仝萌，于翔羽，李淑坤，胡子奇，汪晶，舒孌

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210028)

姜黃色素是一種多酚類(lèi)化合物，其分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)雙鍵，以及酚羥基、羰基等活性基團(tuán)，在抗菌[1]、抗氧化[2-3]、抗病毒[4]、免疫調(diào)節(jié)[5-6]、抗炎[7]等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。盡管目前對(duì)其療效頗具爭(zhēng)議，但它仍是世界上銷(xiāo)量最大的七大天然食用色素之一，是被WHO和FDA公認(rèn)的天然食品添加劑[8]。姜黃色素是一種具有代表性的多成分中藥組分，其中姜黃素、去甲氧基姜黃素2種單體成分占姜黃色素含量90%以上，分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。姜黃色素由于幾乎不溶于水，穩(wěn)定性較差，口服生物利用度較低，應(yīng)用受到限制。因此，眾多學(xué)者將其作為模型藥物，利用納米制劑技術(shù)來(lái)改善其理化性質(zhì)，寄以提高其口服生物利用度[9-10]。

A.姜黃素；B.去甲氧基姜黃素

微粉化技術(shù)是采用機(jī)械或者流體動(dòng)力等將物料粉碎成微米級(jí)甚至納米級(jí)粉體的過(guò)程，具有加快藥物溶出、提高生物利用度等優(yōu)勢(shì)。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了深入的研究[11-13]，但大多局限于中藥單體活性成分，缺乏對(duì)于難溶性中藥組分的深入研究。本文在課題組先前研究基礎(chǔ)上[14]，擬采用微粉化技術(shù)對(duì)姜黃色素進(jìn)行處理，獲得不同粒徑的微粉，并對(duì)其微觀形態(tài)、粉體學(xué)性質(zhì)、體外溶出度及穩(wěn)定性進(jìn)行考察，以期評(píng)估微粉化技術(shù)對(duì)于難溶性中藥組分的應(yīng)用前景和進(jìn)一步制劑成型的研究意義。

1 材料

激光粒度分析儀LS13320/ULM2(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；200F3型示差掃描量熱儀(德國(guó)NETZSCH科技有限公司)；ZEISS-SUPRA40型掃描電鏡(德國(guó)蔡司公司)；Bruker-D8型X-射線(xiàn)衍射儀(德國(guó)布魯克公司)；XQM-KL-8低溫行星球磨機(jī)(長(zhǎng)沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司)；XP-6型百萬(wàn)分之一精密天平(瑞士梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司)；ZRS-8GD型智能溶出試驗(yàn)儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；姜黃色素(批號(hào)：JZ18042917，南京景竹生物科技有限公司)；姜黃素對(duì)照品(批號(hào)：A1917105，純度>98%，阿拉丁試劑)；去甲氧基姜黃素對(duì)照品(批號(hào)：JZ18032202，純度>98%，南京景竹生物科技有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)天地公司)，水為超純水(美國(guó)Milli-Q公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃色素微粉的制備

稱(chēng)取一定量干燥的姜黃色素粉末，加入低溫行星式球磨機(jī)中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為200 r/min，溫度為5 ℃，大球∶中球∶小球的質(zhì)量比為2∶5∶3，研磨時(shí)間分別為60、90、120 min，分別研磨得到姜黃色素微粉1、微粉2、微粉3，置于干燥器內(nèi)備用。

2.2 粒徑與粒度分布

分別取適量的姜黃色素原粉和微粉于專(zhuān)用塑料量杯中，放置于激光粒度分析儀內(nèi)，開(kāi)啟真空狀態(tài)，測(cè)定其粒徑及粒徑分布。粒徑分布見(jiàn)表1，結(jié)果表明，姜黃色素原粉平均粒徑為57.20 μm，通過(guò)微粉化后，姜黃色素粉末粒徑明顯變小，且有部分粒徑處于納米級(jí)別。

表1 粒徑分布測(cè)定結(jié)果

2.3 休止角和卡式指數(shù)

采用固定圓錐底法測(cè)定姜黃色素原粉及微粉的休止角，取一定量的待測(cè)粉末，在固定的振幅下使粉末通過(guò)漏斗均勻流出，至最高的圓錐體位置，測(cè)量圓錐體斜面與平面的夾角，重復(fù)3次，取平均值，即為待測(cè)粉末的休止角。給予一定強(qiáng)度的振動(dòng)，使粉末均勻流入10 mL的量筒，刮去杯子上面多余的粉末，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算松密度(松密度=質(zhì)量/10)。同時(shí)對(duì)杯子給予一定強(qiáng)度的撞擊(180次，3 min)，刮去多余的粉末，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算輕敲密度(輕敲密度=質(zhì)量/10)。計(jì)算卡式指數(shù)[卡式指數(shù)=(1-松密度/輕敲密度)×100%][14]?？ㄊ街笖?shù)反映粉末的壓縮性和流動(dòng)性?？ㄊ街笖?shù)大，粉末通?？蓧盒院?，但是流動(dòng)性差；卡式指數(shù)小，粉末流動(dòng)性好，但可壓性差。休止角及卡式指數(shù)的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 姜黃色素不同粉末的休止角和卡式指數(shù)

結(jié)果表明：姜黃色素微粉的休止角隨粒徑的減小略有增大，與原粉相比，流動(dòng)性變差。隨著微粉粒徑減小，卡式指數(shù)明顯增大，表明粉末的流動(dòng)性明顯變差。這可能是由于姜黃色素經(jīng)微粉化處理后，粒徑變小，黏附性增強(qiáng)，且研究過(guò)程中出現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，所以流動(dòng)性較差，同時(shí)松密度和輕敲密度先增大后減小，這可能一方面和粉末的不均勻性有關(guān)，另一方面，微粉化處理后，隨著微粉的增加，出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，同時(shí)也存在微粒間的排斥力，所以會(huì)出現(xiàn)松密度和輕敲密度上升的趨勢(shì)。

2.4 吸濕性考察

將底部盛有氯化鈉過(guò)飽和溶液的玻璃干燥器放入恒溫培養(yǎng)箱中(25 ℃)恒溫24 h，此時(shí)干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度為75%。根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》藥物引濕性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，精密稱(chēng)定干燥至恒質(zhì)量的4種姜黃色素粉末適量，放置于恒質(zhì)量的稱(chēng)量瓶?jī)?nèi)，準(zhǔn)確稱(chēng)質(zhì)量后置于干燥器中，25 ℃恒溫保存，于2、4、6、8、24、48 h定時(shí)稱(chēng)量。吸濕率=(吸濕后質(zhì)量-吸濕前質(zhì)量)/吸濕前質(zhì)量×100%，結(jié)果見(jiàn)圖2。由于姜黃色素不溶于水，其吸濕性低，通過(guò)微粉化處理后的3種粉末，其吸濕增質(zhì)量均小于1%，與原粉相比無(wú)顯著區(qū)別。

圖2 姜黃色素粉末吸濕速率曲線(xiàn)

2.5 姜黃色素中指標(biāo)性成分含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性考察 采用Waters X-Bridge色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.3%冰醋酸(55∶45)等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。見(jiàn)圖3。

A

2.5.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取去甲氧基姜黃素對(duì)照品3.250 mg，姜黃素對(duì)照品7.195 mg置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到130 μg/mL去甲氧基姜黃素，287.8 μg/mL姜黃素的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。用甲醇稀釋成7個(gè)不同的質(zhì)量濃度。按照上述色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制去甲氧基姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=79 301X-45 591，R2=0.999 9，線(xiàn)性范圍為0.650 0～130.0 μg/mL；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=71 137X+66 371,R2=0.999 7，線(xiàn)性范圍為1.439～287.8 μg/mL，結(jié)果表明線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，去甲氧基姜黃素及姜黃素峰面積的RSD分別為0.14%，0.24%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算姜黃素峰和去甲氧基姜黃素峰面積的RSD值。結(jié)果表明去甲基姜黃素及姜黃素在24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為0.51%，0.66%。

2.6 微觀結(jié)構(gòu)研究

2.6.1 電子掃描顯微鏡(SEM) 采用噴金法觀察表面結(jié)構(gòu)。將4種姜黃色素粉末分別放置于玻璃皿內(nèi)，離子濺射后用SEM觀察樣品表面結(jié)構(gòu)，加速電壓為25.0 kV，放大2 000倍，結(jié)果見(jiàn)圖4。

注：A.原粉；B.微粉1；C.微粉2；D.微粉3

結(jié)果表明：姜黃色素原粉中多為大塊顆粒狀物質(zhì)，通過(guò)不同研磨工藝后，粉體的粒徑逐漸減小，與粒徑測(cè)定的結(jié)果一致，微粉2和微粉3中微粒明顯增多，在微粉2和微粉3中仍出現(xiàn)一部分大顆粒，一方面可能是研磨不均勻，導(dǎo)致存在少量的大塊顆粒，另一方面更多的可能是由于微粉粉體的表面積變大，表面自由能增加，使得粉末相互吸引，產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象。

2.6.2 差示掃描量熱法(DSC) 測(cè)試條件為鋁坩堝；載氣為氮?dú)?；升溫速?0 ℃/min；升溫范圍30～250 ℃；分別對(duì)4種粉末進(jìn)行DSC分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

A.原粉；B.微粉1；C.微粉2；D.微粉3

由圖5可見(jiàn)，4種姜黃色素粉末的DSC曲線(xiàn)峰朝下且較尖銳，說(shuō)明在轉(zhuǎn)態(tài)時(shí)放熱明顯，原粉在178 ℃左右有一明顯放熱峰，隨著粒徑減小，粉末熔點(diǎn)略微降低，微粉3的熔點(diǎn)在176 ℃，表明4種粉末熔點(diǎn)基本一致，微粉化未引起姜黃色素熔點(diǎn)的明顯變化，經(jīng)微粉化處理的3種粉末，其放熱峰值明顯比原粉高，表明姜黃色素粉末粒徑越小，DSC的放熱峰面積越大，推測(cè)可能是隨著粒徑減小，粉末的堆積度增大，導(dǎo)熱性能提升。

2.6.3 X-射線(xiàn)粉末衍射法(XRD) 測(cè)試條件為Cu靶(40 kV,40 mV)；步進(jìn)掃描0.02°/步；掃描范圍5°～90°；掃描速度4°/min。XRD結(jié)果見(jiàn)圖6。

A.原粉；B.微粉1；C.微粉2；D.微粉3

姜黃色素原粉在15°、17°、23°、25°、27°有較強(qiáng)吸收峰，隨著粒徑的減小，不同粒徑微粉在上述吸收段的峰值明顯減弱，推測(cè)可能是由于粉末粒徑的減少，導(dǎo)致細(xì)小的晶粒之間容易由于弱的相互作用力結(jié)合在一起，導(dǎo)致晶粒之間發(fā)生團(tuán)聚，影響了晶面取向的隨機(jī)性，導(dǎo)致吸收峰降低。

2.7 體外溶出度考察

溶出度測(cè)定方法按照《中國(guó)藥典》2015版溶出度測(cè)定第二法槳法，分別稱(chēng)取一定量的4種不同粒徑的粉末，以含0.3%吐溫80的pH1.2的鹽酸溶液和含0.3%吐溫80的pH6.8的磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度(37±0.5)℃，分別于5、10、15、30、45、60、90 min取樣2 mL(同時(shí)補(bǔ)加同溫度等量溶出介質(zhì))，以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液10 μL按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度，并換算成累計(jì)溶出率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累計(jì)溶出率為縱坐標(biāo)作溶出曲線(xiàn)圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 姜黃色素在不同pH溶出介質(zhì)中的溶出曲線(xiàn)(n=3)

由圖7可見(jiàn)，在含0.3%吐溫80的pH1.2鹽酸溶液中，原粉在5 min時(shí)，去甲氧基姜黃素、姜黃素溶出度分別為8.98%、3.46%；90 min內(nèi)累計(jì)溶出率分別為40.13%、34.43%。在微粉3中，5 min時(shí)去甲氧基姜黃素、姜黃素的溶出度分別為19.97%、20.11%；90 min內(nèi)累計(jì)溶出率分別為72.67%、77.15%。在含0.3%吐溫的pH6.8的磷酸鹽緩沖液中，原粉在5 min時(shí)，去甲氧基姜黃素、姜黃素溶出度分別為8.8%、3.22%；90 min內(nèi)累計(jì)溶出率分別為38.06%、30.29%。而在微粉3中，5 min時(shí)去甲氧基姜黃素、姜黃素溶出率分別達(dá)20.46%、19.22%，90 min內(nèi)累計(jì)溶出率分別為77.55%、76.75%。微粉1及微粉2亦呈現(xiàn)相類(lèi)似的趨勢(shì)，由此可見(jiàn)，隨著微粉粒徑的減小，溶出率明顯增大，溶出性能得到顯著提高。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將4種姜黃色素粉末放置于穩(wěn)定性箱中，置加速條件下考察其穩(wěn)定性(40 ℃，RH75%)，放置3個(gè)月后按“2.6”項(xiàng)下條件測(cè)定其體外溶出度，結(jié)果見(jiàn)圖8。與0月相比，姜黃色素中去甲氧基姜黃素和姜黃素溶出度均略有下降，可能是微粉粉末發(fā)生了部分團(tuán)聚，但是微粉3中2種成分累計(jì)溶出度仍能達(dá)到70%以上，表明姜黃素微粉可以保持一定的穩(wěn)定性，但是仍需要更優(yōu)的方式保持微粉的分散狀態(tài)。

圖8 加速3月后姜黃色素微粉在不同pH溶出介質(zhì)中的溶出曲線(xiàn)(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采取了球磨法制備姜黃色素微粉，對(duì)微粉化前后的姜黃色素的粉體學(xué)性質(zhì)和溶出度進(jìn)行了系統(tǒng)化的比較和分析。姜黃色素經(jīng)過(guò)微粉技術(shù)處理后，粒徑明顯減小，無(wú)定形物明顯增多，流動(dòng)性變差，壓縮度增加，體外溶出速率及累計(jì)溶出度明顯改善；但是粒徑并不是隨著球磨時(shí)間的增加而減少，物料的粒徑會(huì)經(jīng)歷“快速變化-緩慢變化-平衡區(qū)-逆粉碎區(qū)”4個(gè)階段變化[11-12]，其粒徑大小與球磨時(shí)間、球料比、球磨轉(zhuǎn)速、溫度等因素密切相關(guān)[15]，在進(jìn)行微粉化處理時(shí)，需結(jié)合中藥組分性質(zhì)與生產(chǎn)成本等因素進(jìn)行綜合考慮。同時(shí)，微粉化后體外溶出度的改變也會(huì)導(dǎo)致口服生物利用度的變化，甚至也可能會(huì)導(dǎo)致刺激性效應(yīng)的增大，因此，針對(duì)難溶性中藥組分的微粉化技術(shù)還需要更全面、更深入、更細(xì)致的研究。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，初步制備的姜黃色素微粉在長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，由于靜電、沉降等因素出現(xiàn)部分團(tuán)聚現(xiàn)象，導(dǎo)致體外溶出度改變；在微粉制備過(guò)程中，是否可以加入不同性質(zhì)的新型安全輔料，進(jìn)行共微粉化制備，從而改善粉體的性質(zhì)，本課題組就這一問(wèn)題已進(jìn)行初步探討，后續(xù)將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。