朱芷葳，藍(lán)吳濤，馬悅悅，李鵬飛，李 宏，張 磊，司文睿，馮江浩

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷030803；2. 山西省生物研究院有限公司，太原 030006)

黑色素瘤是一種由黑色素細(xì)胞惡變而形成的腫瘤，占所有皮膚惡性腫瘤的3%，由于其惡化速度快，轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，現(xiàn)如今已成為人類死亡率最高的皮膚癌之一[1]。在動(dòng)物中，黑色素瘤常見于家養(yǎng)貓、狗、豬的口腔、皮膚和足趾[2]。不論是人還是動(dòng)物，傳統(tǒng)手術(shù)治療預(yù)后差，復(fù)發(fā)性高，并不能根治黑色素瘤，因此，亟需尋找更為簡(jiǎn)單高效的治療方式[3]。MITF是黑色素生成過程中最關(guān)鍵的調(diào)控基因，可作為轉(zhuǎn)錄因子同啟動(dòng)子區(qū)域的M-box序列結(jié)合，影響黑色素的生成[4-5]。大蒜素(allicin)是大蒜的主要成分，是大蒜中最具生物活性的含硫化合物之一。近些年，隨著流行病學(xué)的研究，人們發(fā)現(xiàn)大蒜素可顯著提高機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，誘導(dǎo)生成干擾素，抑制腫瘤壞死因子的生成[6]。并且大蒜素能通過影響細(xì)胞周期、抑制原癌基因的激活、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等途徑降低癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力[7]。本試驗(yàn)研究不同濃度的大蒜素在相同處理時(shí)間下對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞中MITF基因及蛋白表達(dá)的作用，以及對(duì)B16F10細(xì)胞體外增殖和遷移能力的影響。為闡明大蒜素抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的作用及其分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，為動(dòng)物黑色素瘤的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞株由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院113號(hào)實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗購(gòu)自北京索萊寶有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京TaKaRa有限公司；MITF兔源單克隆抗體購(gòu)自上海Abcam，二抗山羊抗兔IgG購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司；Trizol購(gòu)自賽默飛世爾有限公司。

1.2 小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞體外培養(yǎng)與處理

將B16F10細(xì)胞從液氮中取出，水浴鍋迅速?gòu)?fù)蘇，加入終止液(DMEM+10%胎牛血清)離心后用完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶，置于5% CO2的37 ℃ 的培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%進(jìn)行傳代。加入0.25%胰酶消化，重懸后接種至六孔板。待細(xì)胞長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期即可加入不同濃度大蒜素(0、5、10、15、20和25 μg·mL-1)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 總RNA的提取與處理

將B16F10用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，加入Trizol混勻后冰浴靜置10 min。每個(gè)離心管加入1/5體積的氯仿混勻。冰浴靜置3 min后，離心15 min，取上清，加入等體積的異丙醇混勻，靜置10 min后,離心10 min。棄上清，加75 %乙醇洗滌后,離心10 min，將沉淀用30 μL DEPC處理水溶解，-80 ℃保存。

1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR體系

根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量試劑盒說明書要求，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。10 μL熒光定量體系檢測(cè)基因表達(dá)量。MITF引物，F(xiàn)：5′-CGAAAGTTGCAACGRGAACAGCA-3′；R：5′-GAGCCTGCATT-TCAAGTTCCTGTA-3′。β-actin引物,F：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′；R：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′。

1.5 總蛋白質(zhì)的提取與處理

將處理后的細(xì)胞懸浮液離心10 min。向細(xì)胞沉淀中加入添加了苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液，冰浴30 min， 離心，取上清液，并轉(zhuǎn)移到新離心管中，-80 ℃凍存。

1.6 Western blot

配制濃縮膠和分離膠，并變性蛋白用于上樣。進(jìn)行80 V濃縮，120 V分離后轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂牛奶封閉1 h，MITF一抗室溫作用1 h， TBST洗4次，每次5 min。加MITF二抗，搖床孵育1 h，10% TBST洗4次，每次5 min。加ECL發(fā)光液成像，以MITF和β-actin蛋白表達(dá)條帶作為AOI進(jìn)行平均光密度測(cè)定。

1.7 大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞體外增殖能力的影響

細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，在96孔板中每孔接種100 μL 1×105個(gè)細(xì)胞，37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中過夜。加入200 μL不同濃度大蒜素的培養(yǎng)基，使大蒜素終濃度為0、5、10、15和20 μg·mL-1。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在各孔中加入50 μL 50%三氯乙酸(TCA)，4 ℃冰箱放置1 h。 蒸餾水洗滌5次去除TCA，晾干。每孔加入100 μL的0.4% SRB染色液進(jìn)行染色，室溫靜置20 min。1%乙酸洗滌5次，除去未結(jié)合的SRB染色液。在空氣中干燥后，用DMSO溶解細(xì)胞，振蕩10 min。用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在515 nm處測(cè)定各孔的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算大蒜素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率。

1.8 大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞體外遷移能力的影響

將B16F10細(xì)胞接種于24孔板上待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%后劃痕。用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗1次，將漂浮的細(xì)胞洗去。加入含有不同濃度大蒜素的無血清DMEM培養(yǎng)基，使24孔板內(nèi)大蒜素終濃度為0、5、10、15、20 μg·mL-1，在37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)42 h，此時(shí)對(duì)照組劃痕基本愈合。在倒置顯微鏡下拍照分析劃痕寬度，使用Image J軟件進(jìn)行圖片處理。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

小鼠黑色素瘤B16F10增殖能力變化情況、熒光定量數(shù)據(jù)和Western blot數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析并繪圖，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度大蒜素處理后細(xì)胞MITF mRNA的表達(dá)量

不同濃度大蒜素處理細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞總RNA。熒光定量PCR檢測(cè)MITFmRNA的表達(dá)量。歸一化處理后，結(jié)果如圖1所示。對(duì)照組MITFmRNA的相對(duì)表達(dá)量最高，5、10、15、20 μg·mL-1大蒜素組MITFmRNA相對(duì)表達(dá)量均有所下降(P<0.01,P<0.001,P<0.001,P<0.001)， 呈現(xiàn)濃度依賴性。

**. P<0.01; ***. P<0.001圖1 不同濃度大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞MITF mRNA表達(dá)的影響Fig.1 The expression of MITF mRNA in B16F10 cell treated with different concentrations of allicins

2.2 不同濃度大蒜素處理后細(xì)胞MITF蛋白表達(dá)量

不同濃度的大蒜素處理細(xì)胞24 h后，提取蛋白。利用Western blot檢測(cè)MITF蛋白的表達(dá)量。結(jié)果如圖2A所示，其中，β-actin為內(nèi)參蛋白。隨著試驗(yàn)組大蒜素濃度的升高，MITF蛋白的表達(dá)量逐漸降低，呈劑量依賴性。圖2B是經(jīng)GraphPad Prism 8.0處理后的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，可以看出加入不同濃度(5、10、15、20 μg·mL-1) 大蒜素后，細(xì)胞中MITF蛋白的表達(dá)量均受到了顯著抑制(P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.001)。

**. P<0.01; ***. P<0.001圖2 MITF蛋白在B16F10細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 The expression of MITF protein in B16F10 cells

2.3 大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞增殖活性的影響

B16F10細(xì)胞增殖情況如表1所示，在每個(gè)濃度都設(shè)置了9個(gè)重復(fù)。從9組數(shù)據(jù)的平均值和最終的抑制率可看出大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞的增殖有抑制效果，且抑制效果隨濃度升高而增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，5、10、15、20 μg·mL-1大蒜素處理后B16F10細(xì)胞吸光度顯著降低(P<0.001)。結(jié)果顯示，大蒜素對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞存在抑制作用，且抑制率呈濃度依賴性增加。

表1 大蒜素對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖的影響

2.4 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)B16F10細(xì)胞體外遷移能力

由Image J軟件分析得出的細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。與空白組相比，在5 μg·mL-1濃度大蒜素處理42 h后，劃痕寬度相差不顯著，說明該濃度大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞的遷移影響較小。在10、15、20 μg·mL-1大蒜素處理細(xì)胞42 h后，細(xì)胞劃痕愈合程度明顯受到抑制。說明10、15、20 μg·mL-1的大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞的遷移具有明顯的抑制作用。

3 討 論

黑色素的異常增殖是導(dǎo)致黑色素成瘤的原因，傳統(tǒng)的手術(shù)治療方式就是切除病灶。近年來，隨著黑色素瘤發(fā)病率的不斷提高，寵物和畜牧動(dòng)物的健康受到了前所未有的挑戰(zhàn)。在我國(guó)馬[8]、牛[9]、犬[10]和豬[11]等動(dòng)物都有患黑色素瘤的先例，原發(fā)于皮膚部位，也存在于各種器官黏膜處。犬的口腔下頜黏膜是黑色素瘤常發(fā)部位，發(fā)病率達(dá)到53%，且小型犬和口腔黏膜較深的犬患口腔黑色素瘤的概率更大[12]。在貓的腫瘤疾病中，最常見的原發(fā)性腫瘤就是眼部的黑色素瘤，其發(fā)病率僅次于貓乳腺腫瘤，且約60%的病例會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致貓的生存期和生存質(zhì)量嚴(yán)重下降[13]。

MITF作為黑色素合成代謝通路上重要調(diào)控基因，起著中心樞紐的作用。MITF可以通過調(diào)控TYR基因家族間接參與黑素細(xì)胞的分化、增殖和轉(zhuǎn)移[14-15]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有10種MITF的異構(gòu)，其中，MITF-M只存在于黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞中[16]。在對(duì)白化榮昌豬眼圈周圍黑素生成相關(guān)基因分析后發(fā)現(xiàn)與正常黑眼膛毛色豬相比，白化個(gè)體中幾乎不存在黑色小體，MITF及其下游基因TYR、TYRP1表達(dá)量顯著降低[17]。將帶有MITF-M的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)綿羊細(xì)胞后，TYRP1表達(dá)量升高至5.06倍，黑色素生成顯著增加[18]。MITF的表達(dá)影響黑色素生成的同時(shí)，也可能導(dǎo)致黑色素細(xì)胞的癌變。已有的研究表明，MITF的表達(dá)含量能影響黑色素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及黑色素瘤的發(fā)生，且在黑色素瘤患者中，MITF處于失調(diào)的狀態(tài)[19]。Rheostat動(dòng)態(tài)模型把MITF作為一個(gè)動(dòng)態(tài)的變阻器，高水平的MITF使得細(xì)胞具有更多的增殖表型，低水平的MITF則導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性降低，具有更高的侵襲表型并具有腫瘤細(xì)胞起始特征，更低水平的MITF將導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。因此，MITF表達(dá)的穩(wěn)定是維持黑色素正常形成的關(guān)鍵，也是細(xì)胞維持正常狀態(tài)的重要一環(huán)。

A～E分別代表0、5、10、15、20 μg·mL-1大蒜素處理組；a. 0 h劃痕圖；b. ImageJ可視化的0 h劃痕圖；c. 42 h劃痕圖；d. ImageJ可視化的42 h劃痕圖 A-E represented 0, 5, 10, 15, and 20 μg·mL-1 allicin treatment groups, respectively；a. 0 h after wound healing assay；b. Visualized 0 h diagram in ImageJ；c.0 h after wound healing assay；d. Visualized 42 h diagram in ImageJ圖3 細(xì)胞劃痕結(jié)果Fig.3 The results of wound healing

大蒜素作為大蒜提取物，對(duì)于多種細(xì)菌都有殺滅的效果。以往對(duì)大蒜素的研究主要集中于其抗病毒、抗細(xì)菌以及抗真菌的功能[21-23]。近年來，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)大蒜素不僅有抑菌功能，并且對(duì)于多種腫瘤，如肝癌、胃癌、婦科惡性腫瘤等多種腫瘤的發(fā)展都有抑制效果[24-25]。在B16F10細(xì)胞中，大蒜提取液可通過下調(diào)Akt、Bcl-2基因和上調(diào)PTEN、Bax的表達(dá)來抑制增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26]。最近的研究表明，大蒜素可以參與并激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。另外，在胃癌SGC-7901細(xì)胞中，大蒜素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的凋亡，從而抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖能力[28]。總之，大蒜素對(duì)于腫瘤的抑制作用體現(xiàn)在影響基因表達(dá)、改變細(xì)胞信號(hào)通路和阻礙細(xì)胞周期等方面[29]。

本試驗(yàn)設(shè)置不同大蒜素濃度的試驗(yàn)組，采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)MITFmRNA和蛋白的表達(dá)水平；并通過SRB染色法和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)研究了大蒜素在體外對(duì)于小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞的增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，隨著試驗(yàn)組大蒜素濃度的升高，細(xì)胞中MITFmRNA的表達(dá)量逐漸降低，呈濃度依賴性；Western blot結(jié)果與qRT-PCR呈一致趨勢(shì)，隨著大蒜素濃度的升高，MITF蛋白的表達(dá)量逐漸降低。大蒜素在5、10、15、20 μg·mL-1濃度時(shí)對(duì)B16F10細(xì)胞增殖能力有顯著抑制效果(P<0.001)，且隨著濃度的升高抑制能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)大蒜素為20 μg·mL-1時(shí)，大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞的抑制率達(dá)到了44.22%。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜素對(duì)B16F10細(xì)胞的體外遷移有抑制作用。當(dāng)大蒜素濃度在10、15、20 μg·mL-1時(shí)劃痕愈合程度較低，對(duì)細(xì)胞遷移力抑制較大。

4 結(jié) 論

0～20 μg·mL-1大蒜素對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞的增殖、遷移都具有一定的抑制效果，且對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞MITF的表達(dá)有顯著的抑制效果，為進(jìn)一步研究動(dòng)物黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展及其治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。