張曉 秦偉偉 李秋杰 孫立新 馬福國 韓偉

1青島市市立醫(yī)院麻醉科266071;2青島市市立醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科266071

急性肺損傷 (acute lung injury,ALI)患者通常需要機(jī)械通氣以維持氧合,然而機(jī)械通氣使用不當(dāng)可能加重先前存在的肺損傷,稱為機(jī)械通氣肺損傷 (ventilator-induced lung injury,VILI)[1]。近幾年的研究多集中于由炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞參與的生物傷,而瘦素是脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪因子,與IL-6 和IL-12 有相似的結(jié)構(gòu),被認(rèn)為是一種炎癥因子,參與Ⅰ型免疫反應(yīng)[2],外源瘦素可能在膿毒癥導(dǎo)致的ALI中起肺保護(hù)作用[3],而瘦素改善ALI的機(jī)制尚不清楚。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體是固有免疫系統(tǒng)重要組成部分,能夠在機(jī)械刺激的作用下形成炎癥小體。NLRC4是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族成員之一,能夠感知損傷相關(guān)分子模式,導(dǎo)致炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18 的分泌[4]。但瘦素是否能夠通過影響NLRC4炎癥小體的表達(dá)減輕VILI的發(fā)生,未見相關(guān)研究。本研究通過使用瘦素干預(yù)VILI模型大鼠,試圖闡明瘦素對(duì)VILI大鼠NLRC4炎癥小體表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD 大鼠36只,體質(zhì)量200～250 g (購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK (魯)2014-0007。恒溫環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食,所有動(dòng)物按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南進(jìn)行飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)核實(shí)批準(zhǔn)。

1.2 主要材料和試劑 外源性瘦素 (美國Santa Cruz公司),酶聯(lián)免疫試劑盒 (上海碧云天生物技術(shù)研究所),小動(dòng)物呼吸機(jī) (深圳沃瑞德生命科技有限公司),血?dú)夥治鰞x(美國雅培公司),Imager圖像分析儀 (美國Bio-Rad公司),離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠),移液槍 (法國Eppendorf公司),NLRC4抗體(美國Abcam 公司),caspase-1抗體(美國Abcam 公司),內(nèi)參照β-actin (北京Bioeasy公司)等。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組:對(duì)照組、VILI模型組和瘦素組,每組12只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,自由飲水,腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg,麻醉后行氣管切開,插入氣管導(dǎo)管并固定。對(duì)照組不行機(jī)械通氣,自主呼吸空氣4 h；VILI模型組和瘦素組連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣4 h；機(jī)械通氣前瘦素組腹腔注射瘦素50μg/kg,對(duì)照組和VILI模型組腹腔內(nèi)分別注射等量生理鹽水。3組均股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓和采血,股靜脈插管建立液體通道,維持室溫26～28℃,麻醉維持采用靜脈輸注戊巴比妥鈉2 mg·kg-1·h-1。呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置:潮氣量為40 ml/kg,呼吸頻率為60 次/min,吸呼比為1∶1,呼氣末正壓為0 mm Hg (1 mm Hg=0.133 k Pa),吸入氧濃度為21%。

1.3.2 標(biāo)本采集 機(jī)械通氣4 h后采集股動(dòng)脈血樣,進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?記錄PaO2,剩余血樣以1 500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min (離心半徑15 cm)。收集血清,凍存于-80 ℃冰箱,用于血清中炎性因子IL-1β、IL-18含量測(cè)定。采集血液標(biāo)本后麻醉處死大鼠,于4℃下分離兩側(cè)肺組織,結(jié)扎右主支氣管,左支氣管穿刺插管后用4 ℃PBS行左側(cè)肺灌洗,每次2 ml(回收率＞80%),反復(fù)3 次, 收 集 約 4 ml 支 氣 管 肺 泡 灌 洗 液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),4 ℃下3 000 r/min離心10 min (離心半徑15 cm)后取上清液。ELISA 法檢測(cè)血清及BALF 中IL-1β、IL-18的濃度。取右肺上葉甲醛固定,右肺中葉計(jì)算濕/干重比值,右肺下葉組織投入液氮快速冷凍后-80 ℃貯存。

1.3.3 組織病理檢測(cè) 取右肺上葉組織,經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE 染色,光鏡下觀察肺組織病理學(xué)結(jié)果,并行病理損傷評(píng)分。觀察肺間質(zhì)、肺泡、中性粒細(xì)胞和肺泡內(nèi)充血4項(xiàng)指標(biāo)并進(jìn)行評(píng)分,無改變或非常輕微改變?yōu)?分；輕度、中度、重度、極重度改變依次為1、2、3、4分,4項(xiàng)累計(jì)總分即為肺損傷評(píng)分。

1.3.4 肺濕/干重比值測(cè)定 取右肺中葉稱取濕重,置于70 ℃干燥箱中烘干至恒重,稱取干重,計(jì)算比值。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺組織中caspase-1、NLRC4蛋白表達(dá)水平 于冰盒上迅速取出肺組織研磨后加入蛋白裂解液,低溫高速離心,取上清后采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果,加入相應(yīng)體積的總蛋白上樣,SDS-PAGE 電泳。將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上,然后分別用非標(biāo)記一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。分離后的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜后加入一抗兔多克隆抗體NLRC4 抗體 (稀釋度1∶1 000,美國Abcam公司)、caspase-1 抗體 (稀釋度1∶1 000,美國Abcam 公司),內(nèi)參照β-actin (稀釋度1∶5 000,北京Bioeasy公司),4℃過夜,TBST洗膜5 min×3次,加入羊抗兔二抗 (1∶5 000,深圳Bioeasy公司),孵育30 min后,用TBST 洗膜5 min×3次?；瘜W(xué)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像后用Image J軟件分析灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值代表目的蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)結(jié)果 通氣4 h后,對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常,無明顯炎性細(xì)胞浸潤,無紅細(xì)胞或蛋白滲出；VILI模型組機(jī)械通氣后肺組織明顯充血、水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤；瘦素組充血、水腫程度減輕。見圖1。

2.2 肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比值和PaO2變化 3 組之間比較,肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比值、PaO2差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F值分別為30.77、31.68、71.80,P值均＜0.01)。VILI模型組、瘦素組肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比值明顯高于對(duì)照組,PaO2顯著低于對(duì)照組 (P值均＜0.01)。瘦素組肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比值低于VILI模型組,PaO2高于VILI模型組(P值均＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比值和PaO2 的比較 (±s)

表1 各組大鼠肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比值和PaO2 的比較 (±s)

注:VILI為機(jī)械通氣肺損傷；與對(duì)照組比較,a P ＜0.01；與VILI模型組比較,b P ＜0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

組別 鼠數(shù) 肺損傷評(píng)分(分)肺濕/干重比值PaO2(mm Hg)對(duì)照組 12 3.2±1.8 2.9±1.1 84±6 VILI模型組 12 11.1±2.3a 8.8±2.2a 54±7a瘦素組 12 8.3±3.2ab 6.5±2.0ab 62±6ab F 值 30.77 31.68 71.80 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 血清和BALF 中IL-18、IL-1β濃度 3組之間比較,血清中IL-18和IL-1β、BALF中IL-18和IL-1β差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F值分別為63.40、87.37、98.10、381.20,P值均＜0.01)。VILI模型組、瘦素組血清中IL-18 和IL-1β、BALF 中IL-18和IL-1β 濃度顯著高于對(duì)照組 (P值均＜0.01)；瘦素組血清中IL-18 和IL-1β、BALF 中IL-18和IL-1β濃度低于VILI模型組 (P值均＜0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)結(jié)果 A:對(duì)照組；B:機(jī)械通氣肺損傷模型組；C:瘦素組 HE ×200

表2 各組大鼠血清及BALF中IL-18、IL-1β濃度的比較 (ng/L,±s)

表2 各組大鼠血清及BALF中IL-18、IL-1β濃度的比較 (ng/L,±s)

注:BALF 為支氣管肺泡灌洗液；VILI為機(jī)械通氣肺損傷；與對(duì)照組比較,a P ＜0.01；與VILI模型組比較,b P ＜0.05

組別 鼠數(shù) 血清BALF IL-18 IL-1β IL-18 IL-1β對(duì)照組 12 32±15 43±13 40±12 136±27 VILI模型組 12 124±24a 142±19a 132±22a 505±41a瘦素組 12 99±22ab 119±24ab 111±15ab 463±38ab F 值 63.40 87.37 98.10 381.20 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.4 肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白表達(dá) 3組之間比較,肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F值分別為28.85、34.72,P值均＜0.01)。VILI 模型組、瘦素組NLRC4、caspase-1蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組 (P值均＜0.01),瘦素組NLRC4、caspase-1 蛋白表達(dá)低于VILI模型組 (P值均＜0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果

表3 各組大鼠肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白表達(dá)的比較 (±s)

表3 各組大鼠肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白表達(dá)的比較 (±s)

注:VILI為機(jī)械通氣肺損傷；與對(duì)照組比較,a P ＜0.01；與VILI模型組比較,b P ＜0.05

組別 鼠數(shù) NLRC4蛋白相對(duì)表達(dá)量caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組 12 0.50±0.16 0.42±0.12 VILI模型組 12 1.18±0.27a 0.98±0.21a瘦素組 12 0.92±0.22ab 0.79±0.16ab F 值 28.85 34.72 P 值 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

動(dòng)物研究結(jié)果顯示,外源瘦素可能在膿毒癥導(dǎo)致的ALI中起肺保護(hù)作用[3],抑制炎癥小體的激活、減輕炎癥反應(yīng)對(duì)ALI有重要的保護(hù)作用[5-7]。然而瘦素是否能通過作用于NLRC4炎癥小體減輕大鼠VILI尚無相關(guān)研究。因此,本實(shí)驗(yàn)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期研究成果[8],應(yīng)用外源性瘦素 (50μg/kg)預(yù)處理VILI模型大鼠,以探討瘦素預(yù)處理在大鼠VILI發(fā)病過程中的作用機(jī)制。

有研究顯示[8-9],不同劑量外源性瘦素的應(yīng)用能不同程度地緩解炎癥的發(fā)展,對(duì)炎癥性疾病有良好的治療作用,瘦素對(duì)細(xì)胞感染和損傷的調(diào)控機(jī)制可能是通過各種細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)的。此外,肺氣道上皮細(xì)胞被激活后,瘦素可合成并產(chǎn)生黏附分子和細(xì)胞因子,延長了肺氣道上皮細(xì)胞的生存期限[10]。NLRC4是由N 端的天冬氨酸蛋白水解酶募集結(jié)構(gòu)域 (caspase recruitment domain,CARD)、中間的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域和C 端的亮氨酸聚集結(jié)構(gòu)域組成。NLRC4 炎癥小體是由NLRC4 和caspase-1組成的多蛋白復(fù)合物,當(dāng)細(xì)胞受細(xì)胞外信號(hào)(如胞質(zhì)細(xì)菌鞭毛蛋白、革蘭染色陰性的Ⅲ型分泌系統(tǒng)、脂多糖等)刺激后,NLRC4 N 端的CARD 通過與caspase-1的CARD 相互作用,產(chǎn)生IL-18和IL-1β等炎癥因子,可廣泛參與調(diào)節(jié)免疫功能、炎癥反應(yīng)、焦亡等有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[11-13]。有研究表明[14],腺苷酸激活蛋白激酶的磷酸化能減少NLRC4炎癥小體的激活,但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討,而瘦素已經(jīng)被證明能激活不同的信號(hào)通路,包括腺苷酸激活蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B和激活的Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路52 等[15-16]。因此,瘦素可能通過抑制NLRC4炎癥小體活性發(fā)揮抗炎的潛能。本實(shí)驗(yàn)顯示,對(duì)照組肺組織中僅有少量NLRC4炎癥小體表達(dá)；VILI模型組NLRC4 炎癥小體表達(dá)增強(qiáng),說明VILI大鼠肺組織中NLRC4炎癥小體激活明顯增加；瘦素組肺組織中NLRC4 炎癥小體表達(dá)較VILI模型組減少,證明瘦素預(yù)處理可以抑制NLRC4炎癥小體的激活。

在VILI發(fā)病過程中,IL-1β具有促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞中p38磷酸化和趨化因子上調(diào)的能力,從而加重ALI,IL-1β還可激活炎性細(xì)胞并釋放氧自由基,直接造成肺組織損傷；而組織蛋白酶D 抑制劑pepstatin A 抑制IL-1β表達(dá),減輕ALI[17]。另有研究表明,具有生物活性的IL-18可進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng),并誘導(dǎo)更多炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生,例如IL-1β、IL-6 和單核細(xì)胞趨化蛋白1 等,是ALI發(fā)病過程中合成的主要炎癥因子之一[18]。此外,IL-1β已被證明可通過減少上皮鈉通道而導(dǎo)致肺水腫[19]。而IL-18已被證實(shí)與ALI的發(fā)生有關(guān)[20]。兩者的高濃度與危重患者的ALI風(fēng)險(xiǎn)以及發(fā)病率和死亡率指標(biāo)有關(guān)[21]。因此,抑制IL-1β和IL-18是減少ALI和維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要治療靶標(biāo)。但有實(shí)驗(yàn)表明單純阻斷IL-1β或IL-18可能不足以抑制過度的免疫反應(yīng)[22]。因此,同時(shí)抑制IL-1β和IL-18產(chǎn)生的抑炎效應(yīng)可能對(duì)ALI的治療有效。本研究顯示,在VILI模型中,肺NLRC4炎癥小體及其介導(dǎo)的IL-1β、IL-18 炎癥因子被激活,表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加；而應(yīng)用瘦素后其表達(dá)量明顯降低,說明瘦素預(yù)處理可以抑制NLRC4介導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。提示NLRC4炎癥小體依賴的炎癥因子途徑很可能是瘦素調(diào)節(jié)VILI的分子機(jī)制之一(圖3),但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上,本研究結(jié)果表明,瘦素預(yù)處理可減少機(jī)械通氣大鼠肺組織NLRC4炎癥小體表達(dá)而失去活性,抑制肺NLRC4炎癥通路激活,減輕肺損傷,從而發(fā)揮肺保護(hù)作用,但其肺保護(hù)作用的機(jī)制和最適劑量仍有待進(jìn)一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

圖3 瘦素在大鼠機(jī)械通氣肺損傷中的作用及其可能機(jī)制的信號(hào)通路