李 君，單莉杰，鄭大浩，吳委林

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

玉米是主要的糧食和飼料作物，在農(nóng)業(yè)上占據(jù)重要位置。近年來(lái)，玉米彎孢葉斑病頻發(fā)，病害發(fā)生面積逐年擴(kuò)大，在國(guó)外以及我國(guó)河南[1]、山東[2]、黑龍江[3]等多地玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。該病又稱(chēng)擬眼斑病、黃斑病，在玉米生育期內(nèi)均可發(fā)生，主要危害植株葉片，也危害葉鞘和苞葉，通常由植株下部向上發(fā)生，抽雄后該病害迅速發(fā)展，葉片病斑可達(dá)100%。一般會(huì)造成減產(chǎn)20%～30%，多地減產(chǎn)50%以上，甚至絕收，嚴(yán)重影響玉米生產(chǎn)[4-5]。該病是我國(guó)繼玉米大斑病及小斑病之后又一嚴(yán)重危害玉米的葉斑病，已引起有關(guān)研究者的高度重視，并做出大量有成效的工作。

1 彎孢霉菌生物學(xué)特性

彎孢霉菌，屬半知菌亞門(mén)彎孢霉屬真菌，病原種類(lèi)包括新月彎孢菌、蒼白彎孢菌、斑點(diǎn)彎孢菌、畫(huà)眉草彎孢、棒彎孢菌等[6]。其中，新月彎孢菌致病力最強(qiáng)，為優(yōu)勢(shì)種[4]。

彎孢霉菌生物學(xué)特性的研究是培養(yǎng)和研究菌的基礎(chǔ)，不同學(xué)者對(duì)玉米彎孢霉菌的生物學(xué)特性也有不同的結(jié)論。玉米彎孢霉葉斑病菌生長(zhǎng)的溫度范圍為9～38 ℃，pH值3～10，最適溫度30 ℃，最適pH值7[7-9]。分生孢子產(chǎn)生的溫度范圍15～38 ℃，張定法等[7]認(rèn)為，分生孢子萌發(fā)的最適溫度為30～32 ℃，而白元俊[10]認(rèn)為，最適萌發(fā)溫度為28～30 ℃，因此，分生孢子最適溫度范圍為25～35 ℃，最適pH值為6～7，研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)濕度96%以上孢子開(kāi)始萌發(fā)，在水滴中萌發(fā)率可達(dá)95%以上，而光線(xiàn)對(duì)孢子萌發(fā)有抑制作用[11-12]；菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度25～32 ℃，最適溫度25～30 ℃，尤其溫度在30 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)到最快，在pH值為6～8時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最適宜、產(chǎn)孢量最大，且光照有利于菌絲生長(zhǎng)。病菌生長(zhǎng)以果糖作碳源，以甘氨酸作氮源菌絲生長(zhǎng)最佳；以可溶性淀粉作碳源、以酪氨酸作氮源產(chǎn)孢最多[11,13-14]。彎孢霉菌在干燥條件下可越冬存活，潮濕條件下易發(fā)生腐爛。用高粱粒擴(kuò)繁彎孢菌時(shí)，接種后5 d產(chǎn)生子座。初期在高粱粒表面形成黑色小突起，突起不斷向上生長(zhǎng)形成棒狀，有時(shí)在頂端形成二叉狀的分枝，子座內(nèi)部多為擬薄壁組織，水分充足時(shí)，子座外表長(zhǎng)出絨毛[14]。由于研究材料、研究方法及地域環(huán)境的不同，不同學(xué)者對(duì)玉米抗彎孢菌葉斑病的研究結(jié)果會(huì)有所差別，如彎孢菌的生物學(xué)特性研究中，其最適溫度、pH值、濕度等相關(guān)參數(shù)會(huì)有不同的參考范圍。

玉米彎孢霉葉斑病沒(méi)有統(tǒng)一的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和抗性評(píng)價(jià)。目前不同的研究者主要采用7級(jí)和10級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。趙來(lái)順等[15]依據(jù)病斑特性和產(chǎn)孢量將病斑分為感病型、中間型和抗病型3種，李賀年等[16]認(rèn)為，抗感性不能從單一的因素來(lái)確定，由潛育期、侵染率、病斑大小、產(chǎn)抱量等綜合因素的結(jié)果最終表現(xiàn)在病情指數(shù)的高低，亦即病害或危害的程度上，這種不統(tǒng)一性很難對(duì)玉米品種的抗性做出準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。

2 彎孢霉菌致病因子

病原物產(chǎn)生的可以破壞寄主細(xì)胞或干擾寄主正常生理代謝功能的物質(zhì)均稱(chēng)為致病因子，例如角質(zhì)酶、細(xì)胞降解酶、毒素、黑色素和激素等。該文主要對(duì)角質(zhì)酶、細(xì)胞降解酶、毒素和黑色素等4種致病因子進(jìn)行闡述。

2.1 角質(zhì)酶

角質(zhì)酶(cutinase)屬于絲氨酸酯酶，分子量大多在21～60 kDa之間，是一種α/β 水解酶，對(duì)病原真菌的致病性具有重要作用[17-18]。角質(zhì)層作為許多病原真菌侵染植物第1道屏障，在遭受侵染的過(guò)程中，不同真菌的作用機(jī)制不同。有的真菌病原物，例如稻瘟病菌產(chǎn)生附著胞在葉片上利用機(jī)械壓力直接穿透角質(zhì)層；還有通過(guò)角質(zhì)酶降解角質(zhì)層，降低植物的防御性，和細(xì)胞壁降解酶共同完成侵染過(guò)程。

角質(zhì)酶在真菌與植物病原體的互作中起著各種作用，例如在腐生植物的生長(zhǎng)過(guò)程中引發(fā)宿主衍生的信號(hào)、真菌孢子的附著、碳的吸收及致病性。然而，在我國(guó)重要的玉米葉斑病菌彎孢霉菌中關(guān)于角質(zhì)酶的相關(guān)特性鮮有報(bào)道，2016年Liu等[19]確定了彎孢霉菌基因組中的13個(gè)角質(zhì)酶基因(ClCUT1至ClCUT13)，并分析了它們?cè)谒拗?病原體相互作用中的表達(dá)模式，這對(duì)角質(zhì)酶基因家族分析具有深遠(yuǎn)的意義。該研究通過(guò)多序列比對(duì)顯示，大多數(shù)真菌角質(zhì)酶蛋白具有1個(gè)高度保守的GYSQG基序和相似的DxVCxG[ST]-[LIVMF](3)-x(3)H基序。角質(zhì)酶的基因結(jié)構(gòu)分析顯示了1個(gè)復(fù)雜的內(nèi)含子-外顯子模式，內(nèi)含子和外顯子的位置和數(shù)量不同。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，彎孢霉病原菌角質(zhì)酶和其他真菌中已知曉的78種角質(zhì)酶蛋白分為4個(gè)亞組，其中，彎孢霉菌角質(zhì)酶僅屬于第3個(gè)亞組，基序分析表明，來(lái)自彎孢霉菌的每組角質(zhì)酶都有一個(gè)共同的基序。實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果表明，病原體和宿主之間相互作用中角質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平具有不同的表達(dá)模式。有趣的是，在早期發(fā)病機(jī)理中，ClCUT7的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，接種后3 h最明顯的上調(diào)。當(dāng)敲除ClCUT7基因時(shí)，突變體在未受傷玉米葉上的致病性降低，證明了角質(zhì)酶基因ClCUT7的致病作用。

2.2 細(xì)胞壁降解酶

植物細(xì)胞壁主要由纖維素、木聚糖、果膠質(zhì)等成分構(gòu)成，是植物抵御病原菌侵害的天然屏障。因此，病原菌在侵入植物體的過(guò)程中產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶(CWDEs)和漆酶，這些酶類(lèi)可以降解植物細(xì)胞壁的各種組分從而使病原菌侵入植物體，是重要的致病因素。

新月彎孢菌在離體和活體條件下可產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果膠甲基反式消除酶(PMTE)和纖維素酶(Cx)等一系列細(xì)胞降解酶。2010年周舒揚(yáng)等[20]首次發(fā)現(xiàn)新月彎孢菌可以產(chǎn)生漆酶(Laccase)，是一種含銅的多酚氧化酶，可以氧化酚類(lèi)物質(zhì)，催化木質(zhì)素的降解，且PG、PMG、Cx和漆酶酶活均在第3天達(dá)到峰值，漆酶酶活明顯高于前3者且酶活迅速提高；玉米新月彎孢中已經(jīng)鑒定出8個(gè)漆酶基因[21]，與其他來(lái)源的真菌漆酶同樣有4個(gè)特征保守序列區(qū)，表明有可能具有相似的進(jìn)化關(guān)系和功能。PG基因家族鑒定出Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4 4個(gè)成員，研究發(fā)現(xiàn)Clpg1基因敲除后影響多聚半乳糖醛酸酶活性，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率下降、PG活性降低致病力減弱[22-24]，說(shuō)明Clpg1基因通過(guò)調(diào)控病菌的多聚半乳糖醛酸酶活性調(diào)節(jié)病菌的致病性。

2.3 毒素及其生物合成

毒素是病原菌產(chǎn)生的一類(lèi)具有天然活性的次生代謝產(chǎn)物，是玉米彎孢菌的主要致病因子之一?？煞譃榧闹鲗?zhuān)化性毒素和非寄主專(zhuān)化性毒素。Macri等[25]首次研究發(fā)現(xiàn)彎孢菌(Curvularia lunata)產(chǎn)生的毒素為非寄主專(zhuān)化性毒素，經(jīng)乙酸乙酯萃取和硅膠柱層析法從彎孢菌液中分離出2種毒素，后經(jīng)鑒定得知彎孢菌毒素結(jié)構(gòu)為甲基-(5-羥甲基)呋喃-2-羧酸鹽(M5HF2C)，分子式C7O4H8，分子量156[26]。國(guó)內(nèi)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)，彎孢菌產(chǎn)生致病毒素，并命名為C1毒素[27]。該毒素溶于水、甲醇、氯仿和乙酸乙酯，酸性條件下更活躍，具有光、熱穩(wěn)定性。有研究表明，彎孢菌在改良Fries3號(hào)培養(yǎng)基中產(chǎn)毒能力最強(qiáng)，在第10、15天菌株生長(zhǎng)量和產(chǎn)毒量一致達(dá)到高峰，pH值3.5、溫度20～25 ℃彎抱菌產(chǎn)毒量最高[28]。

彎孢菌毒素處理寄主植物后，發(fā)現(xiàn)葉肉中丙二醛的含量提高，細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，使內(nèi)含物質(zhì)滲漏；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)如葉綠體、線(xiàn)粒體和細(xì)胞壁等發(fā)生一定程度的損害，以致于不能進(jìn)行正常的光合作用，從而使玉米受害部位褪綠出現(xiàn)病斑，嚴(yán)重時(shí)葉片枯死。經(jīng)毒素處理過(guò)的感病品種SOD活性提高，有利于及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，使寄主因缺少活性氧而無(wú)法激發(fā)產(chǎn)生抗性[29]。

前人通過(guò)RNA-Seq發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒缺失突變株T806中存在Pks基因簇[30-31]，其中，Pks18和bmr1基因在突變株中的表達(dá)量很低，因此，Pks基因簇應(yīng)該與彎孢菌毒素合成有關(guān)。其他影響毒素合成的基因，如：Brn1和Clt-1基因在野生型菌株中可正常表達(dá)，在沉默突變株及敲除株的表達(dá)被抑制，致病力下降；并且該基因在彎孢菌強(qiáng)致病菌株中的表達(dá)量高于弱致病菌株。單獨(dú)敲除clvelB基因時(shí)，Clt-1基因的表達(dá)也下降；同時(shí)敲除Clt-1和clvelB基因時(shí)，菌株的產(chǎn)毒量、Cx、PG、PMG活性及致病力均降低。Brn1、Clt-1和clvelB基因均參與調(diào)控彎孢菌的致病能力，并且clvelB基因可影響Clt-1基因的表達(dá)。Clt-1通過(guò)與木聚糖酶(ClXyn24)、木聚糖乙酰轉(zhuǎn)移酶(ClAxe43)互作，影響毒素的合成[32-34]。

2.4 黑色素及其生物合成

黑色素(melanin)是一種廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中的非均質(zhì)的類(lèi)多酚聚合體，除了具有抗氧化、抗溶菌酶、吸收紫外線(xiàn)、抵御宿主免疫攻擊從而保護(hù)病原真菌等作用，還被認(rèn)為是病原真菌侵染寄主的關(guān)鍵致病因子之一。病原真菌通過(guò)形成附著胞，在附著胞壁積累黑色素，附著胞孔產(chǎn)生的侵染絲在膨壓機(jī)械力量的驅(qū)動(dòng)下穿透寄主角質(zhì)層和和細(xì)胞壁從而進(jìn)入植物組織，但角質(zhì)酶、纖維素酶和果膠酶的釋放能降解葉片的某些組分會(huì)使得穿透過(guò)程更加容易[35]。根據(jù)黑色素合成途徑中間產(chǎn)物的不同，黑色素分為γ-谷氨酰胺酰-3，4-對(duì)苯二酚(GHB)、兒茶酚、多巴(DOPA)和多聚二羥萘(DHN)等[36]，其中，DHN黑色素被認(rèn)為是重要的毒力因子[37]，DHN黑色素普遍存在于子囊菌亞門(mén)和半知菌亞門(mén)真菌中[38]。在不同生物體內(nèi)，黑色素合成途徑也不同。典型的DHN黑色素合成途徑包括5種關(guān)鍵的催化酶：聚酮合酶(Polyketide synthase，PKS)、1，3，6，8-四羥基萘還原酶(1，3，6，8-tetra-HN reductase，T4HR)、小柱孢酮脫水酶(Scytalone dehydratase，SCD)、1，3，8-三羥基萘還原酶(1，3，8-tri-HN reductase，T3HR)和漆酶(Laccase，LAC)[39]。煙曲霉還需要一種縮鏈催化酶Aayg1[40]。

王曉飛等[41]利用酸堿沉淀法提取了玉米彎孢菌胞內(nèi)及胞外黑色素，黑色素在紫外和可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有吸收峰，在紅外光譜上存在一定差異性。表明胞外黑色素為DOPA黑色素，胞內(nèi)黑色素為DHN黑色素，與外文文獻(xiàn)報(bào)道一致[41-42]。因?yàn)镈HN黑色素與病原菌致病性相關(guān)，可以認(rèn)為胞內(nèi)黑色素與真菌致病性密切相關(guān)，而胞外的黑色素基本不起作用。三環(huán)唑(DHN-黑色素合成的抑制因子)處理菌株后觀(guān)察到菌絲顏色變淺和分生孢子顏色基本無(wú)差，說(shuō)明玉米彎孢病原菌菌絲產(chǎn)生的黑色素是DHN黑色素；三環(huán)唑處理菌株后接種黃早四與正常菌株接種相比病情指數(shù)明顯降低，葉片發(fā)病情況有所緩解；黑色素對(duì)玉米葉片的細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)破壞力遠(yuǎn)低于毒素，兩者均導(dǎo)致葉片電解質(zhì)滲漏增加，更重要的是黑色素與毒素復(fù)合處理時(shí)可以加速葉片電解質(zhì)滲漏。

研究表明[34]，毒素合成基因(Clt-1)和黑色素合成基因(Brn-1)之間可能存在某種聯(lián)系。黑色素合成關(guān)鍵酶Brn1、Brn2和抗氧化脅迫關(guān)鍵酶SOD對(duì)致病力具有影響，F(xiàn)e-SOD基因敲除會(huì)影響黑色素合成從而降低玉米彎孢葉斑病菌早期致病力[43]。

3 相關(guān)信號(hào)通路

植物病原真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病均是在感受到外界信號(hào)并作出一系列應(yīng)答以適應(yīng)環(huán)境，這就需要病原真菌敏銳的感知外界信號(hào)的刺激，接收信號(hào)并傳遞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，快速做出應(yīng)激反應(yīng)。目前為止，植物病原真菌中主要存在促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑、依賴(lài)cAMP蛋白激酶A(PKA)通路途徑、G蛋白信號(hào)途徑和鈣離子(Ca2+)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控病原菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病性[44]。

3.1 MAPK信號(hào)通路

MAPK途徑位于G蛋白下游，是一系列高度保守的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可以將胞外信號(hào)傳送至胞內(nèi)[45]。MAPK由MAPK3激酶、MAPKK激酶和MAPK激酶(MAPK)組成，G蛋白將信號(hào)傳遞給MAPK3，MAPK3使MAPKK磷酸化，MAPKK再使MAPK磷酸化，信號(hào)通過(guò)MAPK途徑逐級(jí)增大并傳送到下游目的蛋白[46]；還可以靶向共激活因子和輔助抑制因子，并進(jìn)一步通過(guò)誘導(dǎo)組蛋白修飾影響核小體結(jié)構(gòu)[47]。

玉米彎孢葉斑病菌中鑒定出Fus3/Kss1-MAPK途徑的3個(gè)蛋白激酶基因分別為Clf、Map2k、Clk1和錨定蛋白基因ClSte50[48]，推測(cè)該途徑可能參與調(diào)控病菌的致病性。研究發(fā)現(xiàn)CLMfp基因參與乙酰輔酶A的合成，而且孢子釋放的脂肪酸激活成相應(yīng)的乙酰輔酶A，經(jīng)CLMfp催化基因的氧化后即可完成孢子的萌發(fā)。乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A的互作影響MAPK基因的表達(dá)，乙酰輔酶A同時(shí)通過(guò)調(diào)控毒素和黑色素的形成影響彎孢菌的致病性[49]。高士剛等[50]比較彎孢菌CX-3編碼蛋白與酵母菌(S.cerevisia)、水稻稻瘟病菌(M.grisea)MAPK通路中各關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)彎孢菌中存在分別與稻瘟病菌Pmk1、Mps1和Osm1同源的3個(gè)MAPK通路基因，Clk1、Clm1和Clh1?？寺『颓贸摶蚪Y(jié)果表明[51-53]，Clk1調(diào)控菌絲生長(zhǎng)、細(xì)胞壁降解酶活性和毒素含量；Clm1調(diào)控侵染能力和細(xì)胞壁降解酶活性；Clh1基因不僅調(diào)控了彎孢菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢，還調(diào)控角質(zhì)酶和細(xì)胞壁降解酶活性以及致病力，與同類(lèi)研究的結(jié)果一致[34]。

3.2 依賴(lài)cAMP蛋白激酶A(PKA)通路

cAMP作為細(xì)胞內(nèi)的第2信使，當(dāng)表面受體感受到環(huán)境物質(zhì)刺激信號(hào)后，G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶(Adenylyl cyclase，AC)，使嘌呤核酸環(huán)化生成胞內(nèi)cAMP[54]，cAMP可以激活依賴(lài)性蛋白激酶PKA，從而使下游的目標(biāo)蛋白或基因磷酸化，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。cAMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑在真菌致病調(diào)控中具有非常重要的作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期進(jìn)程、形態(tài)發(fā)生及性發(fā)育等各個(gè)方面[55]。

白念珠菌的Pde2基因調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP水平，Pde2基因缺失后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP無(wú)法降解以及KPA途徑的持續(xù)性激活[56]。高士剛等[50]在新月彎孢菌CX-3基因組中發(fā)現(xiàn)2個(gè)PKA蛋白激酶，參與cAMP途徑的調(diào)控。Liu等[57]克隆出PKAr基因，具有PKA調(diào)節(jié)亞基的保守序列，PKAr在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)菌絲體中的表達(dá)量最高，說(shuō)明PKAr基因參與調(diào)控新月彎孢菌菌絲的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。

3.3 G蛋白信號(hào)通路

異源三聚體G蛋白是一類(lèi)在真核生物中高度保守的蛋白，由α、β和γ 3個(gè)亞基構(gòu)成，各亞基由獨(dú)立的基因編碼[58]?？山閷?dǎo)下游Ca2+信號(hào)途徑、cAMP途徑和MAPK信號(hào)途徑，調(diào)控病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病性[59]。從玉米彎孢葉斑病菌中獲得的Clg2p基因在孢子萌發(fā)3 h表達(dá)量最高，可影響孢子的形態(tài)，對(duì)孢子的產(chǎn)量、萌發(fā)率及致病性起正向調(diào)控作用。Clg2蛋白含有Gα蛋白的所有結(jié)構(gòu)域和保守結(jié)構(gòu)域的特征性序列，認(rèn)為其屬于Gα蛋白。

Rho蛋白家族是一組三磷酸鳥(niǎo)苷(Guanosinetriphosphate，GTP)結(jié)合蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量大約在20～25 kD，具有GTP酶活性，因此也稱(chēng)為RhoGTP酶。Rho GTPases是控制所有真核細(xì)胞中各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子開(kāi)關(guān)。它們主要因其在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架中的關(guān)鍵作用而聞名，但它們影響細(xì)胞極性、細(xì)胞周期、膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和轉(zhuǎn)錄因子活性的能力可能同樣重要[60]。只要打開(kāi)1個(gè)GTPase，便可能同時(shí)協(xié)調(diào)激活幾個(gè)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其重要性不言而喻。Rho蛋白有2種狀態(tài)：1) 以RhoGTP的形式呈活性狀態(tài)，可激活下游信號(hào)通路；2) 以RhoGDP的形式呈失活狀態(tài)，將抑制下游信號(hào)通路。而RhoGAPs恰恰是可以調(diào)控、促使活性RhoGTP水解成無(wú)活性的RhoGDP，因而RhoGAPs是控制下游信號(hào)通路開(kāi)關(guān)的一種重要蛋白。

2015年王玉瑩等[61]研究分析了新月彎孢菌5個(gè)RhoGAP家族蛋白成員及序列特征，其氨基酸序列與其他真菌來(lái)源的RhoGAP一樣具有特征性保守序列區(qū)GAP，還包括LIM和FCH等結(jié)構(gòu)域，并發(fā)現(xiàn)與粗糙脈胞菌和小麥黃斑葉斑病的RhoGAP蛋白關(guān)系密切，其親緣關(guān)系最近。其基因號(hào)分別為CUR-10009139、CUR-10004348、CUR-10003650、CUR-10001506和CUR-10008358，并命名為ClRhoGAP1-ClRhoGAP5。經(jīng)生物信息學(xué)分析，5個(gè)ClRhoGAP基因編碼蛋白序列的氨基酸殘基數(shù)為681～3 489，所有的ClRhoGAP基因家族成員編碼蛋白的分子量大小為75.0～130.1 kD，等電點(diǎn)大小為5.94～9.29。

4 誘導(dǎo)玉米抗彎孢葉斑病機(jī)理

4.1 抗彎孢霉菌的生理生化研究

研究發(fā)現(xiàn)抗、感病品種接種和未接種葉片汁液對(duì)彎孢菌孢子萌發(fā)都有抑制作用，接種后葉片汁液對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用大于未接種葉片，抗病品種葉片汁液對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用大于感病品種[62]。推測(cè)抗病品種葉片汁液可能含有抑菌物質(zhì)，且病菌侵染有利于提高抑菌作用。寄主防御酶PAL，PO，SOD和β-1，3葡聚糖酶在對(duì)彎抱菌葉斑病的抗性中起到一定的作用，尤其是PR蛋白β-1，3葡聚糖酶活性在抗性機(jī)制中發(fā)揮更為重要的作用。

外施一定濃度的水楊酸、核黃素和維生素K3等誘導(dǎo)劑處理對(duì)玉米抗彎孢霉葉斑病具有一定的抗性。研究表明,外施10 mmol/L水楊酸處理玉米，每3 d接種1次的誘導(dǎo)效果最好，而以0.5 mmol/L核黃素處理玉米，每間隔2 d接種1次誘導(dǎo)效果極佳，發(fā)現(xiàn)其病情指數(shù)降低[63]。NO和H2O2作為信號(hào)分子參與調(diào)控玉米彎孢霉葉斑病菌侵染寄主的過(guò)程，可以減緩玉米彎孢霉葉斑病菌侵染進(jìn)程。NO和H2O2可誘導(dǎo)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(GST)、查爾酮合成酶基因(CHS)等抗病和防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，不同程度地提高植株防御酶如POD、CAT、PAL、SOD和β-1，3葡聚糖酶蛋白活性，進(jìn)而增強(qiáng)玉米對(duì)彎孢菌的抗性。外施一定濃度的NO供體硝普鈉(SNP)和H2O2的結(jié)果與上述結(jié)論一致[64-65]。

4.2 木霉菌誘導(dǎo)抗彎孢霉菌

木霉菌作為重要的真菌生防因子，誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生一系列局部或系統(tǒng)防御反應(yīng)。木霉菌可誘導(dǎo)棉花、菜豆、番茄、黃瓜、煙草、辣椒、萵苣、玉米等作物對(duì)多種病原菌的抗性[66]。木霉菌株包衣玉米種子后PAL、POD酶活性顯著增加[67]，系統(tǒng)誘導(dǎo)玉米幼苗產(chǎn)生對(duì)彎孢葉斑病的抗性。從康氏木霉T30的cDNA中克隆了與乙酰水解酶相似的基因PLA2，敲除試驗(yàn)顯示其調(diào)控胞外幾丁質(zhì)酶和β-1，3-半乳糖苷酶的酶活[68]，表明PLA2是生防作用相關(guān)的重要基因。哈茨木霉T66轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)后可誘導(dǎo)玉米葉片中茉莉酸(JA)通路相關(guān)基因Opr7表達(dá)[69]，提高玉米抗彎孢侵染能力。余傳金等[70-71]從哈茨木霉菌中成功克隆了疏水蛋白hyd1基因，采用融合PCR技術(shù)將hyd1基因以及eGFP基因融合在自身的啟動(dòng)子Phyd1后面，將hyd1：eGFP共定位在細(xì)胞膜。Hyd1可在玉米根系皮層內(nèi)表達(dá)，促進(jìn)木霉菌在根系內(nèi)定殖，進(jìn)而系統(tǒng)誘導(dǎo)了玉米對(duì)彎孢葉斑病菌等的抗性。這些都更深層次地揭示了植物-微生物互作后誘導(dǎo)植物抗性的機(jī)制。

4.3 miRNA抗彎孢霉菌的響應(yīng)

miRNA在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和外界脅迫應(yīng)答等方面具有重要功能，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。在抗、感病植株中miRNA上調(diào)表達(dá)或下調(diào)表達(dá)來(lái)介導(dǎo)玉米抗彎孢葉斑病的途徑，且miRNA與其對(duì)應(yīng)的靶基因表達(dá)模式通常成負(fù)相關(guān)。

有研究表明，在感病材料黃早四接種處理比對(duì)照中少鑒定出125個(gè)miRNA，而抗病材料魯原的接種處理比對(duì)照則多鑒定出895個(gè)miRNA。表明接種感病材料會(huì)抑制部分miRNA表達(dá)，而接種抗病材料則促進(jìn)新的miRNA表達(dá)，暗示提高miRNA表達(dá)豐度可能會(huì)增加玉米對(duì)彎孢霉菌的抗性。通過(guò)分析差異miRNA的靶基因，共得到46個(gè)與抗病相關(guān)的miRNA，如bdi-miR5054_1ss10TA的靶基因是BAXinhibitor1調(diào)控細(xì)胞死亡，ppt-miR894_R-3靶基因是紅素氧還蛋白，zma-miR164h-5p_R-4的靶基因是肉桂酸-4-羥化酶，PC732和凋亡蛋白(AMC1)、PC169和硫氧還蛋白(Trx)等均與抗病相關(guān)[72]。有研究表明，miRNA:PC732，在抗病品種中下調(diào)表達(dá)，感病品種中上調(diào)表達(dá)，通過(guò)抑制PC732的表達(dá)使得其靶基因CICMA1蛋白表達(dá)量增加，提高了對(duì)彎孢霉葉斑病的抗性[73]。

目前擁有的抗玉米彎孢菌葉斑病資源相對(duì)較少，常用的自交系黃早四、丹340、E28、Mo17、478、5003均為感病類(lèi)型，即缺乏穩(wěn)定高抗的玉米自交系。而Mo17的鑒定結(jié)果也有所爭(zhēng)議，也有將Mo17歸類(lèi)為較抗病類(lèi)型。因此，加強(qiáng)抗性資源鑒定、種質(zhì)改良以及育種創(chuàng)新的工作十分急迫且尤為關(guān)鍵。

5 玉米彎孢葉斑病防治技術(shù)

5.1 農(nóng)業(yè)與化學(xué)防治

選育抗病品種，淘汰感病品種是防治該病的有效措施。許多研究表明，玉米彎孢葉斑病菌以菌絲體潛伏于病殘?bào)w組織中或分生孢子狀態(tài)越冬[74]。因此玉米收獲后，及時(shí)清除病殘?bào)w，集中燒毀或深埋；也可以在秋種時(shí)深耕、深翻，把病葉病殘?bào)w埋入底層，創(chuàng)造良好生態(tài)環(huán)境，減輕發(fā)病。

在玉米大喇叭口末期噴施拿敵穩(wěn)、氟啶胺、吡唑醚菌酯等殺菌劑，可抑制彎孢菌孢子，抽雄后期2次用藥防治效果更佳。三唑酮作用于病菌后，植物細(xì)胞的細(xì)胞壁增厚，液泡變多，抑制菌絲生長(zhǎng)[75]。玉米施用拿敵穩(wěn)(300 g/hm2)后30 d玉米彎孢葉斑病防效為100%[76]，施用丙環(huán)唑和吡唑醚菌酯可抑制玉米彎孢葉斑病菌孢子萌發(fā)[77]。在藥劑的使用中為避免植物產(chǎn)生抗藥性可幾種藥劑交替施用。

5.2 生物防治

木霉菌在生物防治的研究中使用較為廣泛。木霉菌可誘導(dǎo)植物體防御酶產(chǎn)生，降解病菌細(xì)胞壁，并在MAPK、cAMP和G蛋白通路調(diào)控下誘導(dǎo)植物抗性[78]，其中，Thc6基因和Hyd1基因可調(diào)控玉米茉莉酸代謝途徑相關(guān)通路，激發(fā)茉莉酸表達(dá)，防治效果超過(guò)50%[66,68]。放線(xiàn)菌BPS2、枯草芽孢桿菌、新洋蔥伯克霍爾德氏菌(CLS20)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(CLS11)、解淀粉類(lèi)芽孢桿菌(CLS23)和惡臭假單胞菌(Sneb2249)對(duì)彎孢菌均有一定抑制效果[79]。除此之外，散沫花(Lawsonia inermis L.)的丙酮提取物對(duì)彎孢菌也有抑制作用[80]，以及銅殼聚糖納米粒(NPs)可增強(qiáng)玉米彎孢菌葉斑病防御反應(yīng)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[81]。

6 展望

6.1 進(jìn)一步從基因組層面揭示彎孢霉菌致病過(guò)程機(jī)制

在病原菌和寄主互作中，該過(guò)程中有非常關(guān)鍵的步驟與物質(zhì)，并且十分復(fù)雜。研究清楚該細(xì)節(jié)有利于全面認(rèn)識(shí)并揭示致病機(jī)制與其相對(duì)應(yīng)的抗性機(jī)制。目前已經(jīng)鑒定出彎孢葉斑病菌產(chǎn)生的毒素分子結(jié)構(gòu)，并預(yù)測(cè)出一些與毒素合成相關(guān)的基因，如Clt-1、Brn1Clk1Clm1和Clh1等，做了相關(guān)基因的敲除及驗(yàn)證工作，但整個(gè)作用過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生什么樣的酶與代謝物質(zhì)，相互作用機(jī)制還不是十分明確。比如玉米彎孢葉斑病致病因子中毒素合成基因Clt-1和黑色素合成基因Brn-1，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)它們之間存在著某種聯(lián)系，具體2基因是以何途徑相互作用，還不得而知，需要進(jìn)一步從其代謝通路調(diào)控、酶學(xué)基礎(chǔ)及基因鑒定等方面全面驗(yàn)證及解釋。

6.2 致病分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的深入研究

病原菌致病性分化，已有研究表明弱致病類(lèi)型與抗性寄主長(zhǎng)期互作會(huì)使抗性減弱甚至消失，同時(shí)病菌致病性增強(qiáng)。只有深入研究病原菌致病性及其分化的分子機(jī)理，才能為抗性品種選育提供篩選的靶標(biāo)基因，從根本上提高品種抗性。

病原菌致病因子對(duì)于侵入寄主起著及其重要的作用，其致病因子的合成又會(huì)受到來(lái)自胞內(nèi)信號(hào)的調(diào)控，對(duì)病原菌侵染過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究則對(duì)明確病原菌侵入寄主的過(guò)程十分關(guān)鍵。這些信號(hào)通路包括生長(zhǎng)因子信號(hào)、低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子信號(hào)、代謝物及中間體信號(hào)、免疫反應(yīng)信號(hào)，細(xì)胞增殖和分化等，該過(guò)程及相互作用也十分復(fù)雜。

6.3 木霉菌抗性應(yīng)用的未來(lái)遠(yuǎn)景

如今木霉等拮抗菌是生物防治中重要且熱門(mén)發(fā)展方向。拮抗菌通過(guò)與植物互作誘導(dǎo)植物體對(duì)病原菌的抗性，有些機(jī)制并未明確，在實(shí)際應(yīng)用中還比較缺乏。木霉菌通過(guò)與植物互作，直接刺激植物使其產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)，例如增加PAL、POD的活性以增強(qiáng)對(duì)病原菌的抗性；也有研究表明，木霉菌和其他拮抗菌之間的相互拮抗作用也有利于增加植物對(duì)病原菌的免疫。未來(lái)若研究分析出彎孢霉菌和某木霉間的拮抗作用，并適量應(yīng)用于作物，甚至有可能廣泛推廣應(yīng)用該生物防治，但也有可能產(chǎn)生新的木霉危害，需要控制使用，同時(shí)也避免化學(xué)防治等造成的污染問(wèn)題。