(zhǎng)期成像，并在體內(nèi)建立了神經(jīng)母細(xì)胞譜系，還在整個(gè)早期胚胎中實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)的單細(xì)胞自動(dòng)跟蹤。Hahn等[17]在原有3DISCO (3-dimensional imaging of solvent-cleared organ) 技術(shù)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出了一種新式組織透明技術(shù)sDISCO (stabilised 3D imaging of solvent-cleared organs)，對(duì)小鼠全腦進(jìn)行了高分辨率的熒光成像。該技術(shù)的核心是由1份苯甲醇(benzyl alcohol)和2份苯甲酸芐酯(benzyl benzoate)配制而成的一種組織透明化試劑BABB，它可以作為清除劑將所要觀(guān)察周?chē)鸁o(wú)關(guān)的聯(lián)結(jié)組織清理掉，得到更好的深層組織成像效果。研究表明，通過(guò)GCaMP對(duì)斑馬魚(yú)大腦中的鈣離子的捕獲進(jìn)而產(chǎn)生熒光，發(fā)現(xiàn)丘腦對(duì)外界光信號(hào)刺激，尤其是對(duì)若隱若現(xiàn)的光刺激起到感應(yīng)器的作用，并將這一信息傳達(dá)至頂蓋，使生物產(chǎn)生逃離的反應(yīng)[15]。光片熒光顯微鏡的低光毒性保證了實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)腦部神經(jīng)活動(dòng)的可能性。Misha Ahrens實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)位于延髓后側(cè)的一部分去甲腎上腺素能神經(jīng)細(xì)胞能夠激活位于延髓側(cè)部的一部分膠質(zhì)細(xì)胞，在必要的時(shí)候允許動(dòng)物選擇放棄，抑制持續(xù)失敗的行為[38]。其實(shí)驗(yàn)室在2018年發(fā)表在《自然-方法》[39]和《神經(jīng)元》[40]上的文章提供了該研究使用的光片熒光顯微鏡、虛擬現(xiàn)實(shí)、細(xì)胞消融術(shù)和光遺傳學(xué)等技術(shù)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法與工具說(shuō)明。此外，還有研究小組首次發(fā)現(xiàn)了斑馬魚(yú)的睡眠神經(jīng)信號(hào)特征：大腦背側(cè)皮層存在低頻率高幅度的簇狀放電活動(dòng)(slow bursting sleep)，且端腦存在持續(xù)傳播的神經(jīng)信號(hào)波，表明脊椎動(dòng)物大腦中睡眠的共同神經(jīng)信號(hào)可能出現(xiàn)超過(guò)了4.5億年[41]。

2.2 光片熒光顯微鏡在動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)中的應(yīng)用

光片熒光顯微技術(shù)以其低光毒性和可三維實(shí)時(shí)成像為核心特性，解決了難以長(zhǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)育中的生命體進(jìn)行顯微觀(guān)測(cè)的難題，正在成為發(fā)育生物學(xué)研究中必不可少的研究工具。Ding等[42]利用光片熒光顯微鏡與配套的熒光友好型組織清理技術(shù)(fluorescence-friendly tissue clearing technique)觀(guān)測(cè)了新生兒以及小鼠心臟，量化了心室尺寸，還定位了從出生后到成年小鼠心臟的心臟特異性蛋白和離子通道的空間分布。充分說(shuō)明了光片熒光顯微技術(shù)極大地促進(jìn)了發(fā)育生物學(xué)所能觀(guān)測(cè)到空間的廣度和時(shí)間的長(zhǎng)度。Wolff等[16]通過(guò)對(duì)一種海洋甲殼動(dòng)物——夏威夷明鉤蝦的胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行持續(xù)長(zhǎng)達(dá)數(shù)天的觀(guān)察，隨后對(duì)長(zhǎng)出的胸肢在單細(xì)胞分辨率下進(jìn)行細(xì)胞重建，分析發(fā)現(xiàn)正在生長(zhǎng)的早期肢體原基會(huì)進(jìn)一步劃分出2個(gè)分別進(jìn)行前-后軸與背-腹軸發(fā)育的部分，并于肢遠(yuǎn)端交匯；肢芽的形成與細(xì)胞增殖過(guò)程的空間調(diào)控有關(guān)，同時(shí)肢體的伸長(zhǎng)也受細(xì)胞分裂過(guò)程在遠(yuǎn)-近軸上的優(yōu)先取向的驅(qū)動(dòng)。Daetwyler等[14]同時(shí)對(duì)5個(gè)活斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行成像，再以紅細(xì)胞圖像作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)，建立了一套可自動(dòng)化處理并分析數(shù)據(jù)集的平臺(tái)。通過(guò)平臺(tái)的分析，得到了一個(gè)記錄有時(shí)間信息且能精準(zhǔn)定量的三維血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育模型。有研究報(bào)道，將光片熒光顯微鏡與微粒圖像測(cè)速(micro-particle image velocimetry, μPIV)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)3 d左右斑馬魚(yú)幼體的心臟血液流動(dòng)進(jìn)行跟蹤，根據(jù)流動(dòng)數(shù)據(jù)模擬重建出心臟血液流動(dòng)的三維模型，此外還可測(cè)算出每次泵動(dòng)的血液流量[43]。Mcdole等[44]設(shè)計(jì)了一種智能的光片熒光顯微鏡，能夠自適應(yīng)性的跟蹤胚胎發(fā)育過(guò)程，構(gòu)建出小鼠胚胎從原腸胚形成到早期器官發(fā)育的全過(guò)程，在此基礎(chǔ)上該研究小組繪制出了小鼠的高分辨胚胎發(fā)育圖譜和細(xì)胞水平的命運(yùn)圖譜。

2.3 光片熒光顯微鏡在動(dòng)物細(xì)胞行為相關(guān)研究中的應(yīng)用

光片熒光顯微鏡的低光毒性、低光漂白性和低光損傷的特點(diǎn)，支持長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行跟蹤。Renkawitz等[45]在借助光片熒光顯微鏡長(zhǎng)時(shí)間跟蹤細(xì)胞行為時(shí)，發(fā)現(xiàn)了部分種類(lèi)的癌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及T細(xì)胞等變形細(xì)胞可以利用細(xì)胞核衡量路徑寬窄，并以此來(lái)尋找細(xì)胞遷移過(guò)程中最易通過(guò)路徑的行為。Vargas-Patron等[46]對(duì)斑馬魚(yú)幼體進(jìn)行了含有熒光標(biāo)記人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma)細(xì)胞的異體移植。通過(guò)利用光片熒光顯微鏡的持續(xù)成像，結(jié)合流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞增殖情況的分析，鑒定出了人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的至少3個(gè)細(xì)胞增殖周期。同時(shí)根據(jù)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在斑馬魚(yú)體內(nèi)的增殖和生長(zhǎng)情況，認(rèn)為其可以作為臨床前研究過(guò)程中評(píng)估抗增殖藥物有效性的模型。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)血管生成和血管重構(gòu)來(lái)改變健康組織的血管網(wǎng)絡(luò)，因此研究人員對(duì)小鼠大腦進(jìn)行U87與GL261多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的異體移植，通過(guò)光片熒光顯微鏡的成像，建立了移植前后的血管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型[47]。研究發(fā)現(xiàn)在整體上基本拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)保持一致，但在細(xì)節(jié)上發(fā)生了許多微妙的改變。移植后的血管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有較高的腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性，這有助于我們更好的了解這一腫瘤對(duì)血管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響。Prahst等[18]使用光片熒光顯微鏡對(duì)小鼠視網(wǎng)膜組織在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平進(jìn)行快速、定量的三維及四維時(shí)移成像。相對(duì)于共聚焦成像時(shí)制片對(duì)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的破壞，光片熒光顯微鏡可以對(duì)整個(gè)眼部進(jìn)行成像，以避免破壞原有組織形態(tài)。研究人員運(yùn)用該顯微鏡通過(guò)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型(oxygen-induced retinopathy, OIR)觀(guān)測(cè)到諸如細(xì)胞移動(dòng)異常、細(xì)胞絲狀偽足的改變以及之前從未觀(guān)測(cè)到的病態(tài)血管簇等現(xiàn)象。

2.4 光片熒光顯微鏡在植物科學(xué)中的應(yīng)用

近年來(lái)，在光片熒光顯微鏡在動(dòng)物器官和胚胎研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛的背景下，植物學(xué)家也將其用作研究植物生理生化與發(fā)育的新工具。研究人員利用一種熒光能量共振技術(shù)結(jié)合光片顯微鏡對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞的胞質(zhì)及核質(zhì)中的Ca2+進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像，跟蹤其在不同刺激下Ca2+的分布與濃度變化，從而在植物發(fā)育與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面可以獲得植物體內(nèi)高分辨率、在大組織體積深度方面獲得可忽略光漂白效應(yīng)的更精確的研究結(jié)果[48]。Jozefamaj實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)擬南芥[49]和紫花苜蓿[50]的根部細(xì)胞分裂過(guò)程進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成像跟蹤。通過(guò)對(duì)擬南芥根部細(xì)胞中磷脂酶Dα(phospholipase D alpha 1)與微管、網(wǎng)格蛋白小泡(clathrin-coated vesicles, CCVs)和網(wǎng)格蛋白小窩(clathrin-coated pits, CCPs)之間的定位，可知細(xì)胞是否正在進(jìn)行分裂；通過(guò)對(duì)紫花苜蓿根表皮和皮層細(xì)胞微管中熒光標(biāo)記的長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)跟蹤，得到根部生長(zhǎng)速率的信息。De Col等[51]開(kāi)發(fā)出基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的新型ATP熒光感應(yīng)蛋白——ATeam1.03-nD/nA，結(jié)合光片熒光顯微鏡用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器(如線(xiàn)粒體)中的MgATP2-，并能繪制出諸如根須等組織的MgATP2-含量與分布圖，這套方案能夠?qū)罴?xì)胞的ATP能量代謝狀況進(jìn)行精準(zhǔn)、高效的實(shí)時(shí)分析，為活細(xì)胞能量代謝研究提供了高通量的研究手段。此外，利用對(duì)擬南芥花的種系分化(germline differentiation)現(xiàn)象進(jìn)行多視角跟蹤，在亞細(xì)胞分辨率下重建出花的三維模型，觀(guān)察到了雌、雄胚子的減數(shù)分裂、花粉不對(duì)稱(chēng)分裂、減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的移動(dòng)以及在絨氈層細(xì)胞中異常的再組有絲分裂(unusual restitution mitosis)等現(xiàn)象[52]。Slattery等[53]利用光片熒光顯微鏡監(jiān)視葉片內(nèi)部光環(huán)境，對(duì)野生大豆和葉綠素b突變體大豆Y11y11葉片的葉綠素與光合光能吸收率進(jìn)行了分析。使用光片熒光顯微鏡不僅無(wú)需在葉片表面進(jìn)行多余的處理，還能避免熒光成像時(shí)葉綠素所造成的誤差和焦平面的光漂白現(xiàn)象。

綜上所述，光片熒光顯微鏡以其寬視野、高時(shí)空分辨率及低光毒性、低光損傷等的優(yōu)勢(shì)在現(xiàn)代生命科學(xué)研究眾多領(lǐng)域中迅速崛起，近年來(lái)代表性的應(yīng)用匯總見(jiàn)表2。

表2 光片熒光顯微鏡在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用Table 2 Application of the LSFM in life science

續(xù)表物種觀(guān)測(cè)對(duì)象光片熒光顯微鏡參與的主要研究?jī)?nèi)容參考文獻(xiàn)哺乳綱人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞脂肪干細(xì)胞泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤免疫細(xì)胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,觀(guān)察分化心臟微組織的結(jié)構(gòu)與功能,還通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行鈣成像,檢測(cè)其不同細(xì)胞的功能異質(zhì)性,為研究組織的結(jié)構(gòu)-功能互作提供新見(jiàn)解[68]結(jié)合組織清理技術(shù),在小鼠大腦中觀(guān)測(cè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞源神經(jīng)前體細(xì)胞的分化,分化為神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和寡突膠質(zhì)細(xì)胞,該研究提供了一套研究干細(xì)胞分化的成像方法[69]用于觀(guān)測(cè)生物活性玻璃參與誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的成骨分化,開(kāi)創(chuàng)了新的用于成骨分化和骨再生的立體水凝膠體外培養(yǎng)模式[70]首次系統(tǒng)介紹了利用光片熒光顯微鏡對(duì)胚胎與胎兒內(nèi)、外生殖器與腎臟的樣本制作、成像和體外建模等完整流程[71]對(duì)上皮性卵巢癌組織進(jìn)行成像,發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,血管構(gòu)造變的無(wú)序且密集,減少血流灌輸可以有效抑制轉(zhuǎn)移過(guò)程,為此類(lèi)癌癥治療提供了新思路[72]在體外構(gòu)建出肝癌細(xì)胞球狀體,使用顯微鏡觀(guān)察形態(tài)及其功能,發(fā)現(xiàn)球狀體中的肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生極化并形成膽管,進(jìn)行膽汁排泄,為特定組織的相關(guān)研究提供新的思路[73]對(duì)部分種類(lèi)的癌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及T細(xì)胞等變形細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成像,研究發(fā)現(xiàn)其可以利用細(xì)胞核寬度尋找最佳運(yùn)動(dòng)路徑,解答了白細(xì)胞等為何能夠快速通過(guò)致密組織,到達(dá)靶點(diǎn)的問(wèn)題[45]鳥(niǎo)綱斑胸草雀輸卵管對(duì)斑胸草雀的輸卵管組織進(jìn)行三維成像,研究精子的儲(chǔ)存機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能影響精子選擇的門(mén)狀狹窄開(kāi)口結(jié)構(gòu),這是首次對(duì)脊椎動(dòng)物的精子儲(chǔ)存器官進(jìn)行的三維成像與建模[74]昆蟲(chóng)綱果蠅胚胎建立了SiMView成像系統(tǒng),對(duì)胚胎神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成像,建立神經(jīng)母細(xì)胞譜系,實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)的單細(xì)胞自動(dòng)跟蹤,提供了高分辨的活體成像方法[13]甲殼綱夏威夷明鉤蝦胚胎對(duì)夏威夷明鉤蝦胚胎的腹肢發(fā)育過(guò)程進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成像,這也為其他動(dòng)物四肢的發(fā)育提供了新的研究思路和見(jiàn)解[16]頭足綱章魚(yú)胚胎實(shí)現(xiàn)了章魚(yú)卵的人工控制孵化,并對(duì)章魚(yú)的胚胎進(jìn)行成像,觀(guān)測(cè)其發(fā)育和器官發(fā)生事件,為頭足類(lèi)動(dòng)物發(fā)育的研究提供支持[75]珊瑚綱尖枝列孔珊瑚珊瑚共生微生物結(jié)合組織清理技術(shù),對(duì)珊瑚進(jìn)行三維成像,還得到了共生微生物的豐度和空間分布,以及對(duì)細(xì)胞行為的捕捉,為珊瑚相關(guān)研究提供了有力的成像方法[76]雙子葉植物綱擬南芥紫花苜蓿大豆花根部根部表皮和皮層葉片對(duì)擬南芥花的種系分化現(xiàn)象進(jìn)行多視角跟蹤與計(jì)算機(jī)模擬重建,觀(guān)察到一系列生殖細(xì)胞的細(xì)胞活動(dòng),為植物有性生殖研究提供新思路[52]對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞胞質(zhì)及核質(zhì)中的Ca2+進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像,研究鈣信號(hào)傳遞的細(xì)胞活動(dòng)[48]對(duì)擬南芥根部細(xì)胞中磷脂酶Dα進(jìn)行定位,結(jié)合其他蛋白質(zhì)的信息,可以確定細(xì)胞是否正在進(jìn)行分裂[49]開(kāi)發(fā)出一種熒光感應(yīng)蛋白,結(jié)合光片熒光顯微鏡成像,可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器中的MgATP2-,對(duì)活細(xì)胞的ATP能量代謝狀況進(jìn)行定量分析[51]對(duì)根部進(jìn)行成像,研究植物與4種真菌的互作關(guān)系,以及真菌對(duì)植物分泌IAA與JA的影響,為研究植物-微生物互作機(jī)理的研究提供新思路[77]對(duì)紫花苜蓿根表皮和皮層細(xì)胞成像,得到根部生長(zhǎng)速率的信息[50]對(duì)野生大豆和葉綠素b突變體大豆葉片的葉綠素與光合光能吸收率進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)葉綠素含量會(huì)極大地影響光衰減效應(yīng)[53]

續(xù)表物種觀(guān)測(cè)對(duì)象光片熒光顯微鏡參與的主要研究?jī)?nèi)容參考文獻(xiàn)絲胞綱煙曲霉菌體對(duì)3種類(lèi)型的小鼠侵襲性肺曲霉病模型肺部進(jìn)行成像,觀(guān)測(cè)菌體生長(zhǎng)與侵蝕小鼠肺部情況,揭示了抗真菌過(guò)程中肺泡巨噬細(xì)胞和多形核中性粒細(xì)胞這2個(gè)關(guān)鍵免疫細(xì)胞群的空間分布、相互作用和激活事件,有助于理解復(fù)雜的宿主-病原體互作和對(duì)小鼠模型的優(yōu)化[78]

3 展望

作為一類(lèi)新式顯微鏡，光片熒光顯微鏡在保持高空間分辨率和最小化光漂白與光毒性的同時(shí)，進(jìn)行容積成像。該顯微鏡所具有的較低的光毒性、高時(shí)空分辨率、寬視場(chǎng)、大型樣本成像、與不同激發(fā)態(tài)的相容性以及可以與其他現(xiàn)有成像技術(shù)和組學(xué)分析相結(jié)合的特性日益發(fā)展成熟，將滿(mǎn)足科研領(lǐng)域日益增長(zhǎng)的對(duì)整個(gè)生物體、組織和細(xì)胞快速、溫和條件成像的需求。

在光遺傳學(xué)中，通過(guò)向神經(jīng)元中導(dǎo)入特定基因，表達(dá)的光敏蛋白能將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，再利用光的有無(wú)控制神經(jīng)細(xì)胞的活躍與否[11]。腦的神經(jīng)連接復(fù)雜，神經(jīng)元之間連接轉(zhuǎn)換處理各種信號(hào)的數(shù)量是天文數(shù)字級(jí)別，而對(duì)某些神經(jīng)官能疾病，例如對(duì)某些行為的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控路線(xiàn)，我們要有效的追蹤哪些細(xì)胞與諸如語(yǔ)言遲滯、強(qiáng)迫癥等有關(guān)的神經(jīng)疾病活動(dòng)有關(guān)聯(lián)——是激活行為還是關(guān)閉行為。因此或許可以將光片熒光顯微鏡同光遺傳學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，利用LSFM對(duì)組織的光照穿透力等特性，實(shí)現(xiàn)光控特定熒光標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的研究。目前美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的Keller課題組已經(jīng)采用光遺傳學(xué)或化學(xué)遺傳學(xué)的方法對(duì)神經(jīng)通路進(jìn)行干涉并應(yīng)用于研究中[38-39]。除此之外，光片熒光顯微鏡作為高時(shí)空分辨率的觀(guān)測(cè)裝置，還可與當(dāng)前熱門(mén)的諸如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)研究乃至基因編輯技術(shù)相結(jié)合[79]，通過(guò)將觀(guān)察性研究與構(gòu)建細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化模型、細(xì)胞分子互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及信息整合挖掘的研究相聯(lián)系，有望統(tǒng)一長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)不同細(xì)胞種類(lèi)定義研究領(lǐng)域“百家爭(zhēng)鳴”的局面, 為多維度認(rèn)知細(xì)胞發(fā)育、行為和互作關(guān)系等提供了有力的技術(shù)支持。此外，大量的圖像數(shù)據(jù)已難僅靠人力進(jìn)行處理，以圖像識(shí)別領(lǐng)頭的一系列深度學(xué)習(xí)技術(shù)漸漸成為該領(lǐng)域標(biāo)本信息分析的“標(biāo)配”，協(xié)助研究人員進(jìn)行研究；反卷積算法的應(yīng)用能夠有效解決寬視場(chǎng)成像所帶來(lái)的成像質(zhì)量低的痛點(diǎn)，由此可以預(yù)見(jiàn)到愈來(lái)愈多計(jì)算機(jī)科學(xué)元素的加入是未來(lái)光片熒光顯微鏡發(fā)展的大勢(shì)所趨[35-36, 38]。光片熒光顯微鏡模塊化的裝配模式，使其包容性足夠大，有研究小組將其與藥物的高通量篩選系統(tǒng)結(jié)合，使得可以實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)藥物對(duì)如神經(jīng)活動(dòng)作用的效果[80]。

目前在光片熒光顯微鏡使用過(guò)程中仍會(huì)有一些局限，譬如在觀(guān)測(cè)心臟等器官時(shí)，殘留的血紅蛋白會(huì)干擾熒光分子，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，還會(huì)在觀(guān)測(cè)中遇到生理偽影等的問(wèn)題[30, 81]；一些比較厚的組織較強(qiáng)的光散射會(huì)造成成像質(zhì)量不足[30]；以及成像所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)常以太比特計(jì)量，需要大量的儲(chǔ)存介質(zhì)保存。但從目前應(yīng)用來(lái)看，光片熒光顯微鏡可以為細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及神經(jīng)科學(xué)等提供獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的成像視域并促進(jìn)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展。