王 彤，高元鵬，韓 靜，張景程，李喜和，何婷依，曹貴方*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市 010018；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)，陜西楊凌 712021；3.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市 010021)

轉(zhuǎn)基因動物是指利用基因工程將外源基因整合到動物基因組或是對內(nèi)源基因進(jìn)行人為定向改造，修飾后的遺傳物質(zhì)可以穩(wěn)定遺傳給后代的動物。世界公認(rèn)的第一例真正意義上的轉(zhuǎn)基因動物是在1982年，Palmiter研究員利用原核顯微注射的方式將人生長激素基因?qū)氲叫∈笤伺咛ブ兴鶚?gòu)建[1]。1985年，Hammer研究員同樣利用原核顯微注射法成功獲得了轉(zhuǎn)基因家畜[2]。盡管使用原核顯微注射技術(shù)來制備轉(zhuǎn)基家畜效率較低，但是由于操作直觀、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)一直被視為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的常規(guī)操作。

1996年，Campbell研究人員利用體細(xì)胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer,SCNT)成功獲得了克隆羊[3]。1997年，Wilmut研究員利用SCNT等操作成功獲得體細(xì)胞克隆羊“多莉”，這使得在體細(xì)胞上進(jìn)行基因編輯，再結(jié)合SCNT來獲得轉(zhuǎn)基因動物成為可能。由于在自然條件下體細(xì)胞同源重組效率極低，再加上SCNT效率也較低[4]，利用SCNT建立的動物經(jīng)常會發(fā)生猝死或引發(fā)與健康相關(guān)的并發(fā)癥，所以只有有限數(shù)量轉(zhuǎn)基因家畜被報道。

人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease,EEN)的出現(xiàn)不但顯著提高了轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)效率，而且使得精準(zhǔn)打靶成為可能。EEN主要是由鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成。其中CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)相對于其他兩種系統(tǒng)來說結(jié)構(gòu)簡單、效率高、應(yīng)用范圍廣和成本低，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的建立上。

2006年利用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的ATryn獲得上市許可，這是世界首例獲得上市許可的利用轉(zhuǎn)基因山羊乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物。2015年FDA批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因三文魚上市，2017年轉(zhuǎn)基因三文魚登上加拿大的餐桌，這是全球首次批準(zhǔn)可食用的轉(zhuǎn)基因動物。2020年12月14日FDA批準(zhǔn)了敲除豬細(xì)胞表面α-半乳糖(Alpha-gal)蛋白酶的轉(zhuǎn)基因豬-GalSafe上市，這是首次獲得批準(zhǔn)的既可以用于人類食用也可用于人類醫(yī)療的轉(zhuǎn)基因家畜，這也是科學(xué)創(chuàng)新偉大的里程碑。由此可見，未來會有越來越多的轉(zhuǎn)基因動物制品以及轉(zhuǎn)基因動物被允許上市，這也極大的鼓舞了科研人員對轉(zhuǎn)基因動物研究的信心和熱情。

本文主要綜述CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜生產(chǎn)中取得的研究成果，并對其存在問題與未來發(fā)展進(jìn)行討論。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)概述

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌抵抗病毒與噬菌體入侵的一種不斷進(jìn)化的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制[5]，該系統(tǒng)可以識別外源基因并對其進(jìn)行切割，從而抵御其侵染。2011年Makrova等將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種類型，分別為TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ。其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅由1個Cas9核酸內(nèi)切酶就可以對DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，組成成分相對簡單，是目前研究最徹底的一種[6]。

CRISPR/Cas9獲得性免疫保護(hù)機(jī)制主要有3個階段，分別是CRISPR間隔序列的獲得、CRISPR基因的表達(dá)和CRISPR干擾[7]。當(dāng)外源基因入侵細(xì)菌時，CRISPR/Cas9通過前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)將候選的原間隔序列剪切插入到CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)的下游并修復(fù)。當(dāng)外源基因再次入侵時，CRISPR基因的表達(dá)水平迅速上升，轉(zhuǎn)錄生成前體CRISPR RNA(pre CRISPR derived RNA,pre-crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans acting CRISPR RNA,tracrRNA)，前者會被Cas蛋白剪切為成熟的crRNA(CRISPR-derived RNA)。最后，tracrRNA與crRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則形成一條雙鏈的RNA并與Cas9蛋白形成具有DNA內(nèi)切酶活性的核糖核蛋白復(fù)合物crRNP。crRNP與外源的靶序列互補(bǔ)配對，并將Cas9蛋白引導(dǎo)至在PAM附近并對其DNA雙鏈進(jìn)行切割，從而降解外源DNA保護(hù)宿主細(xì)胞免受病毒與噬菌體的侵染。

2012年，Jinek將CRISPR/Cas9系統(tǒng)的tracrRNA以及crRNA人工融合為一條向?qū)NA(guide RNA,gRNA)，從而將CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步簡化為只由一條單鏈向?qū)NA和一個Cas9核酸酶組成的系統(tǒng)[8]。針對DNA雙鏈斷裂(double strand break,DSB)，細(xì)胞主要通過非同源末端連接(non homologous end joining,NHEJ)和同源重組(homologous directed recombination,HDR)的修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)。其中細(xì)胞主要是通過NHEJ修復(fù)途徑來對DNA進(jìn)行修復(fù)，但是會引入微小堿基的隨機(jī)插入或缺失(small insert or delete,Indels)，這將導(dǎo)致基因組重要結(jié)構(gòu)被破壞，或是因為移碼突變從而過早形成終止密碼子導(dǎo)致基因敲除(knock-out,KO)。HDR修復(fù)機(jī)制是在有修復(fù)模板存在的情況下對DNA進(jìn)行精準(zhǔn)修復(fù)，利用其原理可以實現(xiàn)基因組定點(diǎn)插入(knock-in,KI)，或是單堿基的替換。

2013年，張鋒和Church等分別實現(xiàn)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在哺乳動物的最早期應(yīng)用。2015年麻省理工學(xué)院腦研究所聯(lián)合哈佛醫(yī)學(xué)院對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行改造，大大降低了該系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)[9]，從而提高了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的安全性。法國生物化學(xué)家Emmanuelle Charpentier和美國生物學(xué)家Jennifer Doudna更是因為對CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)做出的突出貢獻(xiàn)，在2020年10月7日獲諾貝爾化學(xué)獎，表明了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在科學(xué)領(lǐng)域不可替代的革命性意義。

2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在豬的研究應(yīng)用

2.1 在抗病轉(zhuǎn)基因上的研究應(yīng)用

豬是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動物，豬肉是人類動物蛋白的主要來源之一。隨著全球人口數(shù)量的不斷增加，豬肉需求量在逐日增長，全球養(yǎng)豬的規(guī)模在不斷擴(kuò)大，但是由于密集化飼養(yǎng)導(dǎo)致豬的新發(fā)和再發(fā)疫病也相繼出現(xiàn)，從而給養(yǎng)豬行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，針對抗病轉(zhuǎn)基因豬品種的培育已經(jīng)刻不容緩。目前研究人員主要是通過編輯宿主的受體，或是通過將抑制病毒增殖的基因插入到宿主的基因組的方法來抑制病毒。由于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制備簡單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，在豬的抗病育種中具有極大的潛力。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱為豬藍(lán)耳病，是由于感染了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)所導(dǎo)致。PRRS會導(dǎo)致懷孕母豬早產(chǎn)或流產(chǎn)；新生仔豬虛弱、初生重較低、發(fā)燒咳嗽、生長性能下降；公豬厭食、嗜睡和精子質(zhì)量下降等癥狀。PRRS每年都會給養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。2006年，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(high-pathogenic-porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)成為我國豬的主要流行病，HP-PRRSV起源于Ⅱ型的PRRSV，比傳統(tǒng)的PRRSV具有更高的發(fā)病率與死亡率。研究發(fā)現(xiàn)CD163是PRRSV進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體基因，CD163全蛋白或是與病毒互作的SRCR5區(qū)的基因缺失可使基因敲除豬以及相應(yīng)的宿主細(xì)胞對Ⅰ型和Ⅱ型的PRRSV分離株產(chǎn)生抵抗力。2018年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳珍芳研究團(tuán)隊使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT相結(jié)合，獲得了CD163基因敲除的杜洛克豬[10]。試驗進(jìn)一步證明了敲除CD163基因的杜洛克豬可對HP-PRRSV感染具有完全的抵抗力，CD163的缺失并不影響巨噬細(xì)胞向單核細(xì)胞的分化和巨噬細(xì)胞對Hp-Hb的攝取。CD163基因敲除豬的構(gòu)建為抵抗PRRSV提供了寶貴的實驗動物。這是通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在動物水平上進(jìn)行基因組編輯來抵御病毒的感染，為以后研究病毒與宿主的關(guān)系提供了寶貴材料與思路。

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種在家豬與野豬病死率高達(dá)100%的病毒性疾病，目前還沒有有效的疫苗和治療方法來抑制非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的感染。2018年，研究人員將靶向ASFV磷蛋白p30的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)導(dǎo)入到病毒體內(nèi)。由于靶向切割A(yù)SFV-p30基因組，所以導(dǎo)致由ASFV引起的空斑完全消失，并且病毒產(chǎn)量降低了4個數(shù)量級[11]。由此可見，利用CRISPR/Cas9靶向ASFV-p30是抵抗ASFV的一種有效的策略。核糖核酸酶L(RNase L)是受Ⅰ型干擾素調(diào)控的一種重要的抗病毒內(nèi)切核酸酶，但是豬的核糖核酸酶L(sRNase L)的作用機(jī)制尚不明確。2019年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除豬PK-15細(xì)胞系的sRNase L[12]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，sRNase L具有多種生物學(xué)功能，包括降解細(xì)胞單鏈RNA、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、下調(diào)干擾素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的轉(zhuǎn)錄水平以及具有抵抗豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的活性，這一發(fā)現(xiàn)為生產(chǎn)PRV弱毒疫苗提供了寶貴的思路。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)直接對宿主細(xì)胞進(jìn)行編輯，可用來研究病毒與宿主細(xì)胞之間的聯(lián)系、病毒致病機(jī)理以及新型疫苗的構(gòu)建。

2.2 在異種器官移植和疾病模型上的研究應(yīng)用

家豬在生理學(xué)與解剖學(xué)方面與人類的器官有相似的特征。在人類器官短缺的情況下，家豬可以作為優(yōu)良的供體動物為人類提供器官。但是豬與靈長類進(jìn)行異種器官移植后會引起超急性免疫排斥反應(yīng)、急性血管排斥反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)，并且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV)也阻礙著異種器官移植的發(fā)展。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的簡便高效性縮短了對家豬多基因人源化改造和對PERV編輯的時間，從而加速了豬與靈長類異種器官移植的發(fā)展與應(yīng)用。

豬血管內(nèi)皮上的α-Gal是由α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α1.3-galactosyltransferase，GGTA1)催化合成的細(xì)胞表面抗原。該抗原能被靈長類動物體內(nèi)的抗體識別，從而引起超急性免疫排斥反應(yīng)。2016年，研究人員使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT獲得了GGTA1雙等位基因敲除豬，GGTA1的敲除降低了豬到靈長類所引起的超急性免疫排斥反應(yīng)。然而研究發(fā)現(xiàn)，將敲除GGTA1轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行器官移植后，仍有抗體沉積、補(bǔ)體激活和血栓的形成。Byrne發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)的β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)可催化合成SD(a)抗原，當(dāng)移植到靈長類就引起免疫排斥。因此，將巴馬豬的GGTA1和β4GalNT2基因敲除可以極大的降低其器官與組織的免疫原性。2019年，戴一凡研究團(tuán)隊利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制備了GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除的巴馬豬成纖維細(xì)胞系[13]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可快速構(gòu)建雙基因敲除的細(xì)胞系，并為大量獲得GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除的巴馬豬打下基礎(chǔ)。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可最大限度地降低對異種移植的抗體屏障，這些特異性抗原敲除豬的建立將掃除豬到靈長類異種器官移植的安全障礙，推動豬器官到臨床的應(yīng)用。

楊璐菡科研團(tuán)隊在豬異種器官移植上做出了突出貢獻(xiàn)。2015年，楊璐菡首次鑒定出豬細(xì)胞內(nèi)存在PERV完整譜系和在染色體上的拷貝數(shù)，并且證明了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以實現(xiàn)豬PK-15細(xì)胞系PERV的62個拷貝數(shù)的敲除，從而使人感染PERV風(fēng)險下降至以前的1/1 000[14]。2017年，獲得了100%敲除PREV的轉(zhuǎn)基因豬1.0并取名為“萊卡”。2020年，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)座子技術(shù)成功獲得了敲除3種異種抗原同時插入9種人類基因的轉(zhuǎn)基因豬3.0。轉(zhuǎn)基因豬3.0已基本解決了免疫排斥問題，這是迄今為止最適合給人類捐獻(xiàn)器官的轉(zhuǎn)基因豬。

豬作為人類疾病模型動物是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)，到目前為止利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了許多人類疾病模型豬。2015年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功獲得了敲除3個等位基因IGM突變的仔豬[15]，成功獲得了免疫缺陷疾病模型豬。2016年，獲得了敲除腫瘤抑制基因RUNX3的人類胃癌模型豬[16]。2017年，敲除巴馬小型豬的載脂蛋白E基因和低密度脂蛋白受體基因，可以作為人類心血管疾病模型豬[17]，同年獲得了敲除INS基因的糖尿病模型豬[18]。2018年，獲得了亨廷頓模型豬，這為神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制和治療研究提供了寶貴的模型動物。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以高效構(gòu)建人類疾病模型動物，可更好地對人類疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)行研究，從而為研制新抗病藥物和治療方案提供寶貴的動物材料。

2.3 生產(chǎn)性能的研究應(yīng)用

2015年，吉林大學(xué)研究人員[19]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與有限稀釋的方法獲得了無篩選標(biāo)記的敲除肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)的轉(zhuǎn)基因豬，并在組織學(xué)上顯示新生MSTN敲除仔豬的背最長肌存在較多的肌纖維核，表明MSTN基因在豬胚胎發(fā)育的過程中對肌纖維數(shù)量有一定的調(diào)節(jié)作用。2018年，研究人員[20]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對巴馬豬胰島素樣生長因子2(Insulin like growth factor 2,IGF2)的內(nèi)含子3-3072位點(diǎn)進(jìn)行編輯，結(jié)果表明，編輯非編碼區(qū)也可以提高巴馬豬的產(chǎn)肉量。這首次證明了編輯非編碼區(qū)可以改善家畜的經(jīng)濟(jì)性狀。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可高效地培育具有更高經(jīng)濟(jì)價值的轉(zhuǎn)基因豬。

3 CRSIPR/Cas9基因編輯技術(shù)在牛的研究應(yīng)用

3.1 在抗病轉(zhuǎn)基因育種上的研究應(yīng)用

?？共∮N一直是轉(zhuǎn)基因動物研究的熱點(diǎn)。牛的結(jié)核病是由于牛分支桿菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)感染造成的一種人畜共患病。2017年，張涌院士團(tuán)隊[21]首次利用Cas9的突變體單切口酶(Cas9 nickase,Cas9n)，在牛的成纖維細(xì)胞精準(zhǔn)插入外源NRAMP1基因，并成功獲得了11頭轉(zhuǎn)基因牛。精準(zhǔn)插入外源基因NRAMP1可以提高牛對結(jié)核病的抵抗能力，同時也證明Cas9n可以降低脫靶效率，提高轉(zhuǎn)基因動物的生物安全性。牛副結(jié)核病是由于牛感染副結(jié)核分支桿菌(paratuberculosis,MAP)所引的，每年都會對奶制品造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)白介素10受體α(interleukin-10 receptoralpha,IL-10RA)對MAP具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。2020年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了一株敲除IL10RA基因的牛乳腺上皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，敲除IL-10RA的牛乳腺上皮細(xì)胞可以降低促炎細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子3(suppressor of cytokine signaling3,SOCS3)的表達(dá)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子TNFA、IL-1A、IL-1B和IL-6基因的表達(dá)。敲除牛乳腺上皮細(xì)胞IL-10RA的獲得有助于深入了解IL-10RA抗炎癥的相關(guān)機(jī)制和MAP裂解產(chǎn)物作用機(jī)理，可作為評估不同抗炎藥物抗炎效果的細(xì)胞模型。2020年，研究人員通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了敲除CD46基因的細(xì)胞系[22]。證明不同的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染性強(qiáng)烈依賴于CD46，而在敲除CD46的情況下，仍然有一部分病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞中。敲除CD46的細(xì)胞系獲得，可用于闡明CD46受體在瘟疫病毒生物學(xué)和生長周期中的作用機(jī)制。

3.2 在早期胚胎動物模型上的研究應(yīng)用

早期基因工程編輯效率低，再加上牛的生殖周期長，導(dǎo)致牛胚胎發(fā)育過程中很大程度上是未知的。OCT4對哺乳動物早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞譜系分化和生殖細(xì)胞多能性的維持起著十分重要的作用，但是OCT4在牛囊胚形成和細(xì)胞譜系特性尚不明確。2017年，研究人員[23]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT獲得了敲除OCT4的牛胚胎。研究發(fā)現(xiàn)，敲除牛OCT4的囊胚與敲除小鼠OCT4的囊胚的發(fā)育存在很大區(qū)別，但是與人類缺陷OCT4的囊胚發(fā)育相似。2018年，Bradford等[24]直接在牛的受精卵注射靶向OCT4基因的sgRNA與Cas9蛋白所組成的核糖核蛋白復(fù)合物，導(dǎo)致牛胚胎在第5天發(fā)育停滯，從而導(dǎo)致囊胚難以形成。敲除OCT4的牛胚胎可以為人類早期胚胎發(fā)育缺陷提供模型動物，也為牛的胚胎發(fā)育提供了寶貴的材料。轉(zhuǎn)基因動物的獲得主要是通過兩種方式，一種是通過基因工程技術(shù)對體細(xì)胞進(jìn)行編輯，然后通過SCNT獲得轉(zhuǎn)基因動物；另一種是將sgRNA-Cas9復(fù)合物顯微注射到受精卵中，再通過胚胎移植的方式來獲得轉(zhuǎn)基因動物。但是，由于SCNT在培育健康克隆動物上效率比較低，再加上對操作人員的技術(shù)要求以及對儀器器材要求較高，并且通過SCNT構(gòu)建的胚胎容易形成嵌合體動物。以上這些缺點(diǎn)都在制約著轉(zhuǎn)基因動物的研究發(fā)展。2018年，研究人員[25]將靶向OCT4的sgRNA-Cas9所組成的核糖體復(fù)合物通過優(yōu)化的電穿孔的方式轉(zhuǎn)染到牛的受精卵中。研究表明，OCT4的編輯效率高達(dá)92%，大多數(shù)胚胎(11/13)呈現(xiàn)雙等位基因編輯并且只有一個(1/13)胚胎發(fā)生了遺傳嵌合體。利用電穿孔技術(shù)將CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入到受精卵中，這種方法極大的降低操作難度，使轉(zhuǎn)基因動物更加容易獲得。

4 CRSIPR/Cas9技術(shù)在羊的研究應(yīng)用

4.1 生產(chǎn)性能上的研究應(yīng)用

羊是我國重要的家畜之一，為人類提供優(yōu)質(zhì)的肉制品、奶制品和毛制品。轉(zhuǎn)基因羊具有生產(chǎn)更加優(yōu)質(zhì)的肉制品、奶制品和毛制品，也可以生產(chǎn)有經(jīng)濟(jì)價值的治療性蛋白的潛力。2014年，首次證明了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可在山羊中應(yīng)用，在3 d時間內(nèi)可對所有內(nèi)源性基因進(jìn)行編輯，經(jīng)過多重編輯的山羊可以在5個月內(nèi)獲得。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT相結(jié)合可快速獲得轉(zhuǎn)基因羊。

山羊奶具有高比例的脂肪和蛋白質(zhì)含量并且在成分上也更加接近人乳，山羊奶已經(jīng)成為牛奶的重要補(bǔ)充乳品。但是在山羊奶里的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是人類尤其是嬰兒的主要過敏原，經(jīng)過加熱處理或發(fā)酵的方式都不能消除。2017年[26]，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了敲除BLG的轉(zhuǎn)基因山羊。敲除BLG的轉(zhuǎn)基因山羊奶中BLG蛋白濃度有所降低，為改良山羊奶的成分提供了新思路。2017年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了敲除BLG基因的同時，在BLG位點(diǎn)插入了人乳鐵蛋白，從而消除了人對于山羊奶的過敏反應(yīng)，并提高了山羊奶的營養(yǎng)價值[27]。

2014年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別在綿羊與山羊上獲得了敲除MSTN雙等位基因的轉(zhuǎn)基因羊。2018年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了敲除MSTN基因并在MSTN位點(diǎn)插入FAT-1基因的轉(zhuǎn)基因山羊[28]。FAT-1表達(dá)上調(diào)可以增加ω-3多不飽和脂肪酸的含量從而降低n-6/n-3的比例，降低患神經(jīng)疾病和癌癥的風(fēng)險[29]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)加速了對綿羊與山羊在產(chǎn)肉性能上的改良。

隨著生活水平的提升，人類對高品質(zhì)羊絨的需求量也越來越高。成纖維生長因子(fibroblast growth factor 5,FGF5)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor， VEGF)是調(diào)控毛發(fā)生長的關(guān)鍵基因。2016年，陳玉林研究團(tuán)隊利用顯微注射將靶向MSTN與FGF5的sgRNAs與Cas9-mRNA同時注射到山羊的胚胎中。試驗證明，敲除FGF5基因可以增加毛囊數(shù)量和纖維長度，從而生產(chǎn)更多的羊絨。2020年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)獲得5只敲除FGF5的杜泊羊[30]。敲除FGF5的轉(zhuǎn)基因綿羊FGF5基因表達(dá)水平顯著降低，且所有FGF5蛋白功能紊亂，在表型上毛囊密度與細(xì)毛度顯著增加。這是首次建立FGF5、FGFR1、androgen、AR、Wnt/β-catenin、Shh/Gli2、c-myc和krts在內(nèi)的下游信號通路。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步改善FGF5的功能、治療雄激素性脫發(fā)提供了思路，也為培育產(chǎn)絨量高、絨纖維品質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因絨山羊提供了寶貴的實驗動物。

4.2 在其他方面的研究應(yīng)用

褪黑素是一種重要的抗氧化劑，具有重要的營養(yǎng)和藥用價值。2017年，研究人員[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)生產(chǎn)出富含褪黑素乳腺生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因羊。這是第1例表達(dá)AANAT和ASMT基因的模型動物，為大型轉(zhuǎn)基因家畜的制作奠定了基礎(chǔ)。2018年，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與SCNT相結(jié)合敲除了綿羊的囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(transmembrane conductance regulator,CFTR)，敲除CFTR基因的綿羊出現(xiàn)了與人類囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)一致的臨床癥狀。綿羊囊性纖維化動物模型的建立將成為研究人類CF有價值的疾病模型動物[32]。

5 討論與展望

盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜的應(yīng)用中已經(jīng)取得令人矚目的成果，但是由于釀膿鏈球菌Cas9(StreptococcuspyogenesCas,SpCas9)的高脫靶率、嚴(yán)格的PAM要求、高細(xì)胞毒性[33-36]的缺點(diǎn)，以及細(xì)胞發(fā)生HDR修復(fù)途徑效率低[37]的因素，都限制其使用范圍。

2018年，Charpentier等研究人員將Cas9與CtIP融合，可顯著提高轉(zhuǎn)基因的靶向整合效率。2020年，朱健康院士發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過磷酸化修飾和硫代修飾后的供體可極大地提高CRISPR/Cas9在水稻中介導(dǎo)的靶向插入效率，并且在此基礎(chǔ)上，他們還發(fā)現(xiàn)在基因組上串聯(lián)重復(fù)片段可以提高點(diǎn)突變效率。這些成果為提高CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜的靶向修復(fù)效率提供了可靠的試驗依據(jù)與思路。

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對家畜基因組進(jìn)行編輯時，會有一定的概率對非靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯。為了降低脫靶效應(yīng)，有科研團(tuán)隊發(fā)明了單堿基編輯器系統(tǒng)，該系統(tǒng)在不產(chǎn)生DSB的情況下就可以發(fā)生單堿基替換，從而降低脫靶效應(yīng)。此外，還有一種新CRISPR變異體，通過催化受損的Cas9蛋白核酸酶和逆轉(zhuǎn)錄酶融合而成，稱之為prime editor。在不需要DSB或供體DNA模板的情況下，進(jìn)行精確的靶向插入、缺失和點(diǎn)突變。這種方法可以有效地降低脫靶效應(yīng)帶來的副產(chǎn)品，減少對動物體的危害。

嗜熱鏈球菌Cas9(StreptococcusthermophilusCas9,St1Cas9)是釀膿鏈球菌SpCas9的一個相對較小的同源物，它能夠?qū)Σ煌N生物體內(nèi)的基因組進(jìn)行編輯，與SpCas9相比，它具有更低的細(xì)胞毒性、更高的特異性和更長的PAM要求。2020年季泉江研究團(tuán)隊與甘建華研究團(tuán)隊解析St1Cas9-sgRNA-DNA的三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，并揭示了HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域切割DNA的分子機(jī)制，同時也揭示了St1Cas9運(yùn)用氫鍵和范德華力來識別較為復(fù)雜的NNAGAA的PAM序列。研究人員依據(jù)其分子機(jī)制進(jìn)行定向進(jìn)化，成功地將St1Cas9的PAM識別范圍從野生型的NNAGAA拓展為NNRNAA，從而擴(kuò)大了St1Cas9的基因編輯范圍，使得St1Cas9在基因編輯系統(tǒng)具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在轉(zhuǎn)基因家畜中已經(jīng)取得了重大研究成果，隨著技術(shù)的不斷完善，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)一定會在農(nóng)業(yè)與人類醫(yī)學(xué)中取得更多令人矚目的成果。