何依蓉，張奕杰，楊 偉，陳曉聰，張家翔，陳培富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 昆明 650201)

沙門菌(Salmonellaspp.)是食物污染中常見的致病菌。全球每年因沙門菌引起的傷寒及胃腸炎病例約有13億例[1-2]。其中，鼠傷寒沙門菌具有廣泛的致病性，分離率居高不下，耐藥性也日趨突出，是具有重要公共衛(wèi)生意義的人獸共患病原菌[2]。在當(dāng)前我國實(shí)施禁止飼料預(yù)防性添加抗生素的政策形勢下，積極發(fā)展噬菌體制劑用于耐藥性鼠傷寒沙門菌引起的感染治療或?qū)Νh(huán)境、食品的污染控制，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。噬菌體廣泛分布于自然環(huán)境。據(jù)估計(jì)，噬菌體的豐度為106～108·mL-1，這為人類提供了一個(gè)豐富的天然抗菌資源庫[3-4]。其中，烈性噬菌體作為一種能夠高效裂解細(xì)菌的病毒，具有高度的宿主特異性，只裂解特定種及型的宿主菌，因此它們不會破壞環(huán)境中的其他微生物[5]，也不會破壞腸道正常菌群結(jié)構(gòu)，有望替代抗生素用于防治細(xì)菌性感染[6]。美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)了一種由噬菌體混合而成的食品添加劑，能夠有效殺滅食物中的多型李斯特桿菌[7]。本試驗(yàn)擬以前期自行分離自散裝鮮牛奶樣品的一株鼠傷寒沙門菌為宿主菌，分離相應(yīng)的烈性噬菌體，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以及評價(jià)其在動物體內(nèi)防治疾病的效力。

1 材料與方法

1.1 材料

武定雞3只，分籠飼養(yǎng)；BALB/c小鼠100只(雌雄各半)，均為健康動物。細(xì)菌培養(yǎng)基購自環(huán)凱生物有限公司。宿主菌ND104由本實(shí)驗(yàn)室分離自散裝牛奶并保存。細(xì)菌DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購自生工生物工程有限公司。腸炎沙門菌參考菌株ATCC13076購自中國菌種保藏中心，其他受試菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 噬菌體的富集

3只試驗(yàn)雞連續(xù)7 d每日灌服鼠傷寒沙門菌懸液1 mL (1.04×109CFU)。隨后參照Mclaughlin等[8]報(bào)道的方法富集噬菌體，即7 d后取1.0 g混合糞樣加入5 mL LB液體培養(yǎng)基，充分混勻，自然沉降10 min，取上清用滅菌濾紙過濾。濾液經(jīng)12 000 r·min-1離心10 min，以0.22 μm孔徑的滅菌濾膜再次過濾，取2 mL收集的液體與10 mL處于對數(shù)生長期(OD600 nm= 0.6)的鼠傷寒沙門菌懸液混勻。37 ℃，170 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)過夜，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液重復(fù)3次富集培養(yǎng)操作，最后用0.22 μm微孔濾膜過濾以除去殘留的細(xì)菌細(xì)胞，以獲取含噬菌體的原液，分裝，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 噬菌體的分離與純化

將20 μL噬菌體原液與500 μL對數(shù)生長期鼠傷寒沙門菌懸液混勻，加入5 mL冷卻至50 ℃的含7 g·L-1瓊脂的LB培養(yǎng)基，倒至預(yù)先凝固的LB平板上制成雙層平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)噬菌斑，接種于菌液，37 ℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，取樣制成雙層平板進(jìn)行純化，反復(fù)純化2～3次。

1.4 噬菌體生物學(xué)特性分析

1.4.1 噬菌體效價(jià)測定 以LB培養(yǎng)液對純化噬菌體液進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，各取10 μL稀釋液與10 μL宿主菌懸液混合，靜置3 min，迅速制成雙層平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，取噬菌斑數(shù)在30～300的平板計(jì)數(shù)，計(jì)算噬菌體效價(jià)。噬菌體效價(jià)(PFU·mL-1)= 噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×100[9]。

1.4.2 噬菌體核酸類型鑒定及其宿主譜分析 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取噬菌體基因組[10]，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩７謩e加入RNase A和DNase Ⅰ進(jìn)行處理核酸樣品，37 ℃溫育30 min；分別使用限制性內(nèi)切酶SacⅠ、EcoR Ⅴ、EcoR Ⅰ對噬菌體基因組進(jìn)行酶切，隨后點(diǎn)樣5 μL于10 g·L-1瓊脂糖凝膠做電泳分析。根據(jù)酶切圖譜，估算病毒基因組大小。將噬菌體溶液滴加于單層細(xì)菌培養(yǎng)物表面，培養(yǎng)12 h，觀察噬菌體對各受試菌株的裂解情況，確定其宿主譜。

1.4.3 噬菌體最佳感染比(MOI) 將噬菌體與鼠傷寒沙門菌混勻成1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1的不同比例，37 ℃孵育3 min，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用5 mL LB液體培養(yǎng)基輕輕吹打重懸菌體，37 ℃ 170 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h，12 000 r·min-1離心2 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取上清，按“1.3”方法灌制雙層平板測定噬菌體滴度，最佳感染比為產(chǎn)生最高噬菌體滴度的比例[11-12]。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)兩個(gè)平行(下同)。

1.4.4 噬菌體一步生長曲線 將噬菌體與鼠傷寒沙門菌按最適MOI值混勻，37 ℃孵育5 min，4 000 r·min-1離心5 min，立即棄上清，以液體LB培養(yǎng)基輕洗沉淀，然后，加入液體LB培養(yǎng)基置于恒溫水浴振蕩器，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)2 h，以開始培養(yǎng)記作0 min，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣測定噬菌體效價(jià)，試驗(yàn)重復(fù)3次。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，取效價(jià)平均值繪制一步生長曲線圖，并計(jì)算噬菌體裂解量，裂解量=裂解末期噬菌體滴度/初期宿主菌濃度[13]。

1.4.5 噬菌體熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性 取5 mL新鮮噬菌體溶液(1×107PFU·mL-1)分別于20、30、40、50、60、70、80 ℃水浴鍋孵育1 h，迅速冷卻樣品，取樣制雙層平板測定噬菌體效價(jià)，每組重復(fù)3次[14]。 將緩沖蛋白胨水(BPW)pH分別調(diào)整為1、2、4、6、7、8、10和12，與噬菌體(1×107PFU·mL-1)按9∶1體積比分別混合，37 ℃孵育1 h，雙層平板法測定噬菌體效價(jià)，每組重復(fù)3次[15]。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離純化及其效價(jià)

采用雙層平板法分離純化出1株鼠傷寒沙門菌烈性噬菌體，命名為KM104。該噬菌體在雙層瓊脂平板上形成清晰圓形空斑，噬菌斑直徑在1 mm左右(圖1)。

圖1 噬菌體KM104形成的噬菌斑Fig.1 The plaques produced by phage KM104

2.2 噬菌體核酸類型及宿主譜

KM104噬菌體核酸經(jīng)DNase Ⅰ處理后完全降解，而不被RNase A降解，表明核酸類型為DNA?；蚪M能被限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ消化為多個(gè)片段，根據(jù)酶切片段大小估算基因組大小約為28 kb。

噬菌體KM104能有效裂解YS7、ND104 2株鼠傷寒沙門菌；也能裂解YN2、YS4、YS2、YS6 4株沙門菌，但效果不理想。詳情見表1。

M. 15 kb相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. KM104基因組; 2. DNase 處理基因組; 3. RNase A處理基因組; 4. Sac Ⅰ酶切基因組; 5. EcoR Ⅴ酶切基因組; 6. EcoR Ⅰ酶切基因組 M. 15 kb molecular marker; 1. Genome of phage KM104; 2. DNase Ⅰ treated genome; 3. RNase A-treated genome; 4. Sac Ⅰ digested genome; 5. EcoR Ⅴ digested genome; 6. EcoR Ⅰ digested genome圖2 噬菌體KM104核酸類型及酶切電泳分析Fig.2 The electrophoresis analysis of nucleic acid type of phage KM104 and enzyme digestion

2.3 噬菌體最佳感染比(MOI)

噬菌體KM104的MOI為1∶10時(shí)，產(chǎn)生子代噬菌體的效價(jià)最高，達(dá)4.6×108PFU·mL-1，故1∶10 是KM104擴(kuò)增時(shí)的最適MOI值(表2)。

2.4 噬菌體一步生長曲線

在最佳感染比(MOI=0.1)條件下測定噬菌體的一步生長曲線(圖3)，顯示噬菌體KM104與宿主菌作用6 min后效價(jià)顯著升高，表明KM104潛伏期為6 min，而后效價(jià)平穩(wěn)持續(xù)上升，一直持續(xù)到70 min。 噬菌體裂解量為41(1.31×108/3.2×106)。

2.5 噬菌體熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性

噬菌體KM104經(jīng)20～60 ℃水浴處理1 h后效價(jià)基本不發(fā)生改變，但經(jīng)70 ℃處理1 h后效價(jià)下降約70%，80 ℃處理 1 h后完全失活(圖4)。

在pH 2.0～8.0時(shí)，噬菌體KM104效價(jià)與初始效價(jià)無顯著變化，維持良好的裂解活性，但當(dāng)pH達(dá)到10以上，噬菌體活性快速下降，pH達(dá)12時(shí)噬菌體活性完全消失，表明噬菌體KM104耐酸性強(qiáng)，不耐強(qiáng)堿性環(huán)境(圖5)。

表1 KM104宿主譜

表2 噬菌體KM104最佳感染比測定

圖3 噬菌體KM104一步生長曲線Fig.3 The one-step growth curve of phage KM104

圖4 噬菌體KM104熱穩(wěn)定性Fig.4 The thermal stability of phage KM104

圖5 噬菌體KM104 pH穩(wěn)定性Fig.5 The pH stability of phage KM104

2.6 噬菌體體內(nèi)裂解能力

感染未治療組小鼠24 h開始出現(xiàn)死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)鼠肝、脾腫大充血，腸系膜靜脈充血，部分腸道壞死；感染治療組小鼠72 h內(nèi)未見死亡，剖檢僅見脾輕微充血，腸腔內(nèi)有少量黃色漿液性內(nèi)容物；未感染治療組小鼠72 h內(nèi)未見死亡，剖檢僅見腸腔內(nèi)容物增多(圖6)。

感染未治療組及感染治療組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)與對照組差異極顯著(P<0.01)；未感染治療組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)略高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)(圖7)。

小鼠十二指腸切片經(jīng)HE染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)，感染未治療組小鼠十二指腸黏膜下層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血及出血，腸腺細(xì)胞質(zhì)深染，腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，絨毛上皮嚴(yán)重脫落，固有層有炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主)浸潤；感染后治療組小鼠十二指腸小腸絨毛僅有少量脫落，絨毛上皮有少量的杯狀細(xì)胞，少量充血和炎性細(xì)胞。未感染治療組與對照組，十二指腸形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)染色均勻(圖8)。與對照組相比，感染未治療組十二指腸絨毛高度和腺窩深度降低，差異極顯著(P<0.01)，而噬菌體治療可顯著改善沙門菌誘導(dǎo)的這種降低(圖9)。

3 討 論

本試驗(yàn)前期嘗試在污水溝、池塘、雞場堆糞坑等多處采樣分離噬菌體，均未獲得成功，究其原因可能與噬菌體密度小和宿主譜狹窄有關(guān)。之后通過給雞提供人為添加宿主菌株的飲水以誘導(dǎo)相應(yīng)噬菌體在體內(nèi)增殖，成功從試驗(yàn)雞糞便中分離得到1株鼠傷寒沙門菌烈性噬菌體。該株噬菌體(KM104)能夠裂解鼠傷寒沙門菌，但對甲型副傷寒沙門菌裂解作用明顯較弱，未見其裂解腸炎沙門菌，表明該株噬菌體有較強(qiáng)的宿主特異性。若應(yīng)用于動物生產(chǎn)，針對其宿主譜較窄的不足，可與其他噬菌體合用，或?qū)刂剖删w裂菌譜的基因片段進(jìn)行基因工程改造以增加其裂菌譜[16]。

1. 感染未治療組; 2. 感染后治療組; 3. 未感染治療組; 4. 對照組。A. 肝; B. 脾; C. 胃及腸道 1. The infected but untreated group; 2. The infected and treated group; 3. The uninfected but treated group; 4. The control group; A. Liver; B. Spleen; C. Stomach and intestine圖6 不同處理組小鼠病理變化(部分樣品)Fig.6 The gross lesion in groups of mice with different treatment (partial samples)

#.0.01

A. 對照組; B. 未感染治療組; C. 感染未治療組; D. 感染治療組 A. Control group; B. Uninfected but treated group; C. Infected but untreated group; D. Infected and treated group圖8 不同處理組十二指腸HE染色(400×)Fig.8 HE staining of the duodenum in groups with different treatment (400×)

噬菌體KM104在pH為2～8效價(jià)保持穩(wěn)定，即使在pH為1的強(qiáng)酸性條件下仍能保留一定活性，鑒于動物胃酸通常保持pH≥2.2，這將利于該噬菌體的口服應(yīng)用，其耐酸堿能力強(qiáng)于SP17、T139、SLMP1等噬菌體[17-19]；噬菌體KM104的熱穩(wěn)定性也明顯優(yōu)于Pst87170、PS11等噬菌體[20-21]。

在測定噬菌體生長曲線時(shí)，按最適MOI混勻噬菌體與菌液后需37 ℃孵育10～15 min[22-24]，使噬菌體吸附于宿主菌，離心后洗滌菌體沉淀，再繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，按培養(yǎng)時(shí)間測定噬菌體效價(jià)。但本試驗(yàn)嘗試分別孵育10、15 min后測定噬菌體效價(jià)，均已錯(cuò)過噬菌體潛伏期的測定時(shí)間，后將孵育時(shí)間縮短為5 min，成功測出噬菌體潛伏期，約為6 min。表明KM104吸附期及潛伏期較短，能在短時(shí)間內(nèi)開始釋放子代噬菌體。

本試驗(yàn)采取腹腔注射，使用噬菌體KM104治療鼠傷寒沙門菌感染的小鼠，結(jié)果顯示，感染治療組小鼠存活率較感染未治療組提高75%，優(yōu)于趙影等[25]報(bào)道的沙門菌噬菌體治療效果；小鼠病理剖檢及十二指腸組織切片染色觀察可發(fā)現(xiàn)，使用噬菌體治療能減少感染鼠傷寒沙門菌引起的十二指腸損傷，且高效價(jià)的KM104對小鼠無明顯毒性，表明噬菌體KM104對鼠傷寒沙門菌感染具有良好治療效果。

4 結(jié) 論

通過給雞飼喂含鼠傷寒沙門菌的飲水，隨后從其糞便中分離到1株鼠傷寒沙門菌噬菌體(KM104)，該噬菌體潛伏期短，增殖迅速，熱穩(wěn)定性及酸堿耐受性良好，并在小鼠表現(xiàn)出較好的治療效果，顯示其具有應(yīng)用于生物防治的前景。