于洋，尹琦，于爽*

(1.牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000；2.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650000)

森林作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成主體，它直接關(guān)系到在這個(gè)地球生活上的所有生物，與人類(lèi)更是有著無(wú)法分割的聯(lián)系，具有極大的生態(tài)重要性和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。林木遺傳育種在林業(yè)發(fā)展上是永恒的話(huà)題，常規(guī)育種的周期性較長(zhǎng)是林木遺傳育種的瓶頸問(wèn)題。1983年，科學(xué)家首次完成了對(duì)植物的遺傳改造，使加速植物育種成為可能。1986年，抗除草劑轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的問(wèn)世標(biāo)志著林木基因工程的誕生，迄今為止，已有幾十種林木獲得遺傳轉(zhuǎn)化[1]。

1 林木遺傳轉(zhuǎn)化的方法

理論上基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化方法共有十多種，但在林木中實(shí)際使用最為廣泛的就是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，其次是花粉管通道法和電穿孔法。

1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是將所需的目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，再利用農(nóng)桿菌侵染植株將T-DNA插入到植物基因組中，使目的基因高效表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不僅價(jià)格低廉，而且具有基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，這使其成為現(xiàn)代遺傳轉(zhuǎn)化中實(shí)用性最強(qiáng)的主導(dǎo)方式。

Nishitani等將目的基因PDS用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化蘋(píng)果，獲得的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果白化表型與類(lèi)胡蘿卜素含量均降低[2]；伍寧豐等選取中國(guó)南方楊樹(shù)N1069為受體材料，利用葉盤(pán)法將昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)蝎毒素AaIT基因轉(zhuǎn)化至受體中，轉(zhuǎn)基因楊對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)有明顯的抗性，致死率顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓闧3]；饒紅宇等通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)NL-80106，在諸多轉(zhuǎn)化株中，B45和B64對(duì)一齡舞毒蛾幼蟲(chóng)有明顯抗性，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)葉片的幼蟲(chóng)致死率顯著高于對(duì)照[4]。

1.2 基因槍法

基因槍法是將目的基因的遺傳片段依附在高速微彈上，利用物理原理通過(guò)高速發(fā)射直接使目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞或者受體組織中?；驑尫▽?duì)于目的基因的宿主選擇并無(wú)限制，且由于微彈的特殊性，使目的基因的受體作用類(lèi)型覆蓋面相當(dāng)大。喬利亞等利用基因槍法將Bt基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)，并獲得了抗蟲(chóng)效果明顯的轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊[5]；李玲等在對(duì)歐洲黑楊的研究中，使用基因槍法導(dǎo)入Barnase基因，最終得到了理想轉(zhuǎn)基因植株[6]；崔旭東用基因槍法將多種抗寒基因和多種功能基因同時(shí)整合到歐美楊渤豐1號(hào)染色體的遠(yuǎn)端，最終培育出理想的強(qiáng)抗旱轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)[7]。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法原理是當(dāng)植株子房成功授粉后，通過(guò)在其內(nèi)注入含有目的基因序列的核酸，當(dāng)子房開(kāi)始開(kāi)花受精時(shí)，植株會(huì)出現(xiàn)花粉管通道，所導(dǎo)入的核酸就通過(guò)花粉管通道將目的基因?qū)胧芫?xì)胞中，使外源基因被整合到受精卵基因組中得以表達(dá)，從而得到新的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。

花粉管通道法不同于其他分子層面的拼接技術(shù)，整個(gè)過(guò)程較為簡(jiǎn)便，且對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求不高，只要是開(kāi)花的單子葉或雙子葉林木，無(wú)論是多胚還是單胚都可以使用種質(zhì)轉(zhuǎn)化方式，并且可以直接將DNA重組分子導(dǎo)入。通過(guò)種質(zhì)轉(zhuǎn)化方式來(lái)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化只能在開(kāi)花植物的花期進(jìn)行，而且需要大規(guī)模群體化轉(zhuǎn)育。為了提高花粉管通道法在核桃中的轉(zhuǎn)化率，師校欣等用“清香”核桃做材料，采用切割柱頭滴加法、直接滴加法、子房注射法等方式，分別研究了外源基因?qū)胧荏w所需要的時(shí)間、基因溶液的最適濃度和導(dǎo)入方式對(duì)效率的影響[8]。

1.4 電擊法

細(xì)胞在經(jīng)過(guò)瞬時(shí)間數(shù)千伏特的高壓電的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生去極化，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)20～40 mm的瞬間微孔，當(dāng)微孔產(chǎn)生時(shí)，存在在懸液中的外源核酸從細(xì)胞膜上的微孔進(jìn)入，與細(xì)胞內(nèi)的受體細(xì)胞基因整合的過(guò)程叫做電擊法。電擊法操作簡(jiǎn)便，且作用效果直接高效，自從選用磁性納米顆粒作為外源基因的DNA載體后，其轉(zhuǎn)化效率也變得更高。

McCown 等利用電擊法將外源基因與Bt基因融合并導(dǎo)入雜種楊中，使轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生了對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的抗性[9]；Liu等利用電擊法將Bt基因?qū)肴A山松中，證明了當(dāng)電擊的受體為成熟的體細(xì)胞胚時(shí)，更加有利于外源基因的整合[10]。

2 林木基因工程的應(yīng)用

2.1 植物修復(fù)

工業(yè)的迅速發(fā)展不僅對(duì)土壤和水資源帶來(lái)了難以恢復(fù)的損傷，遺留的污染物更是給如今的人們留下了大大的難題，并且還存在化學(xué)殺蟲(chóng)劑殘留所導(dǎo)致的極端土質(zhì)等問(wèn)題。上世紀(jì)八十年代起運(yùn)用植物處理污染物的設(shè)想首次被提出，污染物治理的方法便開(kāi)始由物理化學(xué)手段向植物修復(fù)手段進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這也為林木應(yīng)用提供了一個(gè)育種方向。

柴文嫻獲得的轉(zhuǎn)MT基因的南林895楊樹(shù)既可以給具有揮發(fā)性的化學(xué)農(nóng)藥所釋放的碳?xì)浠衔锝舛?，還能夠吸收土質(zhì)中的重金屬元素[11]，是目前退耕還林和礦區(qū)種植的首選樹(shù)種類(lèi)型。Rugh 等獲得的改良汞還原酶(MerA)基因的轉(zhuǎn)基因黃楊可以使高毒的離子汞Hg(II)轉(zhuǎn)化為毒性低毒的元素汞Hg(O)[12]。

2.2 抗病蟲(chóng)害應(yīng)用

在林木漫長(zhǎng)的生長(zhǎng)期過(guò)程中病蟲(chóng)害會(huì)導(dǎo)致林木生長(zhǎng)受到抑制，降低林木存活率，從而造成森林面積的減少。現(xiàn)今由于人工林的樹(shù)種單一，且由無(wú)抗性純林組成，使其更容易被病蟲(chóng)侵害。隨著林木基因工程的發(fā)展，林木抗病蟲(chóng)害育種方面已有相當(dāng)廣泛和突出的應(yīng)用。

黃艷等將球孢白僵菌中的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入毛白楊中獲得了抗病轉(zhuǎn)基因株系[13]。自饒紅宇等獲得抗蟲(chóng)歐洲黑楊后，又相繼有抗舞毒蛾和天幕毛蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因雜種楊[14]、抗食葉昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因楊[15]和抗鞘翅目昆蟲(chóng)的741楊等問(wèn)世[16]。

2.3 抗逆改質(zhì)

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)拓寬林木生境、拯救極端環(huán)境的植物缺乏和改良林木品質(zhì)，一直是國(guó)內(nèi)外林木育種研究中的熱點(diǎn)，現(xiàn)已有諸多報(bào)道。

在抗逆方面，繼我國(guó)育成首例大田生產(chǎn)的抗鹽堿轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)—中天楊[17-18]后，楊春霞、姜超強(qiáng)等也相繼獲得了抗旱耐鹽的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)[19-20]；Arisi等獲得了抗凍性顯著提升的轉(zhuǎn)基因楊[21]。

在品質(zhì)改良領(lǐng)域，白爽將檉柳lea基因?qū)胄『跅睿Y(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因楊光合效率更高[22]，姜超強(qiáng)將AtNHX1基因轉(zhuǎn)入歐美107楊中，也獲得了光合作用效率更高的轉(zhuǎn)基因植株[23]；張國(guó)壁通過(guò)轉(zhuǎn)AlaAT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)基因提高了小黑楊固氮效率[24]；Hu等將輔酶A連接酶(4cl)基因轉(zhuǎn)入美洲山楊，轉(zhuǎn)基因楊木質(zhì)素下降了45%，且纖維素增加了15%[25]；Weigel 等將擬南芥Leafy基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)中得到轉(zhuǎn)基因楊，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因楊的花期明顯提前[26]；何業(yè)華等將番茄ACC合成酶反義基因?qū)氩煌臈楊?lèi)品種，最終獲得耐儲(chǔ)存轉(zhuǎn)基因棗類(lèi)品種[27]。

3 林木基因工程展望

森林作為生態(tài)環(huán)境和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要一環(huán)，所能創(chuàng)造的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值是非常巨大的?？傮w看來(lái)，林木基因工程具有非常廣闊的發(fā)展空間，當(dāng)前林木基因工程正處于前人開(kāi)疆，后人擴(kuò)土的絕佳發(fā)展層面，要保持充分的投入，才會(huì)保證發(fā)展的可持續(xù)性。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于林木遺傳改良已有幾十年的歷史，但還存在一些技術(shù)問(wèn)題有待解決，如常用轉(zhuǎn)化手段的轉(zhuǎn)化效率問(wèn)題、個(gè)別樹(shù)種轉(zhuǎn)基因體系建立的問(wèn)題等。此外，轉(zhuǎn)基因物種的安全性問(wèn)題也不容回避，甚至關(guān)乎林木基因工程的未來(lái)發(fā)展和可行性。