莫子晴，蔡皓，段煜，裴科，張雅婷，鈕敏潔，王夢晴，于慧

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030024)

抑郁癥是目前全球發(fā)病率高居首位的精神類疾病，其特征是快感低下、情緒低落以及自殺率高。據(jù)保守估計(jì)，全球抑郁癥患者至少已經(jīng)有3.5億[1]。四逆散最早記載于張仲景所著《傷寒論》，由柴胡、白芍、枳實(shí)、炙甘草4味藥組成，具有疏肝解郁、和解表里之功效，為具有調(diào)節(jié)情志作用的經(jīng)典名方，同時(shí)也是中醫(yī)臨床治療抑郁的基礎(chǔ)方。醋是中藥炮制的一種重要輔料，具有引藥入經(jīng)、破血快、散瘀消腫的作用，被廣泛應(yīng)用于疏肝解郁、散瘀止痛藥物的炮制?！侗静菝审堋酚小坝么鬃⒏谓?jīng)且資住痛”的記載[2]。柴胡和白芍醋炙后，均能增強(qiáng)其疏肝解郁的作用[3-4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柴胡和白芍作為四逆散的君藥和臣藥，醋炙后組方的四逆散在抗抑郁的作用方面得到了顯著提升。課題組前期還采用了UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對四逆散及柴胡和白芍醋炙后組方的四逆散的化學(xué)成分進(jìn)行了分析比較，并結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析手段篩選出了12種成分為四逆散醋炙增效的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。然而，四逆散對于抑郁癥的治療機(jī)制以及炮制增效的科學(xué)內(nèi)涵仍有待進(jìn)一步的深入研究。

糞便代謝物為腸道菌和宿主的共同代謝物，是能整體反映疾病條件下代謝狀況的重要研究對象[5]。本課題組開展的該項(xiàng)研究具有雙重的目的。首先，我們建立一種廣泛使用的慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)抑郁模型，探索抑郁大鼠糞便代謝組學(xué)的變化，對前人的研究進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充。其次，我們運(yùn)用1H-NMR技術(shù)從代謝角度探討柴胡和白芍醋炙前后的組方對四逆散抗抑郁作用的影響，從糞便代謝組學(xué)的角度探究中藥復(fù)方炮制增效內(nèi)涵的研究報(bào)道，可為進(jìn)一步深入研究抑郁癥、中藥炮制、腸道菌群三者的關(guān)聯(lián)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量200～250 g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2018-0004。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：ACU190801。

1.2 藥物與試劑

四逆散由柴胡、白芍、枳實(shí)和炙甘草4味飲片按1∶1∶1∶1的比例組成。柴胡飲片(批號：20180601)、白芍飲片(批號：20180611)、枳實(shí)飲片(批號：20190129)和炙甘草飲片(批號：20180713)均購自安徽銅陵禾田中藥飲片有限公司,每味飲片經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為正品。醋柴胡飲片及醋白芍飲片均由上述所購批號的柴胡飲片和白芍飲片按《中國藥典》醋炙法中記載的炮制方法進(jìn)行規(guī)范炮制。鹽酸氟西汀片(批號：20190506)購自常州四藥制藥有限公司，氘水(D2O，批號：MKBP6567V)購自美國Sigma公司，4-二甲基-4-硅代戊磺酸鈉(DSS，批號：269913)購自美國Sigma公司。

1.3 儀器

Bruker AVANCE Ⅲ 500 MHz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀(YB-1B，德國Bruker公司)，Allegrax-22R多功能離心機(jī)(美國Beckman coulter公司)，BSA224S-CW萬分之一天平(德國Sartorius公司)，Quintix35-1CN十萬分之一天平(德國Sartorius公司)，KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 中藥提取液的制備

取柴胡、白芍、枳實(shí)和炙甘草等量，加適量蒸餾水加熱回流提取1 h，過濾得濾液，并對濾渣以相同煎煮及過濾步驟進(jìn)行操作。合并2次濾液并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，濃縮得合生藥量為0.96 g/mL四逆散提取液，取醋柴胡、醋白芍、枳實(shí)和炙甘草等量，同法制得醋炙品組方四逆散提取液。

2.2 CUMS模型的制備

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為5組(n=8)：空白組、模型組、四逆散組、醋炙品組方四逆散組和陽性藥組。四逆散組及醋炙品組方四逆散組分別給予相應(yīng)的中藥復(fù)方提取液(9.6 g/kg)，空白組及模型組均給予等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%NaCl溶液。造模開始后灌胃給藥，所有藥物均在應(yīng)激暴露前1 h給藥。將氟西汀(0.1 mg/kg)作為陽性藥組。除空白組外，對所有大鼠進(jìn)行CUMS程序5周。刺激方式包括噪音刺激45 min，夾尾5 min，震蕩5 min，禁食24 h，禁水24 h，4 ℃冰水游泳5 min，45°傾斜24 h，擁擠45 min，空瓶恐懼30 min[6]。

2.3 糞便樣本的收集

造模結(jié)束后，將各組糞便樣本置于離心管保存在-80 ℃冰箱中，待測。

2.4 1H-NMR代謝組學(xué)的研究

2.4.1 糞便樣本處理 參考文獻(xiàn)方法[7]，100 mg糞便加入600 μL磷酸緩沖液(0.2 mol/L Na2HPO4-0.2 mol/L NaH2PO4，pH=7.4)和200 μL D2O(含有0.05%DSS)，將勻漿液室溫超聲30 min后離心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，取上清液500 μL至5 mm NMR核磁管中，震蕩混勻。DSS作為內(nèi)標(biāo)參比(δ0.00)，D2O用于鎖定信號。

2.4.21H-NMR測定條件 實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃，糞便樣本采用預(yù)飽和的1D NOESY脈沖序列壓制水峰，弛豫時(shí)間為2 s，采樣時(shí)間為1.64 s，譜寬為10 kHz，采集次數(shù)為128次。

2.4.31H-NMR圖譜處理及統(tǒng)計(jì)分析 使用MestReNova軟件(V12.0)對核磁譜圖進(jìn)行處理，線寬因子(LB)設(shè)為1 Hz，隨后校正譜圖的相位和基線，最后以內(nèi)標(biāo)DSS(δ0.00)進(jìn)行定標(biāo)。譜圖處理后進(jìn)行分段積分以應(yīng)用于多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，在δ0.5～9.5區(qū)按δ0.004等間隔分段積分，切除水峰(δ4.67～4.97)，積分?jǐn)?shù)據(jù)使用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化。采用SIMCA-P 13.0軟件將1H-NMR采集處理的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行中心化和規(guī)格化后,進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

3 結(jié)果

3.1 柴胡和白芍醋炙前后組方四逆散對CUMS抑郁大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響

測試結(jié)果見表1。大鼠體質(zhì)量、蔗糖偏好率以及強(qiáng)迫游泳時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析顯示各組之間存在顯著差異。與空白組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)，蔗糖偏好率顯著降低(P<0.01)，強(qiáng)迫游泳時(shí)間有明顯延長(P<0.01)，說明CUMS大鼠模型復(fù)制成功。與模型組大鼠比較，服用四逆散、醋炙品組方四逆散以及陽性藥的大鼠均在行為學(xué)指標(biāo)上有更好的表現(xiàn)，表明四逆散和醋炙品組方四逆散均可緩解CUMS誘發(fā)的抑郁癥狀。而與四逆散比較，醋炙品組方四逆散抗抑郁的效果更佳。

表1 大鼠行為學(xué)指標(biāo)結(jié)果

3.2 1H-NMR圖譜的指認(rèn)與分析

結(jié)合代謝物的化學(xué)位移值、峰的裂分及偶合常數(shù)、參考文獻(xiàn)[8-10]和HMDB(http://www.hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫對本實(shí)驗(yàn)所得1H-NMR圖譜進(jìn)行解析，共認(rèn)定了32種化合物,見圖1和表2。

表2 內(nèi)標(biāo)及大鼠糞便1H-NMR數(shù)據(jù)歸屬

C.空白組;M.模型組;SNS.四逆散組;VPSNS.醋炙品組方四逆散組;FLU.陽性藥組

3.3 抑郁模型大鼠機(jī)體代謝表型的變化

采用OPLS-DA研究空白組和模型組的代謝圖譜差異,見圖2?？瞻捉M和模型組的糞便樣品在PC1維上可完全區(qū)分，說明CUMS抑郁模型大鼠機(jī)體的生理及代謝狀況已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變。其模型質(zhì)量參數(shù)：具有1個(gè)主成分和4個(gè)正交成分，R2X=0.706，R2Y=1，Q2=0.906。上述參數(shù)說明模型比較可靠。

注：C.空白組;M.模型組

3.4 與抑郁癥相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物識別

采用OPLS-DA相關(guān)系數(shù)對比篩選差異代謝物。正號和負(fù)號分別表示濃度的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)?；谠赑=0.05水平上的差異顯著性，相關(guān)系數(shù)r>0.5用作統(tǒng)計(jì)顯著性的臨界值[11]。在糞便樣本中篩選得到17種包括苯丙氨酸、酪氨酸、尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、甘氨酸等在內(nèi)的具有顯著差異的代謝物。見表3。

表3 空白組與模型組存在顯著性差異的代謝物及其相關(guān)系數(shù)

3.5 四逆散及醋炙品組方四逆散對抑郁大鼠糞便代謝紊亂的干預(yù)作用及比較

如圖3～4所示，給藥處理的樣本點(diǎn)與模型組樣本點(diǎn)可以完全分離，說明四逆散、醋炙品組方四逆散以及陽性藥氟西汀在發(fā)揮抗抑郁療效的同時(shí)也實(shí)際上改變了抑郁大鼠的代謝狀況，并能對抑郁大鼠的糞便代謝紊亂產(chǎn)生有效干預(yù)。其中四逆散干預(yù)的大鼠與醋炙品組方四逆散干預(yù)的大鼠具有不同的代謝特征。那么，柴胡和白芍醋炙后組方四逆散具有更佳的抗抑郁療效的炮制內(nèi)涵是否也隱藏其中呢？四逆散組和醋炙品組方四逆散組的OPLS-DA得分圖與排序驗(yàn)證圖以及相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖如圖5所示。其模型質(zhì)量參數(shù)具有1個(gè)主成分和1個(gè)正交成分，R2X=0.646，R2Y=1，Q2=0.977。所有數(shù)學(xué)模型的Q2均較高，說明所有模型均比較可靠。OPLS-DA的相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖已直觀地展示出兩組之間存在顯著性差異的代謝物。根據(jù)結(jié)果，一共篩選出乳酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、甲酸、乙酸、蘇氨酸6種潛在的差異代謝標(biāo)志物，見表4、圖6。

注：M.模型組;SNS.四逆散組

注：M.模型組;VPSNS.醋炙品組方四逆散組

注：SNS.四逆散組;VPSNS.醋炙品組方四逆散組

表4 四逆散組和醋炙品組方四逆散組存在顯著性差異的代謝物及其相關(guān)系數(shù)

C.空白組;M.模型組;SNS.四逆散組;VPSNS.醋炙品組方四逆散組;FLU.陽性藥組

3.6 代謝通路歸屬分析

將上述篩選得到的差異代謝物導(dǎo)入到Metabo Analyst4.0數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行代謝通路分析。與空白組大鼠比較，抑郁大鼠共有包括苯丙氨酸代謝、酪氨酸以及色氨酸生物合成代謝、丙氨酸和天門冬氨酸以及谷氨酸代謝、氮代謝、谷胱甘肽代謝、卟啉和葉綠素代謝等28條通路發(fā)生變化。與給予四逆散的抑郁大鼠比較，給予醋炙品組方四逆散的抑郁大鼠共有包括丙酮酸代謝、糖酵解和糖質(zhì)新生代謝、甲烷代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、甘氨酸和絲氨酸以及蘇氨酸代謝、氨酰合成代謝的6條通路發(fā)生變化。2項(xiàng)代謝通路的分析結(jié)果均以氣泡圖的形式進(jìn)行展示，見圖7。

圖7 與CUMS抑郁模型大鼠相關(guān)的代謝通路以及與四逆散醋炙增效相關(guān)的代謝通路

4 討論

現(xiàn)代藥理和臨床研究均已證明了四逆散對抑郁癥的治療作用[12-13]，然而對于復(fù)方中的單味藥是以生品還是炮制品配伍組方仍缺乏足夠的科學(xué)解釋，這直接導(dǎo)致臨床復(fù)方中炮制品使用的混亂。因此，開展中藥炮制配伍組方機(jī)制的研究對中醫(yī)臨床合理用藥具有十分重要的意義。本課題組前期已在化學(xué)物質(zhì)、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)以及分子機(jī)制等方面進(jìn)行了探索，本次實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)是從糞便代謝組學(xué)的角度討論醋炙的增效內(nèi)涵。

苯丙氨酸和酪氨酸都是動(dòng)物以及人體內(nèi)不能自行合成的必需氨基酸，也是與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分泌緊密相關(guān)的2種物質(zhì)。苯丙氨酸能轉(zhuǎn)化為酪氨酸，而酪氨酸代謝與抑郁癥的病發(fā)和進(jìn)展有著密切的關(guān)聯(lián)[14]。酪氨酸是多巴胺(DA)合成的前體，而DA是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，具有產(chǎn)生愉悅感以及調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)多項(xiàng)生理功能的作用[15]。DA是合成去甲腎上腺素(NE)的前體。NE與神經(jīng)活動(dòng)、行為以及睡眠節(jié)律等調(diào)節(jié)均有關(guān)系[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，模型組大鼠體內(nèi)的苯丙氨酸和酪氨酸水平較低，這也從代謝的角度部分解釋了抑郁大鼠體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平往往偏低的情況，與前人關(guān)于抑郁癥代謝組學(xué)的相關(guān)研究結(jié)果[17]一致，再次驗(yàn)證了抑郁癥與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的密切聯(lián)系。

尿嘧啶是抑郁癥研究領(lǐng)域文獻(xiàn)報(bào)道較少的代謝物。研究顯示尿嘧啶能明顯抑制單胺氧化酶(MAO)的活性，而MAO抑制劑是重要的抗抑郁藥物之一[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其他代謝組學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論一致[17]，再次提示了尿嘧啶與抑郁癥發(fā)病的潛在聯(lián)系。

乳酸是丙酮酸代謝通路中的重要代謝物，也是機(jī)體內(nèi)糖酵解的最終產(chǎn)物[19]。研究表明，血漿乳酸含量的變化與細(xì)胞厭氧呼吸相關(guān)[20]，這是一種能量代謝過程，提示抑郁大鼠能量代謝紊亂。α-葡萄糖和β-葡萄糖皆屬于糖代謝過程中的重要物質(zhì)。葡萄糖的生理功能主要是為機(jī)體提供能量來源，通過糖異生途徑合成，其主要代謝途徑是糖酵解和糖異生。重度抑郁癥患者患2型糖尿病的幾率明顯上升，而抑郁情緒影響體內(nèi)糖代謝，使機(jī)體對糖代謝調(diào)節(jié)能力降低[21]。研究表明抑郁癥患者存在體內(nèi)能量代謝紊亂現(xiàn)象[22]。此外，α-葡萄糖還是腸道產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)有益菌的主要來源[11]。與四逆散組大鼠比較，醋炙品組方四逆散組大鼠糞便乳酸以及葡萄糖的含量波動(dòng)明顯，說明柴胡和白芍醋炙后組方能改善四逆散對于抑郁狀態(tài)下大鼠能量代謝和相關(guān)物質(zhì)代謝紊亂。

SCFA也稱揮發(fā)性脂肪酸，主要是由腸道益生菌發(fā)酵膳食纖維和部分氨基酸及蛋白質(zhì)的終產(chǎn)物。SCFA對機(jī)體有著極其重要的意義，具有為細(xì)胞提供能量、抑制致病菌、抑制部分細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體平衡代謝等作用[23]。同時(shí)，SCFA還與腸道菌群的代謝高度相關(guān)，這些SCFA在人體體液中的含量能反映人體內(nèi)腸道菌群的代謝情況[24]。乙酸是SCFA中含量最為豐富的品種之一，腸腔內(nèi)產(chǎn)生的乙酸有一部分被運(yùn)輸至肝臟參與合成長鏈脂肪酸和谷氨酸等[25]。針對實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們從腸道菌群代謝的角度初步推測：模型組大鼠與空白組大鼠的糞便代謝差異物有乙酸，提示抑郁癥可能會(huì)影響乙酸代謝進(jìn)而對腸道菌群功能及其代謝產(chǎn)生影響。與四逆散組大鼠比較，醋炙品組方四逆散組大鼠的糞便中乙酸含量變化顯著，提示柴胡和白芍醋炙后組方的四逆散在腸道菌群功能及其代謝方面參與調(diào)控的可能性。但這是內(nèi)源性變化還是外源性變化所引起，抑或是綜合導(dǎo)致的結(jié)果？本課題組將在今后采用更合適的分析檢測手段開展進(jìn)一步的相關(guān)研究。

無論是乳酸，還是α-葡萄糖、β-葡萄糖、SCFA，這些差異代謝物均提示了醋炙與抑郁癥以及能量代謝穩(wěn)態(tài)之間的相互聯(lián)系。代謝組學(xué)的優(yōu)勢在于可以提供有關(guān)微生物功能最終產(chǎn)物的信息，而糞便樣品的代謝組學(xué)可以為腸道微生物的代謝提供更加清晰的線索。本課題組目前正在進(jìn)行的醋炙對腸道菌群在抑郁癥領(lǐng)域影響的研究也將進(jìn)一步解釋這方面的疑問。

有研究發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸在難治性抑郁患者血清中有明顯的變化[26]。蘇氨酸是人體必需氨基酸，同時(shí)也是動(dòng)物的第二或第三限制性氨基酸，能促進(jìn)免疫球蛋白和淋巴細(xì)胞的合成，其含量降低會(huì)抑制免疫球蛋白和T淋巴細(xì)胞生成，進(jìn)而影響免疫功能[27]。蘇氨酸也是生酮氨基酸，與氨基酸代謝障礙之間具有密切的聯(lián)系，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，氨基酸參與的代謝與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但與抑郁癥相關(guān)的報(bào)道主要集中在與色氨酸的相關(guān)性上[28]，抑郁癥與其他氨基酸的內(nèi)在聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)蘇氨酸是甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝的重要一環(huán)，該條代謝途徑可為三羧酸循環(huán)所需能量提供重要的代謝前體[29]。這與前面關(guān)于柴胡和白芍醋炙后組方也許能改善四逆散對于抑郁狀態(tài)下的能量代謝和相關(guān)物質(zhì)代謝紊亂調(diào)控的結(jié)論相一致。

綜上所述，與四逆散原方比較，柴胡和白芍醋炙后組方的四逆散能協(xié)同調(diào)控包括丙酮酸代謝、糖酵解與糖質(zhì)新生代謝、甲烷代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝、氨酰合成代謝在內(nèi)的6條代謝通路。結(jié)合篩選出的與醋炙增效相關(guān)的6種潛在代謝標(biāo)志物，我們可以綜合分析得出：醋炙品組方四逆散在抗抑郁方面的增效作用可能與能量代謝、氨基酸代謝、免疫調(diào)控以及腸道菌群有關(guān)。本研究從內(nèi)源性代謝物的角度為探索中藥炮制醋炙增效的作用機(jī)制提供了一定的依據(jù)，更進(jìn)一步的內(nèi)在聯(lián)系以及相關(guān)代謝通路的驗(yàn)證仍需更加深入的考察。