傅 巖 張鐵鷹* 孫英霞 李松育

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太原 030801)

角蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、疏水性極強[1-2]，動物內(nèi)源蛋白酶難以將其有效降解[3]。家禽屠宰副產(chǎn)物羽毛中粗蛋白質(zhì)含量在90%以上，若能高效利用可有助于緩解我國蛋白質(zhì)飼料資源供需矛盾。傳統(tǒng)物理、化學(xué)方法處理角蛋白存在諸多不足，產(chǎn)品氨基酸營養(yǎng)品質(zhì)差，且易產(chǎn)生環(huán)境污染[4-5]。目前，已經(jīng)發(fā)掘出多種角蛋白降解菌，包括細菌[6-9]、真菌[10-12]、放線菌等[13-14]，這些菌株均可分泌能特異性降解角蛋白的蛋白酶——角蛋白酶。角蛋白酶可水解不溶性角蛋白[15-16]，是處理羽毛等角蛋白資源的較優(yōu)的生物制品[5,17]，可用于處理羽毛，提高其營養(yǎng)價值[18-19]，或直接用作飼料添加劑[20]。

角蛋白熱穩(wěn)定性強，可耐受飼料制粒溫度，在高溫條件下可提高其酶促反應(yīng)速率。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌CP-16角蛋白酶的熱穩(wěn)定性不佳[15]。因此，改善角蛋白酶熱穩(wěn)定性，對提高其酶解羽毛角蛋白效率和在畜禽飼糧中應(yīng)用具有重要意義。目前有關(guān)角蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能的研究報道較少，大多設(shè)計均參考同源性較高的其他類型蛋白酶[21]。易錯PCR無需了解蛋白酶結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，可快速建立突變體文庫，實現(xiàn)角蛋白酶分子改良[22-23]。因此，本研究擬通過易錯PCR構(gòu)建角蛋白酶突變體文庫，以期獲得活力高、耐溫性好的角蛋白酶突變體，提高其在飼料工業(yè)中的適用性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：脫脂奶粉20 g/L，瓊脂粉15 g/L，高壓滅菌15 min后，加入卡那霉素至終濃度50 μg/mL，制作平板，冷卻備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基(50 μg/mL卡那霉素)。

1.2 角蛋白酶突變文庫的構(gòu)建

以含角蛋白酶基因的重組質(zhì)粒pWB980-K-His為模板，使用特異基因的上游、下游引物對角蛋白酶基因進行易錯PCR擴增，使用引物對載體pWB980-K-His進行線性化擴增。

表1 引物序列

參考Zhang等[24]的方法，將純化后的線性化載體和角蛋白酶基因片段進行延長重疊延伸PCR(POE-PCR)，以實現(xiàn)質(zhì)粒多聚化。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)SCK6感受態(tài)細胞，稀釋涂布于牛奶篩選平板。

1.3 突變體初篩與復(fù)篩

為同時獲得活性高、熱穩(wěn)定性好的突變體，挑選水解圈與菌落直徑比值大于野生型的陽性轉(zhuǎn)化子，搖瓶發(fā)酵，檢測粗酶液角蛋白酶活性和熱穩(wěn)定性，進行復(fù)篩。以100目脫脂羽毛粉(0.5%)為底物，測定經(jīng)70 ℃熱處理5 min后的粗酶液殘留酶活性(以未經(jīng)處理的粗酶液酶活性為100%)。角蛋白酶活性測定參考王德山[15]的方法。

1.4 野生型和突變型角蛋白酶的純化

以復(fù)篩后的正向突變菌株為出發(fā)菌，制備粗酶液，經(jīng)超濾濃縮、鎳柱純化獲得目的蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證純化后酶蛋白純度及分子質(zhì)量。

1.5 野生型和突變型角蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

真實底物羽毛粉為不溶底物，為保證數(shù)據(jù)的精準性，酶學(xué)性質(zhì)測定均使用可溶性蛋白-酪蛋白為底物[15]，所有處理均設(shè)置3個重復(fù)。

分別于不同pH(7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0、13.0)緩沖液體系，55 ℃，測定野生型和突變型角蛋白酶活性，確定適宜pH。以最高酶活性為100%，繪制酶活性隨pH變化曲線。所用緩沖體系：Tris-HCL緩沖體系(200 mmol/L，pH 7.0～9.0)，硼砂-氫氧化鈉緩沖體系(100 mmol/L，pH 9.5～12.0)，氯化鉀-氫氧化鈉緩沖體系(pH 13.0)。

在適宜pH和不同反應(yīng)溫度(40、45、50、55、60、65、70、75 ℃)條件下，測定野生型和突變型角蛋白酶活性，確定適宜反應(yīng)溫度，最高的酶活性定義為100%，繪制相對酶活性隨反應(yīng)溫度變化曲線。

純酶液分別在55、65、75、85 ℃下熱處理5 min，適宜條件下測定酶活性，以未經(jīng)處理的酶活性為100%，計算不同溫度處理后的酶活性殘留率。

配制不同濃度(0.5、0.8、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、5.0、8.0、10.0、12.0 mg/mL)酪蛋白底物溶液，適宜條件下反應(yīng)10 min，測定酶活性。利用雙倒數(shù)法作圖，計算動力學(xué)參數(shù)。

1.6 野生型和突變型角蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建與分析

運用SWISS-MODEL[24]和Discovery Studio Visualizer 4.0對野生型和突變型角蛋白酶晶體進行同源建模及三維結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié) 果

2.1 突變型角蛋白酶初篩與復(fù)篩

經(jīng)易錯PCR成功構(gòu)建出角蛋白酶突變體文庫(圖1)，在牛奶平板挑選水解圈與菌落直徑比值不小于野生型的轉(zhuǎn)化子共564株進行搖瓶發(fā)酵，測定角蛋白酶的熱處理后殘留酶活性，獲得3株正向突變體。由表2可知，角蛋白酶突變體A307V/S346T、R70G、N245K熱處理后殘留酶活性分別為72.12%、86.12%、74.82%，均高于野生型角蛋白酶(50.32%)。

圖1 陽性轉(zhuǎn)化子在牛奶平板上產(chǎn)生的水解圈

2.2 野生型和突變型角蛋白酶純化后酶蛋白SDS-PAGE分析

野生型和突變型角蛋白酶純化后酶蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果見圖2，目的蛋白條帶分子質(zhì)量與預(yù)期一致，單一、無雜帶，可用于下一步分析。

2.3 野生型和突變型角蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)分析

經(jīng)不同pH條件下蛋白酶活性測定分析，野生型角蛋白酶和角蛋白酶突變體A307V/S346T適宜pH為10，角蛋白酶突變體R70G、N245K適宜pH為11(圖3)。這說明突變位點影響了其適宜pH。

不同溫度條件下，角蛋白酶突變體A307V/S346T、R70G、N245K適宜反應(yīng)溫度相較野生型發(fā)生偏移(圖4)；同時，角蛋白酶突變體A307V/S346T、R70G、N245K的熱穩(wěn)定性也相應(yīng)提升(表3)。這說明突變位點均影響了其適宜反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性。

表2 野生型與突變型角蛋白酶發(fā)酵液酶活性及熱處理后殘留酶活性

M：中分子質(zhì)量蛋白 marker；1：野生型 wild-type；2：突變體A307V/S346T mutant A307V/S346T；3：突變體R70G mutant R70G；4：突變體N245K mutant N245K。

圖3 野生型與突變型角蛋白酶適宜pH

圖4 野生型與突變型角蛋白酶適宜反應(yīng)溫度

2.4 野生型和突變型角蛋白酶動力學(xué)參數(shù)

采用雙倒數(shù)法作圖計算角蛋白酶動力學(xué)參數(shù)，與野生型角蛋白酶相比，角蛋白酶突變體A307V/S346T、R70G、N245K對底物的親和力與催化效率均有所提升(表4)。

2.5 野生型和突變型角蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建及分析

角蛋白酶突變體A307V/S346T、N245K的突變位點位于成熟肽區(qū)域，直接以成熟肽氨基酸序列建模，以地衣芽孢桿菌的枯草菌溶素(PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫ID:3unxA)為模板得到野生型角蛋白酶和角蛋白酶突變體A307V/S346T、N245K晶體的三維結(jié)構(gòu)模型圖(圖5)。角蛋白酶突變體R70G的突變位點位于前導(dǎo)肽區(qū)域，用前導(dǎo)肽與成熟肽氨基酸序列建模，以枯草蛋白酶E(PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 ID:3whi.1.A)為模板進行同源建模得到野生型角蛋白酶和角蛋白酶突變型R70G前導(dǎo)肽的三維結(jié)構(gòu)模型圖(圖6)。角蛋白酶突變體A307V/S346T、N245K、R70G突變位點分析如圖7所示。據(jù)結(jié)構(gòu)模型顯示，3種突變型角蛋白酶突變前后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)均無明顯變化。

表3 野生型與突變型角蛋白酶5 min熱處理后殘留酶活性

表4 野生型與突變型角蛋白酶動力學(xué)參數(shù)

3 討 論

本試驗利用易錯PCR方法，對角蛋白酶進行定向進化，獲得了3株耐溫性較好的角蛋白酶突變體A307V/S346T，R70G、N245K，反映出易錯PCR在酶分子改造方面具有較好的便捷性。初篩所選轉(zhuǎn)化子水解圈均不小于野生型，但角蛋白酶突變體A307V/S346T、R70G的粗酶液角蛋白酶活性為野生型角蛋白酶的89%左右，僅角蛋白酶突變體N245K的發(fā)酵液酶活性相對野生型角蛋白酶提升了19.43%，這說明水解圈與發(fā)酵酶活性水平間存在不一致性，復(fù)篩十分必要。

圖5 野生型角蛋白酶(a)和角蛋白酶突變體A307V/S346T(b)、N245K(c)晶體的三維結(jié)構(gòu)模擬示意圖

圖6 野生型角蛋白酶(a)和角蛋白酶突變體R70G(b)前導(dǎo)肽的三級結(jié)構(gòu)模擬示意圖

Val：纈氨酸 valine；Thr：蘇氨酸 threonine；Lys：賴氨酸 lysine；Glu：谷氨酸 glutamate；Gly：甘氨酸 glycine。

野生型角蛋白酶與3個突變型角蛋白酶在pH 8～12的緩沖體系中酶活性變化趨勢平穩(wěn)。角蛋白酶突變體R70G、N245K的適宜pH后移至11，在pH 12表現(xiàn)出比野生型更高的相對活性，在堿性pH寬泛性增加，利于在堿性條件下快速處理羽毛角蛋白，在洗滌與紡織業(yè)也有較好利用前景。但在畜禽小腸pH(6.0～7.0)條件下，野生型和突變型角蛋白酶活性均大幅降低，影響其作用發(fā)揮，后續(xù)研究需進一步通過定向進化、C端截短、結(jié)構(gòu)域重組等分子改造手段提高其pH穩(wěn)定性[21-22]。

根據(jù)純化酶蛋白熱處理后酶活性殘留情況可見，部分突變型角蛋白酶出現(xiàn)75 ℃組活性高于65 ℃組的現(xiàn)象，這可能與在特定條件下出現(xiàn)蛋白酶自溶現(xiàn)象有關(guān)[25-26]。與此同時還發(fā)現(xiàn)，純酶熱穩(wěn)定性明顯低于粗酶液，可能是粗酶液中細菌代謝產(chǎn)生的蛋白與角蛋白酶結(jié)合暫時形成酶-底物復(fù)合物[27]，構(gòu)象相對穩(wěn)定。以上現(xiàn)象產(chǎn)生的原因與機制尚需進一步深入研究。

本研究共獲得4個角蛋白酶突變位點。角蛋白酶突變體A307V/S346T的307位的丙氨酸(Ala)位于2個β折疊之間的loop區(qū)域，Ala的構(gòu)象不穩(wěn)定，被替換為纈氨酸(Val)后，構(gòu)象的穩(wěn)定性和氨基酸的疏水性均有所增強。疏水作用是蛋白質(zhì)折疊主要驅(qū)動力[28-29]，有利于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Val疏水性增強有助于反應(yīng)區(qū)疏水環(huán)境的形成，降低結(jié)合狀態(tài)的自由能，有利于底物與酶的結(jié)合，促進催化反應(yīng)進行，這可能是角蛋白酶突變體A307V/S346T在適宜反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性提升的同時，還保留了較高活性的主要原因。而346位氨基酸絲氨酸(Ser)與蘇氨酸(Thr)的結(jié)構(gòu)功能均較為接近，可能不是影響酶學(xué)性質(zhì)改變的主要突變因素。角蛋白酶突變體N245K的245位氨基酸天冬酰胺(Asn)位于α螺旋，Asn在高溫下易發(fā)生脫酰胺作用，不利于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，嗜熱蛋白中一般含有較少的Asn和谷氨酰胺[30-32]。同時，已有研究揭示增加蛋白質(zhì)表面負電荷氨基酸可提高酶穩(wěn)定性[33]，Asn被替換為賴氨酸(Lys)后可能更有利于α螺旋的穩(wěn)定。Lys在蛋白表面引入負電荷可能通過靜電作用力，形成離子鍵，穩(wěn)定了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。角蛋白酶突變體R70G的70位氨基酸位于酶前導(dǎo)肽2個β折疊間的loop上，由精氨酸(Arg)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)最為簡單的甘氨酸(Gly)，側(cè)鏈僅有1個氫原子，空間位阻小?？臻g位阻的改變可能對前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)起優(yōu)化作用，并進一步影響成熟肽空間結(jié)構(gòu)，從而提升了突變體的熱穩(wěn)定性。已有研究探明前導(dǎo)肽與脂肪酶的熱穩(wěn)定性相關(guān)[34]，但在角蛋白酶的研究中多將前導(dǎo)肽與酶活性進行關(guān)聯(lián)分析，前導(dǎo)肽與蛋白酶穩(wěn)定性間的關(guān)系尚無相關(guān)報道，該研究結(jié)果或許可為今后耐熱蛋白酶理性設(shè)計提供新的思路。

4 結(jié) 論

本試驗通過易錯PCR成功對地衣芽胞桿菌CP-16來源的角蛋白酶進行了定向進化，篩選到熱穩(wěn)定性提升的角蛋白酶突變體，拓展了角蛋白酶的適用性，并分析了其熱穩(wěn)性提高的分子基礎(chǔ)，為耐熱蛋白酶理性設(shè)計提供新思路。