牛 慧 童津津* 熊本海 蔣林樹

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

炎癥是一種以防御為主的反應(yīng)，能夠阻止微生物感染和修復(fù)損傷組織[1]。然而，炎癥也有負(fù)面影響，動物不同部位或器官的炎癥引發(fā)不同的疾病，給動物養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失比較嚴(yán)重，如奶牛乳腺炎不僅會使奶牛產(chǎn)奶量降低，而且也會降低牛乳的質(zhì)量[2]；奶牛子宮內(nèi)膜炎會導(dǎo)致其繁殖力下降，誘發(fā)乳腺炎和真胃移位等疾病[3]；母豬陰道炎會使母豬配種返情，降低配種分娩力[4]；蛋雞腹膜炎會造成產(chǎn)蛋率下降甚至蛋雞死亡等[5]。因此，在動物飼養(yǎng)管理過程中，提高動物機(jī)體的免疫力，減少炎性疾病的發(fā)生是健康養(yǎng)殖的重點(diǎn)內(nèi)容。

泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，廣泛參與包括炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在內(nèi)的各種生理過程[6]。在泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)的作用下，泛素分子的C末端氨基酸通過異肽鍵與靶蛋白上的賴氨酸相連。此外，泛素分子通過自身的8個(gè)氨基酸殘基(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)中的某一個(gè)與另一個(gè)泛素分子C端連接，形成不同鍵的多泛素鏈，每一個(gè)殘基連接位點(diǎn)都會導(dǎo)致靶蛋白不同的結(jié)果[7]。K48介導(dǎo)的泛素化通常參與指導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶體依賴性降解[8]，而K63介導(dǎo)的泛素化介導(dǎo)非蛋白降解的多種作用，例如調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、囊泡運(yùn)輸和蛋白激酶的激活等[9]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)家族是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)許多免疫相關(guān)基因的表達(dá)，尤其是編碼炎性細(xì)胞因子、趨化性細(xì)胞因子以及其他對免疫系統(tǒng)生長發(fā)育重要的基因[10]。此外，NF-κB途徑誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的激活，促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟與滲出，對于激活炎癥的級聯(lián)反應(yīng)也是十分重要的[11]。本文圍繞泛素化在NF-κB系統(tǒng)和NLRP3炎性小體激活中的調(diào)控作用進(jìn)行綜述，以期更好地調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體健康。

1 泛素化修飾對NF-κB系統(tǒng)激活的調(diào)控

NF-κB信號系統(tǒng)是指NF-κB二聚體、NF-κB抑制蛋白(I-κB)和I-κB激酶(IKK)(包含IKKα、IKKβ和NEMO)之間的相互作用[12]，它能響應(yīng)多種刺激，如微生物病原體、炎性因子和自由基等。而泛素化在各種因素誘導(dǎo)的NF-κB系統(tǒng)激活中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

1.1 病原體激活NF-κB中的泛素化調(diào)節(jié)作用

細(xì)胞是一道能有效抵御病毒、細(xì)菌和寄生蟲等微生物病原體入侵的重要物理防線，其通過不同的模式識別受體(PRRs)檢測微生物病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)的類型，觸發(fā)不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，啟動炎癥反應(yīng)。Toll樣受體(TLR)存在于細(xì)胞表面，TLR4可識別大腸桿菌的內(nèi)毒素——脂多糖(LPS)，髓樣分化因子88(MyD88)與TLR4的結(jié)合導(dǎo)致IL-1受體相關(guān)激酶1/4(IRAK1/4)的招募和磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TRAF-6)的寡聚和自身泛素化[13]，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)化生長因子激活酶1(TAK1)激活I(lǐng)KK，最終導(dǎo)致NF-κB和活化蛋白-1(AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子的啟動，從而誘導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，富含多酚的蜂膠提取物通過干擾TRAF-6依賴的多泛素鏈形成及其泛素化緩解LPS誘導(dǎo)的炎癥過程，降低了RAW 264.7巨噬細(xì)胞中IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產(chǎn)生。Zhang等[15]研究表明，水甘草堿通過遏制TRAF6泛素化降低LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)。同時(shí)，Yao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激誘導(dǎo)激活TAK1和蛋白激酶B(AKT)，導(dǎo)致iNOS、環(huán)氧合酶-2(COX-2)和多種促炎因子的高表達(dá)，而蒲公英醇通過降低TAK1的多泛素化抑制了RAW 264.7細(xì)胞中NF-κB的活化。

TLR2能夠識別革蘭氏陽性菌的肽聚糖[17]，如金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌等[18]。金黃色葡萄球菌會造成奶?；寂R床型乳腺炎，但它也會導(dǎo)致奶牛出現(xiàn)無明顯肉眼可見臨床癥狀且難以治療的乳腺內(nèi)感染[19]。Ge等[20]研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英可以通過TLR2-NF-κB/絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途徑抵抗炎癥，防治金黃色葡萄球菌的感染。且在這一通路中，蛋白免疫印跡(Western blot)檢測結(jié)果表明NF-κB相關(guān)蛋白的磷酸化受到了抑制。因?yàn)榈孜锏鞍椎牧姿峄窃摰鞍捉?jīng)泛素蛋白酶體途徑降解的基礎(chǔ)[21-22]，所以蒲公英在發(fā)揮抗炎過程中同樣抑制了NF-κB通路關(guān)鍵蛋白的泛素化。Guo等[23]研究顯示，木犀草素能夠阻礙小鼠乳腺上皮細(xì)胞中IκB-α和NF-κB p65的磷酸化程度以及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，這些發(fā)現(xiàn)表明木犀草素是減少金黃色葡萄球菌型奶牛乳腺炎組織損傷的潛在療法。無乳鏈球菌是造成奶牛隱型乳腺炎的主要病原體之一[24]，且患病奶牛自愈率不高。孫銘維等[25]利用Western blot技術(shù)檢測了殼聚糖對無乳鏈球菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中NF-κB和MAPK通路相關(guān)蛋白磷酸化的影響。研究表明，殼聚糖抑制了NF-κB p65的磷酸化，即阻礙了NF-κB二聚體的核移位[26]。同時(shí)，p38 MAPK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化程度顯著下降，有效減少了炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8的表達(dá)。因此，在病原體誘導(dǎo)的NF-κB激活中，可通過調(diào)節(jié)TRAF-6、TAK1和IκB-α等關(guān)鍵蛋白的泛素化調(diào)控機(jī)體炎癥通路的活化水平，防止炎性因子的過度產(chǎn)生，使得機(jī)體免疫系統(tǒng)維持在健康狀態(tài)。

1.2 炎性因子激活NF-κB中的泛素化調(diào)節(jié)作用

IL-1和TNF-α是誘導(dǎo)NF-κB活化的常見細(xì)胞因子[27]。對于過量炎性因子導(dǎo)致的細(xì)胞炎癥中，IL-1刺激細(xì)胞上的IL-1受體，導(dǎo)致TRAF-6的激活，該酶催化K63多泛素鏈的合成，靶向激活TAK1激酶。IKK繼而被激活，IκB-α發(fā)生磷酸化和泛素化降解，引起NF-κB的激活[14, 28]。在TNF-α途徑中，TNF-α招募多種E3泛素連接酶到TNF受體，包括TRAF2/5和細(xì)胞凋亡抑制蛋白CIAP1/2等[29]。這些E3泛素連接酶與E2泛素結(jié)合酶催化K63、K11和線性化多聚泛素鏈的形成，招募TAK1和TAK1結(jié)合蛋白(TAB)，最終引起NF-κB的激活[30]。高玲等[31]利用IL-1β和TNF-α對大鼠皮層的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行處理，Western blot結(jié)果表明二者均可誘導(dǎo)NF-κB的激活。Windheim等[32]研究表明，IL-1誘導(dǎo)IRAK1的K63連接的多聚泛素化，促進(jìn)NEMO的結(jié)合和IKK的激活。Zhang等[33]用生物素標(biāo)記的TNF-α和磁珠進(jìn)行免疫共沉淀，并用Western blot技術(shù)檢測了RIP1對TNF受體的募集和泛素化，結(jié)果表明TRAF-2環(huán)狀結(jié)構(gòu)域在TNF-α誘導(dǎo)的RIP1泛素化過程中起重要作用，但是TRAF-2介導(dǎo)的RIP1泛素化在TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化中沒有實(shí)質(zhì)性作用。

1.3 自由基激活NF-κB中的泛素化調(diào)節(jié)作用

動物機(jī)體在受到各種氧化應(yīng)激時(shí)，如分娩、高溫、飼糧成分的改變等，體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，機(jī)體自由基產(chǎn)生過多，造成炎性細(xì)胞浸潤、組織損傷等現(xiàn)象[34]。K63連接的多泛素化是一種氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子[35]。Silva等[35]利用氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對過氧化氫(H2O2)處理的酵母菌株進(jìn)行蛋白組分析，結(jié)果表明K63連接的多泛素化在細(xì)胞中立即增加，使細(xì)胞對應(yīng)激更加敏感。同時(shí)，外源H2O2會影響IκB-α酪氨酸殘基的磷酸化，進(jìn)而影響IκB-α的泛素化和降解以及NF-κB途徑的激活[36]。此外，活性氧(ROS)還能通過失活泛素結(jié)合酶12(Ubc12)干擾IκB-α泛素化降解，進(jìn)而啟動NF-κB的活化[37]。

為了對抗氧化應(yīng)激，細(xì)胞需要感知ROS水平并保護(hù)機(jī)體免受自由基損傷。為此，細(xì)胞誘導(dǎo)一系列基因的協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)在誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激基因表達(dá)中起著中心作用，如誘導(dǎo)NADPH醌氧化還原酶1(NQO1)和血紅素加氧酶-1(HO-1)等抗氧化分子的表達(dá)[38]。Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Keap1)是調(diào)節(jié)Nrf2活性所必需的細(xì)胞質(zhì)蛋白。在非應(yīng)激條件下，Nrf2不斷被E3連接酶復(fù)合物Cul3-Keap1泛素化，并在蛋白酶體中迅速降解；當(dāng)細(xì)胞被自由基刺激時(shí)，Keap1的半胱氨酸殘基被修飾，導(dǎo)致E3泛素連接酶活性下降，然后細(xì)胞核中的Nrf2積聚，由抗氧化反應(yīng)元件(ARE)激活抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄[39]。Shin等[40]用姜黃素處理小鼠表皮細(xì)胞(JB6 Cl41)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot結(jié)果顯示姜黃素誘導(dǎo)Nrf2蛋白表達(dá)而不改變其mRNA轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)態(tài)水平，這說明姜黃素能阻止Nrf2泛素化和后續(xù)的26S蛋白酶體降解，且質(zhì)譜分析結(jié)果表明姜黃素的α，β-不飽和羰基部分可能是其與Keap1結(jié)合的靶點(diǎn)。同時(shí)，姜黃素通過Nrf2通路緩解H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激也已經(jīng)得到了證實(shí)[38]。Chen等[41]利用ARE熒光素酶法檢測了青蒿素處理的MDA-MB-231轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿素以劑量依賴式誘導(dǎo)ARE依賴的熒光素酶活性增加，且Western blot結(jié)果表明青蒿素通過降低Nrf2泛素化的方式在蛋白質(zhì)水平上穩(wěn)定Nrf2。以上的研究表明，針對氧化應(yīng)激通路中關(guān)鍵蛋白的泛素化調(diào)節(jié)自由基引起的炎癥等疾病具有廣闊的前景。

2 泛素化修飾對NLRP3炎性小體激活的調(diào)控

NLRP3炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)和調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵成分，由炎癥體傳感分子NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸酶-1前體(pro-Caspase-1)組成[42]。NLRP3炎癥小體的活化分為2個(gè)時(shí)期，首先在啟動時(shí)期，TLR通過識別危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMP)或病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，激活NF-κB通路，導(dǎo)致炎癥小體相關(guān)成分NLRP3和IL-1β前體(pro-IL-1β)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)[43]；第2個(gè)時(shí)期是NLRP3的寡聚和組裝，然后參與半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)激活和IL-1β及IL-18的成熟與滲出，從而引發(fā)炎癥相關(guān)的細(xì)胞焦亡[44-45]。因此，抑制第1或第2階段信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都能抑制炎癥。Blonska等[46]研究表明，楊梅素能夠抑制NF-κB的激活，顯著降低IL-1β的mRNA水平。同時(shí)，楊梅素對NLRP3激活的第二信號通路也有抑制作用。Chen等[11]通過在膿毒癥小鼠腹腔中注射楊梅素，利用Western blot技術(shù)分析了腹膜巨噬細(xì)胞中的泛素化水平，結(jié)果表明LPS的刺激能夠促進(jìn)NLRP3去泛素化進(jìn)而激活NLRP3炎性小體，而楊梅素則通過促進(jìn)NLRP3泛素化和減少ASC泛素化來阻斷NLRP3炎癥小體的組裝，從而發(fā)揮抗炎作用。Zheng等[47]檢測了脂質(zhì)介質(zhì)Maresin1對LPS誘導(dǎo)的野生型小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDMs)中NLRP3泛素化的影響，Western blot結(jié)果顯示Maresin1通過促進(jìn)K63連接的NLRP3多泛素化來阻礙炎性小體的激活。此外，NLRP3炎性小體激活也經(jīng)常被報(bào)道與ROS相關(guān)，且通過第1時(shí)期NF-κB信號通路調(diào)控NLRP3炎癥小體啟動，許多抗氧化劑如褪黑素通過阻礙NLRP3炎性小體的激活來除去過多的ROS，并緩解炎癥反應(yīng)[48]。

3 小 結(jié)

炎癥是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到免疫系統(tǒng)中不同的信號通路，如NF-κB信號通路和NLRP3炎性小體的激活參與協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。炎癥是一個(gè)動態(tài)的過程，當(dāng)機(jī)體受到各種刺激時(shí)，炎癥信號通路上的蛋白質(zhì)受到多種翻譯后修飾的調(diào)控，特別是泛素化修飾在通路蛋白發(fā)生降解中的動態(tài)調(diào)節(jié)作用。因此，了解泛素化修飾在NF-κB和NLRP3炎性小體激活中的作用及進(jìn)展，可以為調(diào)控動物機(jī)體的炎癥水平提供更多的理論依據(jù)，具有實(shí)際意義。