徐 彪，馮藝川，李玉發(fā)，何中國，吳松權*

(1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林 公主嶺 136110)

花生(ArachishypogaeaLinn.)是吉林省重要的油料作物和經(jīng)濟作物，也是吉林省西部地區(qū)主栽的旱田作物之一。由于特殊的氣候條件，吉林省花生品質好，口感佳，特別是黃曲霉污染較低[1]。但吉林省花生新育成品種遺傳基礎狹窄，品種退化，專用品種少等問題嚴重影響吉林省花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。因此，開展新型分子標記技術，科學合理地分析、利用吉林省花生種質資源，有利于更好更快地建立花生良種繁育體系，有助于加快專用型花生品種的選育和引進[1-2]。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)是一種基于聚合酶鏈式反應，以10核苷酸的隨機序列，擴增所研究材料的基因組DNA分子標記技術[3-4]。由Williams和Welsh于1990年幾乎同時提出和建立[5-6]。與其它標記相比，RAPD既不需要DNA探針，也不需要序列的信息；并且RAPD擴增程序不涉及DNA雜交及其相關步驟，操作簡單和高效；與RFLP標記相比，RAPD能檢測到更高的多態(tài)性；另外，RAPD擴增的產(chǎn)物可以克隆、測序、轉化為其他類型的標記，如序列標簽位點(STS)、序列特異擴增區(qū)域(SCAR)標記等優(yōu)點[4]，廣泛應用于遺傳多樣性分析。馬孟莉等[7]利用11個RAPD引物對48份草果分為4類；王同華等[8]應用RAPD和ISSR分子標記技術對湖南省飯豆地方品種進行了遺傳多樣性研究，遺傳相似性系數(shù)在0.649～0.876 5之間；朱學鑫等[9]采用RAPD標記研究了國內不同產(chǎn)地白及的遺傳多樣性和親緣關系，在遺傳相似性系數(shù)為0.58處分為2類。以上結果表明，RAPD分子標記在不同的物種中均能夠很好的反應品種(材料)間的遺傳變異，可用于花生遺傳多樣性分析。

為了進一步系統(tǒng)的采用RAPD分子標記技術研究花生的遺傳多樣性和花生品種間遺傳距離。該文利用2×Taq PCR Mix酶的快速簡便、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，首先對花生RAPD-PCR反應體系進行優(yōu)化，之后使用優(yōu)化后的反應體條件對22個花生品種進行遺傳多樣性分析，對提高花生新品種選育和遺傳改良效率均具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

來源于吉林省農(nóng)業(yè)科學院花生研究所收集的22份花生種質資源(表1)，取15 d花生幼苗嫩葉為試驗材料。

表1 花生種質資源名稱Table 1 Name of germplasm resources of A.hypogaea

1.2 基因組DNA提取及檢測

采用BIOMIGA公司Ezgene TM CP Plant Miniprep Kit(GD2621)的方法，提取花生基因組DNA，用超微量分光光度計和瓊脂糖電泳進行檢測，將總DNA稀釋為10 ng/μL，置于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及檢測

PCR預擴增程序為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，35～40 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)36～40次；12 ℃保存。擴增產(chǎn)物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)Gold View Ⅰ型核酸染色劑染色后在凝膠分子成像儀器(JY04S-3E型)成像保存。

1.4 隨機引物的篩選

以多個地理來源的科富花1、花育20、吉花9、雙遼紅粒、白院花8、鐵花16等量均勻混合的花生DNA為模板，對200個隨機引物進行篩選。最后選擇多態(tài)性高，重復性好的24個引物，用于后續(xù)試驗。其中，引物OPJ-14(5'-CACCCGGATG-3')在花生基因組總DNA中擴增條帶比較均勻、清楚。因此，該研究中選用引物OPJ-14進行優(yōu)化試驗。

1.5 RAPD反應體系的單因素優(yōu)化設計

選用混合后的花生DNA作為反應體系優(yōu)化的模板，以引物OPJ-14對影響反應的4個主要因素(退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物和模板DNA)進行單因素優(yōu)化分析，各因素設置如下：退火溫度為35、36、37、38 、39、40 ℃；循環(huán)次數(shù)為36、37、38、39、40；引物濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 pmol；模板DNA濃度為10、15、20、25、30 ng。保持其他因素不變，其中單一因素濃度改變，篩選最適合的濃度，以獲得最佳的反應體系。

1.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳圖譜，以0、1統(tǒng)計RAPD帶型，在相同遷移位置上有條帶計為“1”，無條帶計為“0”，條帶缺失計為“9”，建立二維矩陣，用Microsoft Excel 2017處理相應數(shù)據(jù)，并根據(jù)分析軟件的文本格式進行相應轉化。使用NTSYS-pc Version 2.1軟件進行計算遺傳相似系數(shù)，最后使用UPGMA的方法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA濃度及質量檢測

該試驗采用BIOMIGA公司試劑盒提取花生DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，DNA條帶清晰、明亮無拖尾現(xiàn)象(圖1)。OD260/OD280值介于1.8～2.0。純度較高，可進一步用于RAPD擴增。

2.2 RAPD反應體系的單因素優(yōu)化

2.2.1 退火溫度與循環(huán)次數(shù)篩選

退火溫度篩選試驗結果(圖2)，退火溫度為35～40 ℃時，均能擴增出條帶，在36 ℃時，條帶最清晰，因此，退火溫度采用36 ℃。循環(huán)次數(shù)為36～40時，均能擴增出條帶(圖3)，其中，循環(huán)次數(shù)為38時，條帶最清晰，因此，循環(huán)次數(shù)采用38。

2.2.2 引物濃度與模板DNA濃度篩選

通過PCR擴增反應篩選最佳引物濃度的試驗結果(圖4)顯示，引物濃度為0.1和0.2 pmol時，擴增條帶模糊，有條帶缺失，而引物濃度為0.4和0.5 pmol時，擴增條帶最清晰，因此，引物濃度選用0.4 pmol最為適宜。最佳模板DNA濃度篩選試驗結果(圖5)顯示，反應中這5種濃度梯度上均能擴增出條帶，模板濃度為10和15 ng時，擴增條帶亮度較弱，在20、25和30 ng擴增產(chǎn)物條帶最為清晰，結果一致，因此，模板DNA濃度選20 ng最為適宜。

2.3 引物篩選與RAPD標記多態(tài)性分析

以22份來自不同地區(qū)的花生品種為試驗材料，從200個隨機引物中篩選出24個條帶清晰、多態(tài)性高且重復性好的引物(表2)，用于花生遺傳多樣性分析。24個引物共擴增得到134個穩(wěn)定條帶，多態(tài)性條帶112個，多態(tài)性比率83.58%；每個引物擴增條帶數(shù)為3～9條，平均每個引物產(chǎn)生多態(tài)性條帶數(shù)為4.667條，其中，OPB-10擴增的條帶數(shù)最多，為9條；擴增引物多態(tài)性比率為100%的為OPB-10、OPB-13、OPC-07、OPD-05、OPH-11、OPI-08、OPJ-01，圖6為引物OPG-11擴增結果。

表2 24條多態(tài)性引物擴增結果Table 2 Amplification results of 24 polymorphic primers

2.4 聚類分析結果

用NTSYS-pc Version 2.1軟件計算花生品種遺傳相似性系數(shù)(表3)表明：22個花生品種的平均遺傳相似系數(shù)為0.697，不同品種之間遺傳相似系數(shù)的范圍為0.385～0.969，其中，鐵花16、錦花30與吉黑花1號的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.385，關系最遠。吉花53與吉花54遺傳相似性系數(shù)最大，為0.969，關系最近，可能來源于同一父母本。根據(jù)供試材料相似值，采用UPGMA方法進行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.666時，供試材料可分為3大類(圖7)，其中，第1大類主要以吉林省選育的花生品種為主，第2大類以引進其它省份的花生品種為主，第3類包括兩個品種白院花10和錦花14。

表3 22份花生品種遺傳相似性系數(shù)Table 3 Genetic similarity coefficients of 22 varieties of A.hypogaea

3 討論與結論

RAPD是90年代發(fā)展起來的標記技術，由于操作簡單高效等特點，目前已經(jīng)在很多生物上有報道[10-16]，說明RAPD標記技術是一個可靠有效的方法。RAPD分子標記技術存在低重復性，特異譜帶不穩(wěn)定性，為了讓試驗數(shù)據(jù)更加準確，須對反應體系和擴增程序進行優(yōu)化，為此獲得更加準確的數(shù)據(jù)[17]。葉冰瑩等[18]對花生RAPD反應條件dNTPs、MgCl2和Taq酶濃度等做了初步優(yōu)化，Taq聚合酶類別及用量對隨機擴增試驗起著至關重要的作用。該試驗所用2×Taq Master Mix酶不僅自帶藍色染料且含有DNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶，而且2×Taq Master Mix酶還具有靈敏度高、穩(wěn)定性好，只需要加入模板DNA和引物即可[19]，不僅減少人為誤差，還能節(jié)省時間，因此，該研究利用2×Taq Master Mix對花生RAPD-PCR反應體系進行了優(yōu)化。研究表明，退火溫度、PCR循環(huán)次數(shù)、模板用量與引物用量均會決定擴增效果[20]。在該試驗中，退火溫度為35～40 ℃時，均能擴增出條帶，循環(huán)次數(shù)和模板DNA濃度篩選試驗也具有類似結果，與陳思等[21]研究結果基本一致，對該試驗影響最大的為引物用量，引物濃度低則PCR產(chǎn)物較少，過高會產(chǎn)生非特異性擴增[22]。綜合以上試驗結果,得出適合花生RAPD反應體系為20 μL總反應體積中含2×Taq Mix 10 μL、引物4 μLpmol、模板DNA 20 ng；確立的擴增程序為：PCR擴增程序為95 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；共循環(huán)38次。

近年來，關于RAPD標記技術在遺傳多樣性分析上被廣泛應用[23-31]，但在花生上的報道相對較少。Subramanian等[32]采用RAPD技術分析了70份花生種質資源遺傳多樣性，在48個隨機引物中有7個隨機引物具有多態(tài)性，多態(tài)性百分率為7%。姜慧芳等[33]采用RAPD技術對7個不同植物學類型花生種質資源進行了分析，其中，13個引物多態(tài)性百分率為21.48%。以上2人的研究結果與該試驗結論相類似，但多態(tài)性百分率要比該試驗低，該研究24個引物多態(tài)性百分率為83.58%，遺傳相似性系數(shù)為0.385～0.969，說明該試驗22個花生種質資源具有較豐富的遺傳多樣性。其中，從分子的角度分析，遺傳距離變異幅度越大，表明品種間遺傳分化越明顯，遺傳多樣性越高[34]?？梢钥闯觯髌贩N之間遺傳差異較廣泛，品種資源豐富。閆苗苗等[35]利用RAPD標記對24份花生栽培品種進行遺傳多樣性分析，其中13個引物共擴增出123個條帶，依據(jù)Nei-Li系數(shù)將供試的24個品種的花生聚為4類。一般來講，相同地理環(huán)境的品種應該聚為一類，并且地理環(huán)境與分子標記間存在著一定的聯(lián)系，遺傳變異程度和地理環(huán)境的關系一直備受關注[36]。該研究在遺傳相似性系數(shù)0.666處將供試材料分為3大類(圖7)，說明RAPD標記技術完全可以區(qū)分22份花生品種。但是，在該試驗研究中相同粒型和相同地區(qū)并沒有聚為一類，也沒有表現(xiàn)出遺傳距離和地理位置存在聯(lián)系，與林茂[37]等研究結果基本一致，進一步說明分子標記技術有較高的應用價值。牟書靚等[38]利用農(nóng)藝性狀對花生種質資源進行聚類分析，其中，東北王與雙遼紅粒在同一個群組中，這與該試驗的結果相同。吉花53與吉花54的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.969，親緣關系最近，沒有被明顯的區(qū)別開，這是由于來自相同的雙親且選育目標完全一致而導致親緣關系極其相近。鐵花16、錦花30與吉黑花1號的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.385，說明親緣關系最遠。